林瓏，史岸冰

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史岸冰，華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院教授，入選教育部“新世紀優(yōu)秀人才支持計劃”和國家“青年千人計劃”，2018年獲國家杰出青年科學(xué)基金資助。1996年畢業(yè)于南開大學(xué)，獲學(xué)士學(xué)位；2010年畢業(yè)于美國新澤西州立Rutgers大學(xué)分子遺傳學(xué)系，獲理學(xué)博士學(xué)位；2010~2012年在美國斯坦福大學(xué)生物學(xué)系接受博士后訓(xùn)練。2013年受聘于華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院，主要從事極性真核細胞中囊泡循環(huán)運輸調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分子基礎(chǔ)鑒定、分子調(diào)控過程及其時空特征解析等方面的研究。以模式生物秀麗線蟲為研究模型，應(yīng)用遺傳學(xué)、生物化學(xué)及細胞生物學(xué)方法，圍繞參與循環(huán)運輸?shù)闹匾蚝Y選、新基因分子功能機制、循環(huán)運輸相關(guān)磷酸肌醇代謝和細胞骨架動態(tài)等開展原創(chuàng)性研究，取得了一系列新進展。相關(guān)研究成果發(fā)表在、、、、和等國際著名細胞生物學(xué)期刊。

細胞內(nèi)吞循環(huán)運輸通路及其分子調(diào)控機制

林瓏，史岸冰

1. 華中科技大學(xué)，同濟醫(yī)學(xué)院，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，武漢 430030 2. 華中科技大學(xué)，腦研究所，武漢 430030 3. 華中科技大學(xué)，同濟醫(yī)學(xué)院，教育部神經(jīng)疾病重點實驗室，武漢 430030

內(nèi)吞運輸對于細胞與外界的物質(zhì)信息交流至關(guān)重要，其過程涉及對胞外大分子、膜磷脂、膜蛋白內(nèi)吞及分選的精細調(diào)控。在內(nèi)吞運輸系統(tǒng)中，循環(huán)運輸通路負責(zé)將膜蛋白和磷脂等送回質(zhì)膜，維持質(zhì)膜組成的穩(wěn)定，保障多種細胞生物學(xué)過程的正常進行，如營養(yǎng)吸收、細胞極性形成、細胞遷移、細胞分裂、突觸可塑性、免疫應(yīng)答、生長因子受體調(diào)控等。真核細胞中存在兩大類循環(huán)運輸通路，分別是網(wǎng)格蛋白依賴內(nèi)吞貨物蛋白的循環(huán)運輸(CDE貨物循環(huán))和非網(wǎng)格蛋白依賴內(nèi)吞貨物蛋白的循環(huán)運輸(CIE貨物循環(huán))。在體內(nèi)具有重要生理功能的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR和低密度脂蛋白受體LDLR是CDE循環(huán)的代表性貨物膜蛋白。近年，受CIE貨物循環(huán)調(diào)控的重功能膜蛋白被逐步發(fā)現(xiàn)，如IL2 受體α-亞基、主要組織相容性復(fù)合體MHC ClassⅠ、葡萄糖轉(zhuǎn)運因子GLUT4等。因而，對CIE貨物循環(huán)調(diào)控機制的研究越來越受到學(xué)界關(guān)注，相關(guān)研究既有重要的細胞生物學(xué)理論意義，也能為諸如Ⅱ型糖尿病和癌癥等重大疾病的診療策略提供科學(xué)依據(jù)和潛在治療線索。相較于CDE貨物循環(huán)，學(xué)界對CIE貨物循環(huán)的研究開展較晚，對其調(diào)控機制的了解也較少。為此，本文在介紹內(nèi)吞循環(huán)運輸通路類型及其特點的基礎(chǔ)上，著重關(guān)注CIE循環(huán)運輸調(diào)控的分子基礎(chǔ)，對CIE貨物循環(huán)研究領(lǐng)域的新進展、新研究體系進行了歸納和說明。

內(nèi)吞循環(huán)運輸；網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞；非網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞；循環(huán)內(nèi)體；Rab蛋白；Arf蛋白；磷酸肌醇；微絲；秀麗隱桿線蟲

細胞外大分子、配體/受體復(fù)合物、功能膜蛋白(如通道蛋白、細胞黏連蛋白)和膜脂等通過內(nèi)吞作用(endocytosis)內(nèi)化進入細胞，隨后在胞內(nèi)的囊泡狀或管狀膜性內(nèi)體結(jié)構(gòu)(endosome)中進行一系列分選(endosomal sorting)和定向運輸[1]。內(nèi)吞進入細胞的大分子經(jīng)過分選后，一部分經(jīng)由內(nèi)吞循環(huán)運輸(endo-cytic recycling)回到質(zhì)膜，一部分通過逆向運輸(ret-rograde transport)被運送到高爾基體，還有一部分經(jīng)由晚期內(nèi)體(late endosome)送到溶酶體進行降解[2]。在極性細胞中，分選后的貨物大分子還可以通過穿胞運輸(transcytosis)被運送到對側(cè)的質(zhì)膜和胞外區(qū)域，這對上皮細胞、內(nèi)皮細胞和血腦屏障的轉(zhuǎn)運具有重要的生理意義[3]。對于功能膜蛋白和膜脂，內(nèi)吞的持續(xù)發(fā)生會導(dǎo)致其細胞膜豐度降低，需要通過循環(huán)運輸將內(nèi)吞的大部分大分子送回質(zhì)膜進行物質(zhì)補償，以再次利用。內(nèi)吞和循環(huán)的平衡維持了質(zhì)膜物質(zhì)組成的穩(wěn)定，保障多種細胞過程的正常進行，例如營養(yǎng)攝取、細胞粘附和連接形成、細胞遷移、胞質(zhì)分裂、細胞極性和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。已知的維持血清葡萄糖水平的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白、控制胃酸分泌的質(zhì)子泵或控制細胞穩(wěn)態(tài)的鈉通道[4]、調(diào)節(jié)細胞-細胞與細胞-基質(zhì)相互作用的整合素和粘附分子[5]、參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的G-蛋白偶聯(lián)受體[6]和受體酪氨酸激酶[7]等都需要通過內(nèi)吞循環(huán)運輸?shù)恼{(diào)控來適應(yīng)細胞內(nèi)外環(huán)境的變化，以正確發(fā)揮功能。經(jīng)測算，細胞每小時內(nèi)吞的物質(zhì)總量大約為細胞表面物質(zhì)的1~5倍[8]，因此循環(huán)運輸必然以快速、穩(wěn)定的節(jié)奏運行，且受到精細的調(diào)控，以維持質(zhì)膜組成穩(wěn)態(tài)。

細胞的內(nèi)吞方式主要分為網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞和非網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞兩大類[9,10]。在網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞(clathrin-dependent endocytosis, CDE)中，貨物分子的胞質(zhì)端蛋白結(jié)構(gòu)域被配體蛋白(adaptor protein)特異性識別，在眾多輔助蛋白(accessory protein)的協(xié)同作用下，底物分子最終包裝進入配體蛋白和網(wǎng)格蛋白包被的內(nèi)吞小泡中。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor, TfR)和低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor, LDLR)是代表性的CDE貨物膜蛋白。網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞小泡的形成除了需要許多輔助蛋白，還需要微絲(F-actin)和發(fā)動蛋白(Dynamin)協(xié)同完成后續(xù)的膜泡縊裂[9,10]。與CDE不同，非網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞(clathrin-independent endocytosis, CIE)是多種不依賴網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞途徑的總稱，例如Dynamin依賴內(nèi)吞和ARF6依賴內(nèi)吞。雖然學(xué)界對CIE的了解很少，但CIE越來越受到細胞生物學(xué)家的關(guān)注。無論貨物分子內(nèi)吞進入細胞的方式如何，通常都運送到早期內(nèi)體(early endosome)進行分選，但分選的不同決定了后續(xù)運輸行程的不同(圖1)。本文重點關(guān)注細胞內(nèi)吞循環(huán)運輸通路，特別是CIE貨物膜蛋白(如白細胞介素2受體的α鏈[TAC])經(jīng)由循環(huán)內(nèi)體(recycling endosome)循環(huán)回質(zhì)膜的調(diào)控因子及其分子調(diào)控機制；同時，本文也將討論與循環(huán)運輸異常相關(guān)的一些代表性病理過程。對經(jīng)由多囊泡體(multivesicular bodies)和晚期內(nèi)體轉(zhuǎn)運至溶酶體的降解通路以及內(nèi)體和高爾基體之間的逆向運輸，推薦參考相關(guān)的專業(yè)綜述[11,12]。

圖1 內(nèi)吞運輸?shù)姆绞郊把h(huán)通路

通過不同內(nèi)吞方式進入細胞的貨物可以通過循環(huán)內(nèi)體返回質(zhì)膜，或者通過逆向運輸運送到高爾基體，或通過晚期內(nèi)體送至溶酶體降解。hTAC：CIE循環(huán)貨物膜蛋白；hTfR：CDE循環(huán)貨物膜蛋白；MIG-14：逆向運輸貨物膜蛋白。

1 網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞

在不同類型的內(nèi)吞方式中，對CDE的研究開展較早，其分子調(diào)控機制也相對比較清楚。CDE經(jīng)由網(wǎng)格蛋白有被小窩(clathrin-coated pit, CCP)和網(wǎng)格蛋白有被小泡(clathrin-coated vesicle, CCV)的形成得以發(fā)生。早期的研究發(fā)現(xiàn)CDE介導(dǎo)了低密度脂蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白的攝取[13,14]，二者分別與質(zhì)膜上相應(yīng)的LDLR和TfR結(jié)合，隨后被細胞識別并內(nèi)吞，這些受體在本文統(tǒng)稱為貨物膜蛋白。單個網(wǎng)格蛋白由三條重鏈和三條輕鏈形成三曲臂結(jié)構(gòu)(triskelion)，眾多網(wǎng)格蛋白相互重疊覆蓋形成多面籠狀結(jié)構(gòu)。網(wǎng)格蛋白并不直接與膜或跨膜蛋白結(jié)合，而是與各種配體蛋白/蛋白復(fù)合物(adaptor)結(jié)合。配體蛋白通常與跨膜蛋白胞內(nèi)域的短肽結(jié)合，有的與質(zhì)膜上豐富的磷酸肌醇PI(4,5)P2結(jié)合，還有一些配體蛋白可以與泛素結(jié)合[15]。AP2復(fù)合物是質(zhì)膜上參與CDE通路主要的配體，一般以異四聚體形式存在：μ2-adaptin、β-adaptin、α-adaptin和σ-adaptin。adaptins結(jié)合的貨物分子在胞質(zhì)區(qū)的蛋白質(zhì)識別序列一般為(D/E) XXXL (L/I/M)，也即異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。AP2復(fù)合物一邊連接質(zhì)膜雙分子層及貨物分子，一邊連接網(wǎng)格蛋白外殼，在貨物識別中發(fā)揮重要作用[16]。除AP2復(fù)合物之外，還有其他類型的配體蛋白，被統(tǒng)稱為CLASPs (clathrin-associated sorting proteins)[17]。如在線蟲()中發(fā)現(xiàn)的DAB-1，其蛋白序列中的PTB結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了與貨物蛋白和膜磷酸肌醇的結(jié)合，突變導(dǎo)致卵黃蛋白受體RME-2內(nèi)吞受損[18]。

CDE過程分為多個連續(xù)的階段：CCP起始形成、貨物分選、CCP成長和成熟、CCP縊裂和CCV釋放、CCV網(wǎng)格蛋白衣被脫落。具體而言，CCP裝配形成由AP2復(fù)合物引發(fā)，富含磷酸肌醇PI(4,5)P2的質(zhì)膜募集AP2復(fù)合物上膜[19]，AP2復(fù)合物隨之迅速招募網(wǎng)格蛋白[20]，其他輔助蛋白分子(如FCHo、EPS15)在CDE起始和穩(wěn)定新生CCP中發(fā)揮功能[21]。雖然體外實驗已經(jīng)證明網(wǎng)格蛋白可自發(fā)組裝成封閉的籠狀結(jié)構(gòu)[22]，但細胞中需要招募其他功能蛋白到新生CCP以促使質(zhì)膜出芽。例如，蛋白構(gòu)型呈弧形的BAR (Bin-Amphiphysin-Rvs)結(jié)構(gòu)域蛋白可以促進膜彎曲形變，是CCP發(fā)展所必需的調(diào)控因子[23]。隨著CCP的生成，AP2復(fù)合物和其他貨物特異性配體蛋白在細胞質(zhì)膜上協(xié)同招募和濃縮貨物。與此同時，網(wǎng)格蛋白的聚合進一步穩(wěn)定CCP的內(nèi)陷形態(tài)，促進CCV的成熟[24]。成熟的CCV從質(zhì)膜上縊裂和釋放依賴于發(fā)動蛋白Dynamin[25]。Dynamin通過脯氨酸富含結(jié)構(gòu)域(PRD)與endophilin和sorting nexin 9 (SNX9)的SRC同源3 (SH3)結(jié)構(gòu)域相互作用，進而被招募到CCP上。endophilin和SNX9屬于BAR結(jié)構(gòu)域蛋白，Dynamin屬于GTP酶蛋白。Dynamin在深度凹陷的CCV與質(zhì)膜相連處環(huán)繞組裝成頸環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通過GTP水解將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機械能驅(qū)動膜縊裂[25]。最終，在CCV與質(zhì)膜分離后，網(wǎng)格蛋白衣被脫落需要ATP酶、熱休克同源基因70(Hsc70)及其輔助因子auxilin的共同作用[26]。

2 非網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞

近年的研究發(fā)現(xiàn)一些營養(yǎng)受體、信號傳導(dǎo)受體、細胞粘附蛋白以及調(diào)節(jié)膜轉(zhuǎn)運蛋白的細胞內(nèi)化過程不同于常規(guī)的CDE內(nèi)吞，而是經(jīng)由CIE介導(dǎo)。正如其名，CIE內(nèi)吞小泡沒有明顯的網(wǎng)格蛋白外殼包被。CIE是多種不依賴網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞途徑的總稱，目前比較明確的幾種途徑如下：(1) Dynamin和RhoA依賴性途徑，在白細胞介素2受體胞吞作用中起作用[27]。最近的研究結(jié)果顯示此途徑還主導(dǎo)許多其他細胞因子受體及其成分的攝取[28]；(2)不依賴Dynamin的途徑，涉及Rho家族小G蛋白RAC1和CDC42。此途徑與依賴微絲(F-actin)的非網(wǎng)格蛋白依賴性運送載體(CLIC)的形成有關(guān)[29]。因其內(nèi)吞小泡融合形成富含磷酸肌醇的早期內(nèi)體(GEEC)[30]，故此途徑被稱為CLIC/GEEC通路；(3)Arf家族小G蛋白ARF6依賴性途徑。該途徑主導(dǎo)了組織相容性抗原I的攝取和循環(huán)[31]。ARF6激活磷酸肌醇激酶PI5K以產(chǎn)生重要的質(zhì)膜磷酸肌醇PI(4,5) P2，進而促進F-actin組裝以驅(qū)動內(nèi)吞作用[32]。在線蟲中，小G蛋白RAB-10可以通過募集CNT-1 (ARF-6/ARF6的GTP酶激活蛋白GAP)使ARF-6失活，進而降低分選內(nèi)體(sorting endosome)上PI(4,5) P2的水平，維持后續(xù)CIE貨物膜蛋白循環(huán)的正常進行[33]。

迄今為止，學(xué)界對CIE的研究和了解仍較為缺乏，CIE通路對細胞內(nèi)吞的貢獻程度和在細胞中的功能作用仍待進一步厘清。一些研究表明CIE是細胞大量攝取大分子的主要途徑[34]，但也有研究認為CDE主要承擔(dān)了細胞的攝取任務(wù)[35]。上述不同的研究結(jié)果可能與不同的研究體系或不同的細胞生理狀態(tài)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，相比于CDE通路，CIE通路可以作為感受器感受細胞所處的內(nèi)外部環(huán)境，更精細地調(diào)控細胞膜蛋白的局部和整體構(gòu)成。例如，表皮生長因子受體EGFR的內(nèi)吞作用在同一細胞中既可以通過CDE通路也可以通過CIE通路，CDE構(gòu)建EGFR信號通路最初需要的信號平臺，而當(dāng)處于高劑量EGF環(huán)境中，則CIE通路開始發(fā)揮作用，介導(dǎo)EGFR的降解[36]。

3 內(nèi)吞循環(huán)運輸?shù)闹匾{(diào)控因子：Rab小G蛋白

內(nèi)吞運輸過程受一系列Rab家族小G蛋白(Rab small GTPase)調(diào)控，在囊泡運動和囊泡栓系中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Rab家族小G蛋白是高度保守的小型單體GTP酶，也是Ras小G蛋白超家族中最大的亞家族。Rab通過向特定的膜室(membrane compartment)表面募集其特異的效應(yīng)因子(effector)來調(diào)控內(nèi)膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能[37]。類似其他Ras超家族小G蛋白的活性調(diào)控方式，Rab作為“分子開關(guān)”在GDP和GTP結(jié)合態(tài)之間循環(huán)。Rab自身具有較低的核苷酸交換和水解速率，需要其他蛋白因子來協(xié)助調(diào)節(jié)GTP-GDP循環(huán)，其中鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEFs)和GTP酶激活蛋白(GAPs)分別催化GDP到GTP的交換和GTP的水解反應(yīng)[38]。Rab的效應(yīng)因子通過選擇性結(jié)合Rab (GTP)活性形式，形成功能性的分子集合體，可以作為內(nèi)膜區(qū)室的標志物參與調(diào)控囊泡形成、靶向定位和融合[37]。這種以Rab為中心的蛋白復(fù)合物的GTP-GDP結(jié)合態(tài)往復(fù)轉(zhuǎn)換在空間和時間上受到精細調(diào)節(jié)，以實現(xiàn)內(nèi)膜識別的動態(tài)性和貨物運輸?shù)亩鄻有訹39]，因而Rab活性在時空上的精確調(diào)節(jié)對細胞內(nèi)吞運輸至關(guān)重要。

3.1 RAB-5/RAB5 (線蟲/哺乳動物細胞蛋白同源物)與早期內(nèi)體

RAB5是細胞早期內(nèi)吞運輸?shù)闹饕{(diào)控因子，并被認為是早期內(nèi)體的典型標志物[40]。RAB5結(jié)合GTP時，處于活性態(tài)，繼而招募一系列效應(yīng)因子到早期內(nèi)體上[41]。RAB5在內(nèi)吞運輸通路中的關(guān)鍵作用之一是促進膜融合，包括新生的內(nèi)吞囊泡與早期內(nèi)體的融合，以及早期內(nèi)體的相互融合(同型內(nèi)體融合)。與Rab家族的其他成員一樣，RAB5活性受使其激活的鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEFs)和使其失活的GTP酶激活蛋白(GAPs)控制，RAB5的GEF一般含有酵母Vps9結(jié)構(gòu)域[42]。在秀麗線蟲中，RAB-5對線蟲的存活和卵黃蛋白YP170::GFP的內(nèi)吞至關(guān)重要。TBC-2是線蟲中已知的唯一RAB-5-GAP蛋白(圖2)，而有三種基因編碼含有經(jīng)典Vps9結(jié)構(gòu)域的RAB-5-GEF蛋白[43]，其中兩個(RME-6和RABX-5)的功能是部分冗余的，敲除RME-6和RABX-5中的任何一個均不致死，而且不能導(dǎo)致所有的RAB-5從早期內(nèi)體膜上解離。只有同時敲除RME-6和RABX-5才會導(dǎo)致線蟲胚胎和幼蟲致死，并致使早期內(nèi)體膜上幾乎所有RAB-5明顯解離[44]。RME-6與網(wǎng)格蛋白的配體蛋白APA-2結(jié)合，主要定位于網(wǎng)格蛋白有被小窩處并在內(nèi)吞小泡上激活RAB-5[44]。與RME-6不同，RABX-5在早期內(nèi)體上激活RAB-5，促進早期內(nèi)體同型融合、早期內(nèi)體向晚期內(nèi)體的降解轉(zhuǎn)運以及內(nèi)吞循環(huán)運輸過程[45]。沿著降解通路，RAB-5標記的早期內(nèi)體成熟并轉(zhuǎn)化為RAB-7標記的晚期內(nèi)體，這一轉(zhuǎn)化需要SAND-1及其相關(guān)蛋白協(xié)作將早期內(nèi)體上的RABX-5移除[46]。近期針對線蟲中的另外一個Vps9結(jié)構(gòu)域蛋白RIN-1的研究發(fā)現(xiàn)，RIN-1作為Rac的效應(yīng)因子參與調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞遷移和軸突定向發(fā)育[47]。

針對RAB-5/RAB5效應(yīng)因子的研究顯示，線蟲中作用于融合過程的RAB-5效應(yīng)因子包括RABS-5 (Rabenosyn5)、RABS-5結(jié)合蛋白VPS-45和VPS-34。VPS34是PI3K磷酸肌醇激酶，負責(zé)在早期內(nèi)體上生成磷酸肌醇PI(3)P。在其他動物體系中的研究發(fā)現(xiàn)VPS34能夠與Beclin (線蟲BEC-1)和P150(線蟲VPS-15)形成復(fù)合物[48]。很多早期內(nèi)體外周膜蛋白都依賴與PI(3)P的結(jié)合得以募集到早期內(nèi)體上發(fā)揮功能效應(yīng)，例如影響同型內(nèi)體融合或是促進后續(xù)循環(huán)和降解過程[49]。脂質(zhì)磷酸酶MTM-6和MTM-9的底物是PI(3)P，-6或突變均會導(dǎo)致線蟲PI(3)P標記物2xFYVE::GFP的胞質(zhì)彌散分布和腔細胞內(nèi)吞缺陷[50,51]。突變致死表型可以被針對MTM-6的RNA干擾緩解，提示VPS-34和MTM-6可能在同一通路中行使相反的功能[52]。

3.2 RAB-10/RAB10與循環(huán)內(nèi)體

基因組序列分析顯示線蟲基因組編碼31個Rab和類Rab基因，其中RAB-10/RAB10是重要的循環(huán)運輸調(diào)控因子[53,54]。突變腸細胞中有大量空泡累積，其大小足以在解剖顯微鏡水平觀察[53]。這些空泡是基底側(cè)分選內(nèi)體累積并互相融合所致，空泡腔中積聚了來自體腔的液態(tài)內(nèi)吞物，例如肌肉細胞分泌的GFP和顯微注射到體腔中的BSA。此外，這些空泡被內(nèi)體標記物RAB-5和ARF-6所標記，并累積高水平的CIE循環(huán)貨物膜蛋白hTAC::GFP[53,55]，RAB-5標記的早期內(nèi)體也在突變腸細胞中積累[53]。RAB-10遺傳學(xué)功能位置位于循環(huán)調(diào)控因子Eps15同源結(jié)構(gòu)域蛋白(Eps15 homology domain protein) RME-1/EHD1的上游，RAB-10缺失會導(dǎo)致RME-1標記的基底側(cè)循環(huán)內(nèi)體的數(shù)量大大減少，并且失去其正常的管狀形態(tài)，呈現(xiàn)點狀分布[54]。RAB-10與早期內(nèi)體標志物RAB-5部分共定位，且似乎與RME-1標記的管狀循環(huán)內(nèi)體相鄰。線蟲腸細胞中這些RAB-10陽性內(nèi)體可能相當(dāng)于常見的循環(huán)內(nèi)體，它們也是RAB10在MDCK細胞中的主要定位區(qū)室[56]。循環(huán)內(nèi)體是一種貨物分子回收膜區(qū)室，用于接收和分選來自基底側(cè)和頂膜側(cè)的貨物分子，是極性上皮細胞的一種特化細胞器。線蟲中的研究結(jié)果表明RAB-10在基底側(cè)早期內(nèi)體至循環(huán)內(nèi)體運輸?shù)倪B接處發(fā)揮調(diào)控功能。突變并不影響高爾基體、晚期內(nèi)體或頂膜側(cè)循環(huán)內(nèi)體的形態(tài)或功能，表明RAB-10在基底側(cè)循環(huán)運輸過程中具有重要功能[53,54]。針對RAB-10功能機制的研究顯示RAB-10可以通過其效應(yīng)因子EHBP-1對囊泡上的微絲成束進行調(diào)控，從而促進循環(huán)內(nèi)體的膜出芽[54,57](圖 2)。此外，RAB-10可以募集其效應(yīng)因子CNT-1/ARF-GAP至循環(huán)內(nèi)體，CNT-1催化ARF-6失活從而降低膜上ARF-6效應(yīng)因子PI5K豐度，進一步大幅度降低循環(huán)內(nèi)體膜上PI(4,5)P2水平，以維持循環(huán)內(nèi)體的正常功能[33](圖2)。

線蟲RAB-10功能研究起始于極性腸細胞，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)RAB-10在神經(jīng)元突觸后谷氨酸受體(AMPAR)亞基GLR-1的循環(huán)和神經(jīng)肽的分泌中也起作用，但對非極性體細胞和卵母細胞的內(nèi)吞沒有顯著影響[53,58]。考慮到RAB-10在線蟲幾乎所有的組織中表達，這一結(jié)果令人困惑。進一步分析顯示RAB-10在非極性細胞的囊泡運輸中也發(fā)揮作用，但與其旁系同源物RAB-8的功能冗余[54]。RAB-10和RAB-8是酵母中參與分泌運輸?shù)腞ab蛋白Sec4p的同源物，已知RAB8在哺乳動物細胞中參與分泌運輸，這一過程可能使用了循環(huán)內(nèi)體作為中介[59]。線蟲的和單突變體能夠存活并可育，但同時缺失RAB-10和RAB-8的蟲體大多只能發(fā)育到幼蟲階段，而少量存活的成年線蟲不育。這種不育性可能是由于生殖細胞分泌阻斷所致，表現(xiàn)為跨膜蛋白SNB-1滯留在和雙突變體卵細胞內(nèi)的分泌囊泡。而幼蟲發(fā)育停滯表型可能由于其他細胞類型的分泌缺陷或循環(huán)阻滯所致。這些結(jié)果共同表明，Rab功能的冗余性可能隨細胞類型的不同而相異。

RAB10的循環(huán)調(diào)控功能在哺乳動物細胞中高度保守。研究發(fā)現(xiàn)RAB10在MDCK細胞的基底側(cè)循環(huán)內(nèi)體膜上高度富集并且調(diào)節(jié)極性上皮細胞中的基底側(cè)循環(huán)運輸[60]。在哺乳動物脂肪細胞中，RAB10在胰島素激活的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT4的循環(huán)中起作用[61]。RAB10的效應(yīng)因子CH (calponin homology)結(jié)構(gòu)域蛋白EHBP1在脂肪細胞的GLUT4循環(huán)中也發(fā)揮調(diào)控功能，且功能過程與線蟲RME-1同源物EHD1和EHD2相關(guān)[62,63]。與線蟲腸細胞類似，在極性MDCK細胞中，RAB8和RAB10同時敲除比單獨敲除RAB8或RAB10產(chǎn)生的分泌缺陷表型嚴重，暗示RAB8和RAB10在胞吐運輸中的功能是冗余的，可能是共享了部分效應(yīng)因子[64]。

圖2 CIE貨物膜蛋白的循環(huán)運輸分子調(diào)控

活性態(tài)RAB-5(GTP)招募效應(yīng)因子LET-413以促進DENN-4/GEF對RAB-10的激活，而活性態(tài)RAB-10(GTP)可以通過其效應(yīng)因子TBC-2/GAP關(guān)閉上游RAB-5活性。RAB-10 (GTP)招募效應(yīng)因子CNT-1/Arf-GAP對ARF-6活性進行負調(diào)控，下調(diào)內(nèi)體上PI(4,5)P2水平。RAB-10的另外一個效應(yīng)因子EHBP-1調(diào)控循環(huán)內(nèi)體上微絲(F-actin)的成束捆綁，同時定位于循環(huán)內(nèi)體的PTRN-1促進微絲的聚合，共同促進循環(huán)內(nèi)體的膜出芽。ARF-6結(jié)合蛋白SAC-1以負反饋方式對ARF-6活性進行抑制以維持內(nèi)體上PI(4,5)P2穩(wěn)態(tài)。RME-1在RAB-10下游發(fā)揮功能，結(jié)合循環(huán)內(nèi)體中的磷酸肌醇PI(4,5)P2，參與管狀膜運輸結(jié)構(gòu)塑形。定位于循環(huán)內(nèi)體的SNAREs和exocyst復(fù)合體進一步介導(dǎo)膜融合。黃色標示蛋白因子的早期內(nèi)體定位，綠色標示蛋白因子的循環(huán)內(nèi)體定位。

3.3 循環(huán)通路中的內(nèi)體轉(zhuǎn)化：RAB-5-to-RAB- 10級聯(lián)

在內(nèi)體轉(zhuǎn)化過程中，一個重要的概念是內(nèi)體區(qū)室的屬性改變，從而高效介導(dǎo)膜運輸。內(nèi)體轉(zhuǎn)化在機制上涉及Rab級聯(lián)反應(yīng)(Rab cascade)[65]，上游的Rab (如RAB5)招募下游Rab (如RAB7)的GEF，被GEF激活的下游Rab上膜后反過來招募上游Rab的GAP，從而關(guān)閉上游Rab活性。以此方式，Rab級聯(lián)能夠轉(zhuǎn)變膜上分子構(gòu)成進而轉(zhuǎn)化內(nèi)體屬性和功能(如RAB5標記的早期內(nèi)體轉(zhuǎn)化為RAB7標記的晚期內(nèi)體)。

近期，在線蟲腸細胞和HeLa細胞中的研究顯示LET-413/ERBIN作為RAB-5/RAB5效應(yīng)因子行使功能，在激活下游RAB-10/RAB10過程中起關(guān)鍵作用[66]。在動物中，LET-413標記的管狀膜結(jié)構(gòu)數(shù)量顯著降低，且LET-413和RAB-10之間的共定位水平下降。當(dāng)LET-413缺失時，RAB-10顯示出明顯的細胞質(zhì)彌散分布。進一步的研究發(fā)現(xiàn)LET-413顯著增加RAB-10-GEF蛋白DENN-4與RAB-10的親和性。DENN-4獨自不能促使RAB-10 (GDP)完成GDP的釋放，而當(dāng)LET-413同時存在時，RAB-10攜載的GDP被大量釋放，表明LET-413與DENN-4協(xié)同促進RAB-10激活。該研究表明LET- 413作為RAB-5的效應(yīng)因子，與RAB-10的GEF蛋白DENN-4一起調(diào)控內(nèi)吞循環(huán)過程中RAB-5-to-RAB- 10級聯(lián)，促進早期內(nèi)體向循環(huán)內(nèi)體的轉(zhuǎn)化(圖2)。

4 內(nèi)吞循環(huán)運輸?shù)钠渌匾{(diào)節(jié)因子

4.1 膜塑形蛋白RME-1/EHD1

除了Rab家族小G蛋白外，在不同模式系統(tǒng)中的研究還發(fā)現(xiàn)多種其他類型的循環(huán)特異性調(diào)節(jié)因子，如Eps15同源結(jié)構(gòu)域蛋白RME-1/EHD1[67]。在突變線蟲的多種細胞類型中存在循環(huán)缺陷，包括卵黃蛋白受體循環(huán)受損導(dǎo)致的卵細胞對卵黃蛋白的攝取減少，腔細胞對液態(tài)標記物攝取減少以及腸細胞中巨大循環(huán)內(nèi)體液泡累積。線蟲腸細胞中累積的巨大循環(huán)內(nèi)體是基底側(cè)循環(huán)運輸障礙的標志性表型。這些液泡能夠被ARF-6標記，但不被RAB-5標記，其中積聚了基底側(cè)循環(huán)貨物膜蛋白，表明RME-1參與調(diào)節(jié)循環(huán)路徑的晚期步驟。與此類似，在MDCK細胞或HepG2細胞中通過藥理學(xué)手段阻斷循環(huán)運輸會催生巨大內(nèi)體液泡[68]。與線蟲中的研究結(jié)果一致，哺乳動物中的研究也證明了EHD1在循環(huán)過程中特異性參與調(diào)控膜蛋白從循環(huán)內(nèi)體回到質(zhì)膜的步驟[69]。RME-1家族的所有成員都包含羧基末端EH結(jié)構(gòu)域[67]，已知EH結(jié)構(gòu)域與哺乳動物和酵母中的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運相關(guān)[70]。RME-1同源物和其他包含EH結(jié)構(gòu)域的蛋白通過EH結(jié)構(gòu)域與靶蛋白的天冬酰胺-脯氨酸-苯丙氨酸(NPF)基序特異性結(jié)合[71]。在哺乳動物中，EHD1通過EH-NPF相互作用與Syndapin形成蛋白復(fù)合物，這對于循環(huán)內(nèi)體的功能至關(guān)重要[72]。多囊泡體上調(diào)控降解的蛋白ALX-1/ ALIX也通過NPF基序介導(dǎo)與RME-1-EH的互作，促進了基底側(cè)貨物膜蛋白的循環(huán)轉(zhuǎn)運[73]。

RME-1/EHD1具有ATP酶活性，與ATP結(jié)合后能夠同源寡聚化并行使功能[74]。與EHD1一樣，脊椎動物中EHD1的旁系同源物EHD2、EHD3和EHD4也在內(nèi)吞運輸中起作用，只是涉及的路徑和步驟不同[62,75]。對EHD2的結(jié)構(gòu)分析顯示，EHD2中心部位的ATP結(jié)合域“G-domain”與GTP酶Dynamin的GTP結(jié)合域相似[76]。如前所述，發(fā)動蛋白Dynamin是一種膜縊裂蛋白，通過收縮囊泡頸致使內(nèi)吞囊泡與質(zhì)膜分離[77]。EHD2和Dynamin的相似之處還包括EHD2與ATP類似物結(jié)合后在酸性脂質(zhì)體周圍組裝成螺旋環(huán)的能力[76]。EHD2的ATP酶活性受脂質(zhì)結(jié)合和寡聚化的調(diào)控，類似蛋白組裝能夠活化Dynamin的GAP活性[76]。然而，結(jié)構(gòu)上除了G-domain之外，RME-1/EHD1家族蛋白與Dynamin超家族成員不盡相同。RME-1/EHD1家族蛋白缺乏pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域，EHD2的脂質(zhì)結(jié)合區(qū)域是螺旋狀的，在二聚后形成獨特的剪刀狀界面。此外，RME-1/EHD1家族蛋白也缺乏富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域。鑒于RME-1/EHD1家族成員之間的高度相似性(約65%的序列相同)和它們與Dynamin的相似性，RME-1/EHD1家族蛋白可能具有類似Dynamin的特性，在膜縊裂的過程中發(fā)揮作用[76]。線蟲中的研究發(fā)現(xiàn)，CDE和CIE類型循環(huán)貨物膜蛋白在RME-1缺失的情況下均會積累在內(nèi)體中，推測RME-1可能介導(dǎo)了循環(huán)內(nèi)體上管狀膜結(jié)構(gòu)的縊裂，促進攜載膜蛋白的膜泡釋放[78](圖2)。

4.2 Arf家族小G蛋白ARF-6/ARF6

Arf家族小G蛋白(Arf small GTPase)也是重要的囊泡運輸調(diào)控因子，主要調(diào)節(jié)供體膜上的包被蛋白組裝，參與囊泡出芽過程。哺乳動物基因組編碼5個Arf基因，中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)成分分離實驗證明ARF6特異性定位于細胞質(zhì)膜，且其質(zhì)膜分布不受Arf活性激活劑鳥苷5￠-O-(3-硫代)三磷酸(GTPγS)或Arf活性抑制劑布雷菲德菌素A (Brefeldin A)的影響。不同于ARF6，ARF1、ARF3、ARF4和ARF5主要定位于細胞質(zhì)，與GTPγS孵育后可以被募集到除質(zhì)膜外的各種細胞內(nèi)膜上，布雷菲德菌素A可以阻斷這種GTPγS促進的Arf蛋白與膜的結(jié)合。ARF6與質(zhì)膜的穩(wěn)定結(jié)合及其膜定位對GTPγS或布雷菲德菌素A的不敏感性反應(yīng)了ARF6與其他Arf蛋白之間的明顯區(qū)別。質(zhì)膜定位提示其在質(zhì)膜上具有獨特的功能，但實驗未能在包括網(wǎng)格蛋白有被小泡的內(nèi)吞結(jié)構(gòu)上發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性ARF6，這一結(jié)果似乎與ARF6在成纖維細胞中參與內(nèi)體包被結(jié)構(gòu)組裝的推論不一致[79]。與其他Arf蛋白相比，ARF6與內(nèi)吞循環(huán)調(diào)節(jié)最為相關(guān)。在CHO細胞中，顯性失活(dominant negative)突變體ARF6 (T27N)的異位高表達能夠有效阻止貨物膜蛋白的循環(huán)運輸[80]。后續(xù)研究指出，ARF6特異性參與調(diào)控CIE貨物膜蛋白的循環(huán)運輸，此功能效應(yīng)與PI(4,5)P2代謝密切相關(guān)[81]。

ARF6活性由鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)和GTP酶激活蛋白(GAP)控制。人類基因組含15個Arf-GEF的編碼基因，其中8個被歸類為ARF6-GEF，分屬3個家族：cytohesin、EFA6和BRAG[82,83]。不同的ARF6-GEF通過不同的機制激活A(yù)RF6以參與各種功能過程[84]。cytohesin家族成員cytohesin1、ARNO和Grp1的調(diào)控功能不專屬于ARF6[82]，而EFA6家族蛋白特異性催化ARF6的核苷酸交換[85]。對BRAG家族成員的研究表明，GEP100的GEF活性對ARF6具有特異性，GEP100在內(nèi)體上與ARF6部分共定位[86]。

如前所述，ARF6定位于質(zhì)膜，但可能并不調(diào)節(jié)CDE內(nèi)吞，而是對內(nèi)吞后的貨物分選至關(guān)重要[81]。具體來說，組成性活化的ARF6突變蛋白能夠持續(xù)激活磷酸肌醇-4-磷酸5激酶(PIP5K)，產(chǎn)生異常高水平的內(nèi)體PI(4,5)P2，破壞分選和隨后的循環(huán)轉(zhuǎn)運[87]。在秀麗線蟲中，RAB-10可以將CNT-1/ARF-6-GAP募集到內(nèi)體并關(guān)閉ARF-6活性。在RAB-10缺失情況下，PI(4,5)P2水平顯著增加，CIE貨物蛋白的循環(huán)運輸受到嚴重影響[33](圖2)。ARF6也參與微絲骨架的調(diào)節(jié)，顯性失活突變體ARF6 (T27N)過表達會抑制一系列肌動蛋白相關(guān)過程，包括細胞擴散和傷口愈合[88,89]。ARF6對肌動蛋白的調(diào)節(jié)作用也可能通過PI(4,5)P2介導(dǎo)，募集肌動蛋白調(diào)節(jié)因子以影響微絲動態(tài)[90]。

4.3 CED-10/RAC小G蛋白

在秀麗線蟲中的研究發(fā)現(xiàn)，小G蛋白RAC1 (Rac1 small GTPase)同源物CED-10與CED-12/ ELMO、CED-5/DOCK180、CED-2/CrkII協(xié)同作用，促進細胞骨架重組，吞噬凋亡細胞[91]。CED-12和CED-5形成CED-10二元GEF，促進CED-10(GDP)轉(zhuǎn)化為活性CED-10(GTP)[92]。CED-2被認為是一種銜接因子，能夠與CED-5結(jié)合將蛋白復(fù)合物與某些凋亡受體如MOM-5/Frizzled或Integrins連接起來[93,94]。此外，哺乳動物細胞中RAC1在內(nèi)體上能夠轉(zhuǎn)化為GTP攜載狀態(tài)，依賴ARF6介導(dǎo)的循環(huán)運輸將其定位于遷移細胞的前沿[95]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)活性態(tài)CED-10能夠定位在早期內(nèi)體和循環(huán)內(nèi)體，參與調(diào)控上皮腸細胞中的內(nèi)吞循環(huán)運輸。對其分子作用機制的研究發(fā)現(xiàn)CED-10能夠募集Rab-GAP蛋白TBC-2，對早期內(nèi)體關(guān)鍵調(diào)控因子RAB-5活性進行負調(diào)控以促進循環(huán)運輸[96]。

4.4 exocyst復(fù)合物

exocyst是一種進化上保守的八聚體復(fù)合物，由Sec3、Sec5、Sec6、Sec8、Sec10、Sec15、Exo70以及Exo84組成[97]。exocyst最初被提出在高爾基體分泌/胞吐作用中行使功能，輔助分泌囊泡與質(zhì)膜結(jié)合，參與酵母極性出芽[97]。最近的研究揭示exocyst定位在多種類型內(nèi)體，與循環(huán)內(nèi)體定位蛋白ARF6、AP1B和RAB11相互作用[98~100]。exocyst的功能障礙可能影響了多種胞內(nèi)運輸過程，如非極性細胞中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的循環(huán)轉(zhuǎn)運，極性細胞中頂膜側(cè)和基底側(cè)的循環(huán)運輸[101]。近期，線蟲中的研究闡述了exocyst調(diào)控循環(huán)運輸?shù)目赡芊肿訖C制，exocyst亞基SEC-10缺失導(dǎo)致腸細胞基底側(cè)循環(huán)運輸障礙。進一步的分析發(fā)現(xiàn)，SEC-10與RAB-10協(xié)同調(diào)控內(nèi)體間互聯(lián)的膜管結(jié)構(gòu)的形成[102]。

4.5 SNARE復(fù)合物

囊泡運輸普遍涉及運輸囊泡的出芽和融合過程，其中囊泡膜融合由SNAREs復(fù)合物介導(dǎo)。SNAREs的命名源于它們最初是作為可溶性N-乙基馬來酰胺-敏感因子附著蛋白(soluble N-ethyl- maleimide- sensitive factor (NSF) attachment proteins, SNAP)的膜受體，即SNAPs蛋白受體(SNAP receptors, SNARE)。SNAREs根據(jù)功能分為兩大類：定位于運輸囊泡供體膜的v-SNAREs和定位于靶膜的t-SNAREs。近年的研究顯示，retromer復(fù)合體主導(dǎo)的內(nèi)體至高爾基體的逆向運輸需要SNARE復(fù)合物的參與[103]。VAMP4 (v-SNARE)和t-SNARE蛋白STX6、STX16、VTI1A組成的SNARE復(fù)合物介導(dǎo)了運輸囊泡與TGN的融合，這些SNAREs的組裝受定位于反式高爾基體(trans Golgi network, TGN)的多亞基拴系復(fù)合物GARP (Golgi-associated retro-grade protein, tethering com-plex)的調(diào)控[104]。

循環(huán)運輸途徑中，一系列SNARE蛋白也參與其中，如VAMP4、STX6、STX16、VTI1A、VAMP3及STX13等。針對循環(huán)運輸途徑中的SNARE組成及其參與步驟的研究顯示，另一種栓系復(fù)合物EARP (endosome-associated recycling protein)定位于循環(huán)內(nèi)體，參與促進CDE貨物膜蛋白TfR循環(huán)回到質(zhì)膜，且這種調(diào)控功能可能與EARP-STX6之間的蛋白質(zhì)互作密切相關(guān)[105]。

5 磷酸肌醇PI(4,5)P2與內(nèi)吞循環(huán)運輸

在內(nèi)吞運輸途徑中，不同膜區(qū)室具有不同水平的磷酸肌醇(phosphatidylinositol phosphate, PIP)。例如PI(4)P主要在高爾基體富集，PI(4,5)P2主要在質(zhì)膜和循環(huán)內(nèi)體富集，PI(3)P主要在早期內(nèi)體富集，PI(3,5)P2主要在晚期內(nèi)體和溶酶體富集。PIP是磷酸肌醇的磷酸化衍生物，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成并通過膜轉(zhuǎn)運遞送至其他內(nèi)膜區(qū)室[106]。內(nèi)膜上的PIP水平變化對于貨物的定向流動至關(guān)重要。經(jīng)由脂質(zhì)激酶和磷酸酶催化，肌醇環(huán)上不同位點(主要是3、4和5位)的羥基被磷酸化和去磷酸化，PIP在不同種類間相互轉(zhuǎn)化，在不同的區(qū)室富集[106]。越來越多的證據(jù)表明，膜區(qū)室上的膜微域(micro-domain)對膜周蛋白(peripheral protein)的差異性募集是通過蛋白與PIP特異性結(jié)合介導(dǎo)，例如內(nèi)吞過程中的接頭蛋白復(fù)合物AP2和發(fā)動蛋白Dynamin能夠選擇性地結(jié)合質(zhì)膜中PI(4,5)P2富集區(qū)域。許多參與膜運輸?shù)哪ぶ艿鞍缀胁煌牧字Y(jié)合結(jié)構(gòu)域(如FYVE結(jié)構(gòu)域、PH結(jié)構(gòu)域、PX結(jié)構(gòu)域、GRAM結(jié)構(gòu)域等)。如前所述，PI(4,5)P2主要在質(zhì)膜和循環(huán)內(nèi)體末端富集，對參與囊泡運輸?shù)暮芏嗄づ菪纬烧{(diào)控因子、膜融合調(diào)控因子、骨架調(diào)控因子的膜定位至關(guān)重要。例如，循環(huán)調(diào)控因子RME-1及其哺乳動物同源物EHD1特異性親和PI(4,5)P2，在循環(huán)內(nèi)體膜上參與管狀膜塑形過程[67,69,78]。另一個循環(huán)調(diào)控因子EHBP-1/EHBP1也特異性結(jié)合循環(huán)內(nèi)體上PI(4,5)P2，從而將內(nèi)體膜與微絲橋連起來，促進內(nèi)體上膜出芽[54,57]。

循環(huán)內(nèi)體上PI(4,5)P2的水平受ARF-6/ARF6的正調(diào)控以及磷酸肌醇磷酸酶SAC-1/Sac1p的負調(diào)控(圖2)。ARF-6/ARF6招募其效應(yīng)因子PI(4)P5-kinase，將內(nèi)體膜上PI(4)P轉(zhuǎn)化為PI(4,5)P2[87]。磷酸肌醇磷酸酶Sac1p在酵母肌動蛋白突變等位基因抑制子的研究中被發(fā)現(xiàn)鑒定[107]。Sac1p的SAC結(jié)構(gòu)域具有水解PI(3)P、PI(4)P和PI(3,5)P2的功能特異性[108]。Sac1p/hSAC1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，通過COPI和COPII在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間穿梭[109,110]。在線蟲腸細胞中，SAC-1/Sac1p參與確保基底側(cè)循環(huán)運輸?shù)恼＿M行。在ARF-6缺失情況下，SAC-1的亞細胞分布受到顯著影響。進一步分析顯示，SAC-1可以結(jié)合ARF-6的GEF蛋白BRIS-1，從而與無活性態(tài)ARF-6之間產(chǎn)生競爭性抑制，進而負調(diào)控ARF-6活性，防止PI(4,5)P2水平異常上調(diào)[111]。

6 微絲(F-actin)與內(nèi)吞循環(huán)運輸

研究表明，許多不同類型的微絲調(diào)節(jié)因子參與調(diào)節(jié)循環(huán)運輸[57,112,113]。微絲聚合(polymerization)、解聚(depolymerization)和捆綁(bundling)在循環(huán)貨物分選和管狀膜載體生物發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[57]。異常的微絲解聚會導(dǎo)致循環(huán)貨物蛋白Tac在ARF6標記的循環(huán)內(nèi)體中累積，表明微絲在ARF6介導(dǎo)的循環(huán)運輸通路中至關(guān)重要[114]。作為循環(huán)運輸?shù)闹饕{(diào)控因子，ARF6也能夠促進微絲結(jié)構(gòu)的組裝[114]。

近期，在線蟲中的研究發(fā)現(xiàn)了一系列循環(huán)運輸相關(guān)的微絲動態(tài)調(diào)控因子。循環(huán)調(diào)控小G蛋白RAB-10的效應(yīng)因子EHBP-1參與介導(dǎo)微絲骨架與循環(huán)內(nèi)體之間的橋連[57]。哺乳動物中，EHBP-1同源物EHBP1能夠與EHD1/EHD2結(jié)合，參與脂肪細胞中的GLUT4循環(huán)運輸[63]。線蟲EHBP-1因為缺少NPF序列不能與RME-1直接結(jié)合。EHBP-1缺失與RAB-10缺失的循環(huán)缺陷表型類似，特異性影響CIE貨物膜蛋白的循環(huán)運輸。在生殖細胞中，EHBP-1缺失影響了膜蛋白的分泌運輸，類似于RAB-10和RAB-8雙突變表型。EHBP-1含有C末端CC結(jié)構(gòu)域，中部CH結(jié)構(gòu)域和N末端類C2結(jié)構(gòu)域。其中，CH結(jié)構(gòu)域與微絲結(jié)合，類C2結(jié)構(gòu)域與循環(huán)內(nèi)體上PI(4,5)P2親和，CC結(jié)構(gòu)域與RAB-10的互作促進了CH結(jié)構(gòu)域與微絲之間的親和水平。通過上述不同結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的相互作用，EHBP-1將循環(huán)內(nèi)體與微絲骨架橋連以促進循環(huán)[54,57](圖2)。

微管結(jié)合蛋白CAMSAPs/Patronin與微管末端相結(jié)合，促進非中心體微管的穩(wěn)定性[115]。PTRN-1是線蟲中唯一的CAMSAPs同源物，廣泛表達于包括腸道在內(nèi)的多種組織[116]。在神經(jīng)元中，PTRN-1對微管穩(wěn)定性和神經(jīng)元軸突再生至為重要[117]，PTRN-1缺失導(dǎo)致PLM感覺神經(jīng)元軸突中的微管動態(tài)上調(diào)[117]。PTRN-1由N末端CH結(jié)構(gòu)域，中部CC區(qū)段和C末端CKK結(jié)構(gòu)域組成。一直以來，CAMSAPs/Patronin/PTRN-1的N末端CH結(jié)構(gòu)域的功能意義不明確。在線蟲腸細胞中的研究發(fā)現(xiàn)PTRN-1缺失導(dǎo)致微絲動態(tài)受損、細胞內(nèi)微絲結(jié)構(gòu)大幅度減少，CIE貨物膜蛋白的循環(huán)運輸阻滯。后續(xù)研究顯示，PTRN-1的N末端CH結(jié)構(gòu)域和中心CC區(qū)域協(xié)同維持循環(huán)轉(zhuǎn)運，CH結(jié)構(gòu)域通過結(jié)合微絲成核因子CYK-1/formin的N末端GTP酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域(GBD)，促進CYK-1介導(dǎo)的微絲聚合(圖2)。CYK-1/ formin活性片段過表達可以顯著恢復(fù)突變體中微絲結(jié)構(gòu)并抑制循環(huán)障礙表型[118]。

7 內(nèi)吞循環(huán)運輸異常相關(guān)疾病

CDE途徑中的中心成分網(wǎng)格蛋白clathrin、接頭蛋白復(fù)合物AP2或者發(fā)動蛋白Dynamin的功能喪失都會導(dǎo)致胚胎致死[119~121]。CDE的紊亂與多種人類疾病如癌癥、肌肉疾病、代謝性遺傳綜合征、神經(jīng)退行性疾病的相關(guān)性已被報道[17,122]。隨著對不同內(nèi)吞運輸通路的了解加深，研究人員正在開發(fā)靶向定位將納米顆粒和治療劑遞送至患病細胞的方法[123]。

與CDE貨物蛋白不盡相同，經(jīng)由CIE進入細胞的貨物蛋白對細胞的存活、信號傳遞、細胞遷移、小G蛋白活性調(diào)節(jié)等都非常重要。因此，CIE貨物膜蛋白的循環(huán)運輸也被認為與人體疾病發(fā)生相關(guān)，特別是癌癥的發(fā)生發(fā)展[30]。事實上，Rab蛋白、脂質(zhì)磷酸酶，磷酸激酶以及循環(huán)轉(zhuǎn)運和分選調(diào)控因子的突變在許多人類疾病研究中被報道[124~126]。然而，學(xué)界對CIE貨物的循環(huán)運輸機制知之甚少，尤其缺乏對細胞如何進行循環(huán)貨物檢測、分選和轉(zhuǎn)運機制的理解。無疑，對這些機制更深入的了解將會幫助人們更好地理解內(nèi)吞運輸過程與人類疾病發(fā)生之間的聯(lián)系。

8 模式生物秀麗隱桿線蟲中的內(nèi)吞循環(huán)運輸研究

秀麗隱桿線蟲是生物醫(yī)學(xué)研究中的一種重要模式生物。1965年，Sydney Brenner首先將生活在土壤中的無脊椎動物秀麗隱桿線蟲進行實驗室培養(yǎng)，用于細胞凋亡和行為學(xué)研究。Brenner榮獲2002年諾貝爾生理及醫(yī)學(xué)獎，是基于其重要的兩個貢獻：一是建立了線蟲模式生物系統(tǒng)，綜合運用遺傳分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了許多線蟲發(fā)育基因，其中就包括作用于細胞程序性死亡的關(guān)鍵基因，讓研究者有機會一窺程序性細胞死亡的機制；二是在人類基因組中找到線蟲細胞程序性死亡基因的同源基因。

秀麗線蟲成蟲體長約1 mm，身體透明，以大腸桿菌為食餌，生命周期短。自然狀態(tài)下的秀麗線蟲是一種自我繁殖的雌雄同體生物，這種自我繁殖的能力有利于得到具有同一基因型的純合體。秀麗線蟲可以像培養(yǎng)細胞一樣在液氮中長期保存，遺傳學(xué)操作便捷，實驗周期短，可十分方便地進行轉(zhuǎn)基因、RNA干擾和突變體篩選操作[127,128]。1998年，線蟲基因組測序完成(www.wormbase.org)，其基因組大約100 Mb，預(yù)測有約19 000個基因。線蟲基因有40%和人類基因同源，細胞譜系圖已全部繪制完成。秀麗線蟲具有完備的發(fā)育特征和遺傳學(xué)特征，是分子遺傳學(xué)研究的重要工具。雌雄同體成蟲個體具有959個體細胞，其中的302個神經(jīng)細胞構(gòu)成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，雄性成蟲個體具有1031個體細胞(381個神經(jīng)細胞)。秀麗線蟲具有豐富的行為學(xué)特征，如運動、覓食、排泄、交配、排卵、溫度趨向性、化學(xué)趨向性和群體趨向性等，通過行為異常突變體的篩選可以明確行為學(xué)的分子機制。上述特點使得秀麗線蟲成為研究細胞凋亡、神經(jīng)發(fā)育和學(xué)習(xí)記憶等多種復(fù)雜生命現(xiàn)象調(diào)控機制的重要模式生物之一[129]。

對于內(nèi)吞運輸研究而言，線蟲也是一種理想的模式生物，其腸細胞、卵母細胞和腔細胞等具備顯著胞吞特性，為研究囊泡轉(zhuǎn)運機制提供了很多便利。通過在線蟲中的研究，學(xué)界已發(fā)現(xiàn)許多新的細胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運相關(guān)分子及機制，揭示了膜運輸過程在生理學(xué)和發(fā)育中的不同作用，提供了大量貨物分選、囊泡出芽、膜分離和膜融合相關(guān)分子機制的實驗證據(jù)。卵黃蛋白YP170可以結(jié)合膽固醇，是低密度脂蛋白(LDL)的重要成分。在線蟲中轉(zhuǎn)基因表達YP170的GFP融合蛋白，YP170::GFP 在雌雄同體成蟲的腸細胞中合成，從基底側(cè)分泌到假體腔(pseudocoelom)，繼而與卵母細胞膜上卵黃蛋白受體RME-2特異性結(jié)合并被內(nèi)吞進入卵母細胞。對YP170::GFP內(nèi)吞缺陷表型的篩選獲得11種基因(receptor-mediated endocytosis defective)，其產(chǎn)物分別作用于內(nèi)吞運輸?shù)牟煌A段[130]。線蟲中另一個重要的內(nèi)吞運輸研究模型是腔細胞(coelomocyte)。腔細胞是存在于線蟲假體腔內(nèi)的6個吞噬細胞，功能類似于哺乳動物中的巨噬細胞，能夠從假體腔中移除很多外來分子。通過向假體腔中注射BSA或者dextran偶聯(lián)的熒光標記蛋白，可以觀察這些熒光分子運輸至腔細胞的轉(zhuǎn)運過程。除此之外，F(xiàn)ares和Greenwald設(shè)計了一種更加簡單有效的方法來研究腔細胞胞吞[131]。他們將基因和基因的啟動子融合表達()，得到一種可以從肌肉持續(xù)向假體腔中分泌GFP的線蟲種系。正常狀態(tài)下，GFP被腔細胞內(nèi)吞，GFP在假體腔中只呈現(xiàn)微弱的熒光，在腔細胞的晚期內(nèi)體和溶酶體中呈現(xiàn)強熒光。通過這個篩選設(shè)計，許多(coelomocyte uptake defective)突變體被鑒定。這類突變體的腔細胞不能有效地進行內(nèi)吞，故而肌肉細胞分泌出的GFP累積在假體腔，其中某些突變體的腔細胞細胞器形態(tài)也發(fā)生異常[132]。

線蟲腸組織由20個極性上皮腸細胞組成，具有兩個不同的質(zhì)膜域：頂膜和基底膜。頂膜端的微絨毛面對腸腔，負責(zé)從環(huán)境中攝取營養(yǎng)物質(zhì)。基底膜面對假體腔，負責(zé)與身體其他部分進行物質(zhì)和信息交換(圖3)。針對循環(huán)運輸研究，線蟲腸上皮細胞已被證明是優(yōu)秀的高效模式系統(tǒng)[33,44,53]，國內(nèi)外相關(guān)實驗室相繼發(fā)展了一系列專用研究工具，包括細胞器熒光融合標記蛋白轉(zhuǎn)基因表達品系：如RAB-5標記早期內(nèi)體，RAB-11標記頂膜端循環(huán)內(nèi)體，基膜端循環(huán)內(nèi)體可被RME-1、ARF-6標記，TAT-1和CHAT-1標記早期內(nèi)體和循環(huán)內(nèi)體，TRAM標記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等[33,53,73,102,133]。為研究循環(huán)調(diào)控因子的膜蛋白調(diào)控特異性，多類型腸細胞熒光融合貨物膜蛋白轉(zhuǎn)基因表達品系被構(gòu)建：如hTAC::GFP (非網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞膜蛋白)、hTfR::GFP (網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞膜蛋白)、DAF-4::GFP (II型TGF-beta受體，非網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞膜蛋白)、MIG-14::GFP (Wntless, retromer依賴貨物膜蛋白)等。利用這些熒光貨物膜蛋白，研究人員可較為便利地確定調(diào)控因子在特定類型膜蛋白循環(huán)運輸中的功能角色。基于上述研究系統(tǒng)及工具，近期的循環(huán)運輸機制研究發(fā)現(xiàn)了一系列新的蛋白質(zhì)相互作用和突變表型，明確了循環(huán)調(diào)控關(guān)鍵因子RAB-10的功能機制，獲得RAB-10與ARF-6調(diào)控路徑交叉點的初步功能信息[33,54]。

圖3 線蟲極性腸上皮細胞示意圖

線蟲腸細胞的頂膜面對腸腔，基底膜面對假體腔，星號指示腸道。

9 結(jié)語與展望

內(nèi)吞運輸系統(tǒng)主要由內(nèi)吞、循環(huán)、降解等子系統(tǒng)組成。其中，內(nèi)吞循環(huán)運輸負責(zé)將膜上大分子送回質(zhì)膜再利用，在細胞極性形成和維持、細胞分裂及遷移、神經(jīng)突觸可塑性、免疫應(yīng)答、生長因子受體調(diào)控等過程中不可或缺。據(jù)測算，細胞每小時可內(nèi)吞相當(dāng)于自身質(zhì)膜1~5倍體量的膜分子[8]，因此循環(huán)通路必須受到精確調(diào)控并足夠活躍，才足以維持質(zhì)膜組成的動態(tài)穩(wěn)定。循環(huán)運輸通路主要分為兩大類型，針對網(wǎng)格蛋白依賴型內(nèi)吞膜蛋白循環(huán)通路研究起步較早，對其通路調(diào)控機制的了解也較為深入，而非網(wǎng)格蛋白依賴內(nèi)吞膜蛋白循環(huán)通路近年開始受到學(xué)界持續(xù)關(guān)注，但相關(guān)調(diào)控機制的研究仍處于早期階段，大量問題仍需進一步解答，諸如不同膜蛋白循環(huán)通路共享程度如何，膜蛋白特異性循環(huán)調(diào)控因子有哪些，磷脂、細胞骨架如何協(xié)同調(diào)控循環(huán)運輸?shù)?。鑒于循環(huán)運輸?shù)牡鞍渍{(diào)控因子及其功能機制在進化上極為保守，國內(nèi)外相關(guān)實驗室陸續(xù)建立了一系列模式生物秀麗線蟲專用研究工具，包括細胞器熒光融合標記蛋白轉(zhuǎn)基因品系[33,53,73,102,133]、多類型熒光融合貨物膜蛋白轉(zhuǎn)基因品系[53,134]?；谏鲜鲅芯肯到y(tǒng)，結(jié)合遺傳操作、活體成像、蛋白和磷脂生物化學(xué)等研究手段，學(xué)界對循環(huán)運輸調(diào)控機制開展了持續(xù)性研究工作，報道了小G蛋白、磷酸肌醇、微絲骨架相關(guān)的一系列新的調(diào)控因子和功能模型，對循環(huán)調(diào)控機制有了初步的了解[33,54,57]。未來，研究工作將圍繞一些更深層次的科學(xué)問題展開，如貨物膜蛋白進入降解或循環(huán)通路的選擇特異性調(diào)控，進入循環(huán)通路的貨物蛋白的包裹及運輸裝配，不同循環(huán)通路在特定細胞類型中如何根據(jù)細胞內(nèi)外環(huán)境的變化進行精確整合。對這些核心問題的進一步探索，將拓展人們對循環(huán)運輸在多細胞生物生理發(fā)育和病理異常過程中作用機制的認知，加深對囊泡運輸調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理解。

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Endocytic recycling pathways and the regulatory mechanisms

Long Lin, Anbing Shi

Endocytic transport is imperative for the exchange of information between cells and the external environment. Specifically, the process of endocytic transport comprises precise regulation of uptake and sorting of extracellular macromolecules, phospholipids, and membrane proteins. In the endocytic transport system, the recycling pathways are responsible for delivering membrane proteins and phospholipids back to the plasma membrane. Thus, endocytic recycling plays critical roles in various biological processes, including nutrient absorption, cell polarity establishment, cell migration, cell division, synaptic plasticity, immune response, and growth factor receptor regulation. There are two essential types of recycling pathways in eukaryotic cells, recycling of clathrin-dependent endocytic cargos (CDE recycling) and recycling of clathrin-independent endocytic cargos (CIE recycling). The transferrin receptor TfR and the low-density lipoprotein receptor LDLR, which have essential physiological roles, are representative membrane proteins of the CDE recycling transport. In recent years, various membrane proteins governed by CIE recycling transport have been identified, including IL2 receptor α-subunit, major histocompatibility complex MHC Class I, and glucose transporter GLUT4. Therefore, the investigation of the regulatory mechanisms of CIE recycling has drawn notable attention in the field. Moreover, CIE recycling research presents fundamental significance in cell biology, which also provides scientific evidence and potential therapeutic clues for the diagnosis and treatment strategies of diseases such as type Ⅱ diabetes and cancer. Compared with the CDE recycling, the study on CIE recycling started later, and there is much to be learned of its regulatory mechanisms. To this end, this review summarizes the features of endocytic recycling pathways, focuses on the molecular basis of CIE recycling regulation and elaborates on the latest progress and newly developed research model systems in the field of CIE recycling.

endocytic recycling; clathrin-dependent endocytosis; clathrin-independent endocytosis; recycling endosome; Rab; Arf; phosphoinositide; F-actin;

2019-05-06;

2019-06-03

國家杰出青年科學(xué)基金項目(編號：31825017) 資助[Supported by the National Science Fund for Distinguished Young Scholars (No. 31825017)]

林瓏，博士，副教授，研究方向：細胞內(nèi)物質(zhì)運輸調(diào)控。E-mail: longlin@hust.edu.cn

史岸冰，博士，教授，研究方向：囊泡循環(huán)運輸調(diào)控。E-mail: ashi@hust.edu.cn

10.16288/j.yczz.19-124

2019/6/6 11:30:43

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190606.1130.004.html

(責(zé)任編委: 苗龍)