李芳，黃青蕓，劉斯佳,,3,4，郭忠信,,3,4，熊欣欣，桂林，束會(huì)娟，黃紹明,4，譚國鶴,,3,4，劉媛媛,,3,4

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對(duì)小鼠胚胎期皮層神經(jīng)元放射狀遷移和軸突投射的影響

李芳1，黃青蕓2，劉斯佳1,2,3,4，郭忠信1,2,3,4，熊欣欣1，桂林2，束會(huì)娟1，黃紹明1,4，譚國鶴1,2,3,4，劉媛媛1,2,3,4

1. 廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧 530021 2. 廣西生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心,廣西再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021 3. 廣西醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心,長壽與老年相關(guān)疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021 4. 廣西特色新型智庫—中國-東盟腦科學(xué)創(chuàng)新發(fā)展研究中心，南寧 530021

大腦皮層的發(fā)育是腦結(jié)構(gòu)形成與功能建立的重要基礎(chǔ)，在此過程中，皮層神經(jīng)元放射狀遷移及胼胝體區(qū)的軸突投射是必不可少的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，該環(huán)節(jié)受基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，但相關(guān)的分子機(jī)制目前仍不明確。轉(zhuǎn)錄因子BMAL1 (brain and muscle Arnt-like protein1)是體內(nèi)重要的生物鐘節(jié)律因子之一，最新研究發(fā)現(xiàn)其還參與調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)祖細(xì)胞增殖，提示其與神經(jīng)發(fā)育存在潛在的相關(guān)性。為明確基因在大腦皮層發(fā)育中的具體作用，本研究首先通過RT-PCR和Real-time PCR檢測基因在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，基因在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)豐富，并且在發(fā)育期的大腦內(nèi)呈現(xiàn)特定的表達(dá)規(guī)律：在胚胎后期和出生后早期腦內(nèi)表達(dá)水平相對(duì)較高，以出生后第3 d為高峰。進(jìn)一步通過聯(lián)合使用小鼠子宮內(nèi)胚胎電轉(zhuǎn)和RNAi干擾方法敲減腦內(nèi)神經(jīng)元中的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胚胎期皮層神經(jīng)元的放射狀遷移發(fā)生了延遲，延遲程度與RNAi的敲減效率呈正相關(guān)，存在一定的基因劑量?效應(yīng)關(guān)系。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，在胚胎期腦內(nèi)神經(jīng)元中降低表達(dá)水平以后，胼胝體軸突向?qū)?cè)大腦半球的投射也出現(xiàn)了明顯的缺陷。上述研究結(jié)果表明，BMAL1是大腦皮層神經(jīng)元的放射狀遷移以及軸突投射發(fā)育過程中的一個(gè)重要的調(diào)控分子，為從轉(zhuǎn)錄因子角度深入理解大腦皮層發(fā)育的分子調(diào)節(jié)機(jī)制和尋找調(diào)控靶點(diǎn)提供了新的線索。

大腦皮層發(fā)育；；神經(jīng)元遷移；軸突投射；子宮內(nèi)胚胎電轉(zhuǎn)

哺乳動(dòng)物生物鐘基因編碼蛋白BMAL1含有bHLH (basic helix-loop-helix)- PAS (PER-ARNT- SIM)結(jié)構(gòu)域，該蛋白是生物鐘轉(zhuǎn)錄、翻譯反饋環(huán)中的核心部分,也是哺乳動(dòng)物晝夜節(jié)律起搏點(diǎn)不可缺少的組件[1]。CLOCK是BMAL1的一個(gè)重要分子伴侶，也具有類似的bHLH 和 PAS 結(jié)構(gòu)域[2]。BMAL1與CLOCK結(jié)合成異源二聚體，激活3種周期基因(和)和2種隱花色素基因 (和的表達(dá)，PER 和CRY蛋白形成分子復(fù)合體后進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而抑制BMAL1/CLOCK異源二聚體的活性，構(gòu)成了反饋性的負(fù)向環(huán)路[3,4]。在生物鐘調(diào)節(jié)過程中，BMAL1是核心的轉(zhuǎn)錄因子，該基因敲除小鼠(Bmal1)會(huì)喪失晝夜節(jié)律。有研究表明，BMAL1還與許多腦內(nèi)損傷現(xiàn)象有關(guān)。例如，新生大鼠的松果體中BMAL1蛋白在缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD) 48 h后表達(dá)會(huì)顯著升高[5]；缺乏會(huì)影響大腦的氧化還原穩(wěn)態(tài)，與神經(jīng)變性的癥狀產(chǎn)生以及學(xué)習(xí)記憶功能衰退有關(guān)[6,7]；臨床上帕金森病患者外周血中和基因的相對(duì)表達(dá)水平明顯降低[4]；最新研究還發(fā)現(xiàn)，在5周齡小鼠中敲除后，小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)的神經(jīng)祖細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，這可能是由于細(xì)胞周期失調(diào)所引起的[8]；在成年(10~15周齡)小鼠中敲除基因，海馬神經(jīng)祖細(xì)胞池也顯著減少，并且神經(jīng)祖細(xì)胞向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞譜系的轉(zhuǎn)移分化增多[9]。這些研究結(jié)果說明，對(duì)神經(jīng)祖細(xì)胞的有絲分裂活性有一定的促進(jìn)作用，在早期神經(jīng)元形成中可能起著重要的調(diào)節(jié)作用[9,10]。因此，可能會(huì)在神經(jīng)發(fā)育過程中發(fā)揮一定的潛在作用。本研究以小鼠大腦皮層發(fā)育為研究模型，深入探索基因在胚胎發(fā)育期神經(jīng)元放射狀遷移和軸突投射中的具體作用，以期增進(jìn)人們對(duì)大腦皮層發(fā)育分子調(diào)節(jié)機(jī)制的新認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 小鼠飼養(yǎng)

C57BL/6小鼠和ICR小鼠均由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，在廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)屏障系統(tǒng)內(nèi)繁育。

用于實(shí)驗(yàn)的母鼠以見陰栓的當(dāng)天記為胚胎0.5 d即E0.5，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求統(tǒng)計(jì)不同天數(shù)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。新生小鼠的年齡按照出生當(dāng)天記為P0，1月齡小鼠記為1 M，小鼠的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)為每籠5只，遵循12 h光照與12 h黑暗循環(huán)，自由飲食，室溫25±1℃。所有涉及動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)均在廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物管理和使用委員會(huì)許可下進(jìn)行，并遵循廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的相關(guān)倫理學(xué)規(guī)則。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

本研究所使用的敲減質(zhì)粒和攜帶EGFP的全長質(zhì)粒均由上海泰兒圖生物科技有限公司合成。含全長基因序列的質(zhì)粒構(gòu)建：首先在GenBank中查詢小鼠全長基因(GenBank登錄號(hào)：NM_001243048.1)序列，直接合成該基因。進(jìn)一步通過重疊PCR擴(kuò)增將基因序列與P2A-EGFP片段連接，經(jīng)Ⅰ和Ⅰ內(nèi)切酶酶切后將該片段連入pcDNA3.1(+)載體。敲減質(zhì)粒構(gòu)建：針對(duì)小鼠的靶向干擾序列構(gòu)建短發(fā)夾環(huán) RNA (shRNA)，然后克隆到pSUPER-basic載體，將無意序列構(gòu)建的質(zhì)粒(shRNA-Scr)作為陰性對(duì)照。質(zhì)粒構(gòu)建所用引物見表1。

針對(duì)小鼠的靶向干擾序列信息如下：

-shRNA-1#：5′-GGAAGGATCAAGAATGCAA-3′；

-shRNA-2#：5′-GCAACAGGCCTTCAGTAAA-3′；

-shRNA-3#：5′-GCGGAGGAAATCATGGAAA-3′；

-shRNA-scr：5′-CGCTGAGTACTTCGAAATGTC-3′。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

使用含10%胎牛血清(FBS)的細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM (Dulbecco modified eagle’s medium)培養(yǎng)HEK293細(xì)胞(由中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所提供)，并使用Lipofectamin 3000試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司，美國)進(jìn)行細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。以12孔細(xì)胞培養(yǎng)盤中的單個(gè)孔為例，具體步驟如下：在A管中加入50 μL Opti-MEM (OMEM)，混入0.5 μg攜帶EGFP的全長質(zhì)粒和0.5 μgshRNA質(zhì)粒以及2 μL P3000，在B管中加入50 μL OMEM，混入1.5 μL 脂質(zhì)體(Lipo3000)，靜置5 min，將A、B兩管的溶液混合，室溫靜置15 min；將培養(yǎng)細(xì)胞的12孔培養(yǎng)盤從培養(yǎng)箱中取出，直接滴入混勻后的AB液，于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；24 h后用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞圖像采集，然后收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白。

表1 本研究所用引物信息

1.4 Western blot

HEK293細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞總蛋白，利用Western blot驗(yàn)證RNAi的敲減效率。首先將細(xì)胞置于冰上，棄去培養(yǎng)液，PBS快速漂洗兩次，加入200 μL的2×蛋白上樣緩沖液裂解30 min，收集于1.5 mL EP管中，95℃變性15 min。取20 μL樣品用10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Bio-Rad)分離等效變性樣品，并在PVDF膜(Millipore)上進(jìn)行印跡。室溫封閉1 h，進(jìn)行一抗(Rabbit anti-GFP antibody，1:2000，美國Sigma公司；GAPDH Antibody (V-18) HRP，1:20000，美國Santa Cruz Biotechnology公司；)和二抗(HRP-conjugated goat anti-rabbit anti-bodies，1:50000，美國Santa Cruz Biotechnology公司)孵育，ECL反應(yīng)液顯影，全自動(dòng)成像系統(tǒng)掃描成像。

1.5 RNA提取、RT-PCR和Real-time PCR

收集不同發(fā)育期C57 BL/6小鼠的皮層腦組織 ( E12、E14、E16、E18、P0、P3、P7、P14、1M和2M)和P7時(shí)C57 BL/6小鼠的各臟器組織(大腦、小腦、脊髓、心、肝、肺、腎、胃、皮膚、肌肉、大腸和小腸)，稱量后立即加入Trizol，冰浴5 min后勻漿，加入氯仿震蕩15 s，冰上靜置10 min，4℃離心15 min。取上清，加入等體積的異丙醇，混勻，冰浴10 min，再次4℃離心15 min。離心后棄上清，75%酒精漂洗沉淀2次，室溫下晾干，以30~50 μL DEPC水溶解RNA，測定濃度，?80℃保存。

以提取的RNA為模板，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司，美國)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過RT-PCR擴(kuò)增，檢測在小鼠不同發(fā)育期的皮層腦組織中的表達(dá)情況和在 P7小鼠各組織器官中的表達(dá)情況。擴(kuò)增引物由桑尼公司(上海)合成，引物序列信息見表1。

以作為內(nèi)參基因，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，Tanon-2500凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集和分析。

根據(jù)SYBR Green I Premix Ex Taq試劑盒(TaKaRa公司，日本)說明書對(duì)上述反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA通過Real-time PCR擴(kuò)增，檢測在小鼠不同發(fā)育期的皮層腦組織中的表達(dá)情況。PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行溶解曲線分析，以判斷是否存在非特異性擴(kuò)增和引物二聚體。PCR擴(kuò)增結(jié)果以2M為對(duì)照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使用Prism 6.0軟件進(jìn)行作圖分析。

1.6 胚胎電轉(zhuǎn)

小鼠子宮內(nèi)胚胎電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[11]并有所修改。實(shí)驗(yàn)所用孕鼠為懷孕14.5 d (E14.5)的ICR孕鼠，質(zhì)粒為CAG-GFP質(zhì)粒(0.5 μg/μL，由中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所提供)和shRNA質(zhì)粒(1.5 μg/μL)。用于標(biāo)記的0.1%固綠 FCF購自美國Sigma公司、ECM830胚胎電轉(zhuǎn)儀購自美國BTX公司。程序?yàn)?0 ms、30 V電脈沖，5次，間隔1 s。手術(shù)過程中不斷使用預(yù)熱的0.85%無菌生理鹽水潤洗胚胎和手術(shù)切口，以保證胚胎始終濕潤。電轉(zhuǎn)完成后，將胚胎重新放回母鼠腹腔內(nèi)，縫合手術(shù)切口。術(shù)后孕鼠應(yīng)注意保暖。為了降低致死率及流產(chǎn)率，整個(gè)過程須在40 min內(nèi)完成。

1.7 免疫熒光染色

分別取E18.5和P3時(shí)電轉(zhuǎn)后的小鼠腦組織，浸泡在4%多聚甲醛中固定過夜。在恒冷式冰凍切片機(jī)上進(jìn)行連續(xù)冠狀冰凍切片，厚度為50 μm，在0.2% Triton X-100的封閉液中室溫孵育1 h。分別用一抗(Rabbit anti-GFP antibody，1:2000，美國Sigma公司；)和二抗(Alexa Fluor?488 donkey anti-Rabbit IgG (H+L)，1:2000，美國Life Technologies公司)進(jìn)行孵育，用Hoechst 33342 (終濃度2 μg/mL，上海碧云天生物公司)標(biāo)記細(xì)胞核，室溫孵育10 min，PBS漂洗3遍 (每次10 min)，貼片，90%甘油進(jìn)行封片，使用Thermo Fisher EVOS FL AUTO 2熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.8 圖像采集與統(tǒng)計(jì)分析

經(jīng)過脂轉(zhuǎn)的HEK293細(xì)胞與腦片免疫熒光染色結(jié)果利用顯微鏡成像，使用單張掃描法采集圖像數(shù)據(jù)。皮層神經(jīng)元胞體數(shù)量以及胼胝體的軸突長度用ImageJ軟件進(jìn)行分析。收集的數(shù)據(jù)用Prism 6.0軟件制圖，以SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析。所有統(tǒng)計(jì)分析都遵循隨機(jī)雙盲原則。數(shù)據(jù)以均數(shù)(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，各組間平均值差異程度用檢驗(yàn)(Student’stest)或者One-way ANOVA進(jìn)行檢驗(yàn)分析，*<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，**<0.01表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，***<0.001表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bmal1在小鼠大腦皮層發(fā)育過程中高表達(dá)

為研究在大腦皮層發(fā)育過程中的潛在作用，本研究首先利用RT-PCR擴(kuò)增P7小鼠各組織器官基因，分析在P7小鼠各組織器官中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在大腦、小腦、脊髓、心臟、肝臟、肺、腎、胃、皮膚、肌肉、大腸和小腸中均有不同程度的表達(dá)，其中在大腦中的表達(dá)量相對(duì)較高(圖1A)。進(jìn)一步通過RT-PCR擴(kuò)增不同發(fā)育階段小鼠(E12、E14、E16、E18、P0、P3、P7、P14、1M和2M)腦組織基因，分析該基因在腦內(nèi)的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在E12已有表達(dá)，在P3時(shí)期表達(dá)水平達(dá)到高峰，P14后基因表達(dá)明顯降低，在成年期表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定(圖1B)。本研究進(jìn)一步通過Real-time PCR方法檢測了在小鼠不同發(fā)育期的皮層腦組織中的表達(dá)情況，分析結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致(圖1C)。

以上結(jié)果說明在發(fā)育早期腦內(nèi)呈現(xiàn)一過性高表達(dá)，提示在腦內(nèi)的功能可能存在發(fā)育相關(guān)性，并在腦發(fā)育的特定階段中發(fā)揮潛在作用。

2.2 Bmal1 shRNAs質(zhì)粒的敲減效率

為進(jìn)一步探究在發(fā)育期腦內(nèi)的具體作用，本研究采用的短發(fā)夾環(huán) RNA (shRNA)敲減基因，并利用HEK293細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染驗(yàn)證3條shRNA質(zhì)粒的敲減效率。Western blot結(jié)果顯示，shRNA-1#和shRNA-2#質(zhì)粒的敲減效率明顯，而shRNA-3#質(zhì)粒敲減效果不明顯(圖2A)。與對(duì)照組相比，shRNA-1#和shRNA-2#敲減組GFP熒光強(qiáng)度明顯降低(圖2B)，而-shRNA-3#敲減組熒光亮度無明顯差異，這些結(jié)果表明本研究所構(gòu)建的shRNA- 1#和shRNA-2#干擾質(zhì)粒能夠有效地降低細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)。

2.3 降低Bmal1基因表達(dá)延緩了胚胎發(fā)育期皮層神經(jīng)元的放射狀遷移

為在胚胎期快速有效地干預(yù)基因的表達(dá)，本研究采用小鼠子宮內(nèi)胚胎電轉(zhuǎn)技術(shù)將基因的各個(gè)shRNA干擾質(zhì)粒和GFP蛋白質(zhì)粒(CAG-GFP質(zhì)粒)共同注射到E14.5胎鼠的側(cè)腦室，皮層電轉(zhuǎn)位置如圖3A所示。在直流電場作用下，這些質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入胎鼠大腦皮層的室管膜周圍細(xì)胞，通過觀察表達(dá)GFP熒光的神經(jīng)元位置及數(shù)量來評(píng)估基因的表達(dá)變化對(duì)神經(jīng)元放射狀遷移的具體影響。結(jié)果顯示，E18.5時(shí)對(duì)照組小鼠(電轉(zhuǎn)shRNA-Scr)的大腦皮層內(nèi)，皮質(zhì)板區(qū)(CP)有大量表達(dá)GFP的細(xì)胞，說明神經(jīng)元可以順利遷移(圖3，B和C)；-shRNA-1#質(zhì)粒與GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)，結(jié)果顯示小鼠腦內(nèi)表達(dá)GFP熒光的細(xì)胞主要集中于大腦皮層的中間區(qū)(IZ)和腦室及腦室下區(qū)(VZ/SVZ)，而在CP區(qū)只有少量神經(jīng)元遷移到位(圖3，B和C)，說明神經(jīng)元遷移發(fā)生障礙；當(dāng)轉(zhuǎn)入-shRNA-2#質(zhì)粒時(shí)，仍有大部分神經(jīng)元停留在IZ和VZ/SVZ區(qū)；而轉(zhuǎn)入-shRNA-3#質(zhì)粒對(duì)進(jìn)行干擾后，表達(dá)GFP熒光的細(xì)胞位置相比對(duì)照組沒有明顯差異(圖3，B和C)。

圖1 發(fā)育期小鼠腦內(nèi)Bmal1基因表達(dá)情況

A：RT-PCR檢測mRNA在P7小鼠各臟器組織中的表達(dá)；B：RT-PCR檢測mRNA在不同發(fā)育階段小鼠腦組織中的表達(dá)；C：Real-time PCR檢測mRNA在不同發(fā)育階段的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)以平均值±S.E.M表示，=3；*<0.05 表示與對(duì)照組2M相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，***<0.001 表示與對(duì)照組2M相比統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著。

圖2 Bmal1shRNAs質(zhì)粒敲減效率

A：Western blot方法檢測HEK293細(xì)胞脂轉(zhuǎn)后shRNA的敲減效率；B：通過觀察熒光強(qiáng)度檢測HEK293細(xì)胞脂轉(zhuǎn)后shRNA的敲減效率。標(biāo)尺=55 μm。

為明確對(duì)神經(jīng)元放射狀遷移的具體影響，本研究用shRNA-2#質(zhì)粒與CAG-GFP質(zhì)粒進(jìn)行小鼠子宮內(nèi)胚胎共電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，然后對(duì)電轉(zhuǎn)后P3時(shí)期的幼鼠進(jìn)行灌注切片繼續(xù)觀察，延長實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間。結(jié)果顯示：在胚胎期對(duì)進(jìn)行敲減，P3時(shí)shRNA-Scr組和shRNA-2#組的神經(jīng)元大部分已遷移到Ⅱ-Ⅲ層(圖4A)，其中在Ⅱ-Ⅲ層中，shRNA-Scr組帶有GFP熒光的細(xì)胞數(shù)目占97.7%，shRNA-2#組為88.6%，兩組相比值為0.15；在Ⅳ-Ⅵ層中，shRNA-Scr組帶有GFP熒光的細(xì)胞數(shù)目占2.2%，shRNA-2#組為11.1%，兩組相比值為0.16；在VZ/SVZ中，shRNA-Scr 組帶有GFP熒光的細(xì)胞數(shù)目占0.18%，sRNA-2#組為0.31%，兩組相比值為0.7 (圖4B)。

綜合以上研究結(jié)果，在胚胎早期敲減，造成了皮層神經(jīng)元放射狀遷移發(fā)生延緩。

2.4 Bmal1表達(dá)下調(diào)影響了對(duì)側(cè)大腦半球胼胝體的軸突生長

在小鼠大腦胼胝體系統(tǒng)的正常發(fā)育模式中，Ⅱ-Ⅲ層的錐體神經(jīng)元將軸突投射到中線和對(duì)側(cè)大腦皮層，形成胼胝體，同樣這些神經(jīng)元的胼胝體投射也具有層和區(qū)域特異性[12,13]。為研究與小鼠大腦胼胝體軸突投射的關(guān)系，本研究利用小鼠子宮內(nèi)胚胎電轉(zhuǎn)方法，將shRNA質(zhì)粒與CAG- GFP質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入E14.5胎鼠的側(cè)腦室，然后在 P3進(jìn)行灌注取腦，經(jīng)冠狀切片和免疫熒光染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲減后胼胝體軸突向?qū)?cè)投射的長度變短(圖5A)，其中shRNA-Scr組平均長度為6294.76 μm，shRNA-2#組平均長度為3657.3 μm，兩組相比值為0.006 (圖5B)。這些數(shù)據(jù)表明，在大腦發(fā)育過程中，對(duì)于胼胝體內(nèi)軸突的生長和投射是必需的。

圖3 Bmal1基因表達(dá)下調(diào)對(duì)皮層神經(jīng)元放射狀遷移的影響

A：觀察子宮內(nèi)胚胎電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)具體皮層電轉(zhuǎn)位置。B：子宮內(nèi)胚胎電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)觀察敲減對(duì)E18.5小鼠神經(jīng)元遷移的影響。切片用Hoechst 33324(藍(lán)色)染色，標(biāo)記相應(yīng)皮層；CP：皮質(zhì)板區(qū)；IZ：中間區(qū)；VZ：腦室；SVZ：腦室下區(qū)；標(biāo)尺=125 μm。C：每個(gè)區(qū)域中 GFP 陽性細(xì)胞所占總陽性細(xì)胞百分比統(tǒng)計(jì)圖。結(jié)果以平均值±S.E.M表示；每個(gè)發(fā)育階段收集3只小鼠腦片；*<0.05表示與-shRNA-Scr組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，**<0.01表示與-shRNA-Scr組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

圖4 Bmal1基因表達(dá)下調(diào)對(duì)P3期皮層神經(jīng)元放射狀遷移的影響

A：子宮內(nèi)胚胎電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)觀察敲減對(duì)P3小鼠神經(jīng)元遷移的影響(標(biāo)尺=125 μm)；B：每個(gè)區(qū)域中 GFP 陽性細(xì)胞所占總陽性細(xì)胞百分比的統(tǒng)計(jì)圖。每組樣本數(shù)量=3，結(jié)果以平均值±S.E.M表示。

圖5 敲減Bmal1基因?qū)﹄蓦阵w軸突投射的影響

A：子宮內(nèi)胚胎電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)觀察敲減對(duì)胼胝體軸突投射的影響。箭頭表示軸突生長的末端，右側(cè)是左側(cè)方框區(qū)域的放大圖，標(biāo)尺= 450 μm。B：軸突末端距離電轉(zhuǎn)中線的距離。數(shù)據(jù)以平均值±S.E.M表示，**<0.01 表示與shRNA-Scr組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

3 討論

大腦皮層發(fā)育是腦行使高級(jí)認(rèn)知功能的基礎(chǔ)，皮層發(fā)育異常會(huì)引起不同程度的后果，甚至導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及精神類疾病發(fā)生，如大腦發(fā)育畸形、智力發(fā)育障礙、癲癇等[14,15]。作為大腦發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，神經(jīng)元放射狀遷移及胼胝體軸突正常投射顯得尤為重要。

BMAL1是體內(nèi)重要的生物鐘節(jié)律因子之一，最新研究發(fā)現(xiàn)基因不僅在調(diào)控生物的晝夜節(jié)律中發(fā)揮一定作用，而且還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的有絲分裂活性從而影響海馬神經(jīng)祖細(xì)胞增殖[16]，這提示基因與神經(jīng)發(fā)育之間具有潛在的聯(lián)系，但是該基因在胚胎期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的作用仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)育期小鼠的各臟器組織中都有表達(dá)，但在大腦中表達(dá)相對(duì)最為顯著，提示在大腦發(fā)育的過程中可能起著特定的作用。在大腦皮層發(fā)育過程中，首批皮質(zhì)投射神經(jīng)元在E11.5時(shí)開始出現(xiàn)，而后遷移形成新生的皮質(zhì)板區(qū)，繼而發(fā)展成出生后大腦新皮質(zhì)的第Ⅱ-Ⅵ層[17]，本研究發(fā)現(xiàn)，從E12開始就已經(jīng)在腦內(nèi)表達(dá)，在P3時(shí)期的腦內(nèi)達(dá)到表達(dá)高峰，至P7時(shí)仍有很高的表達(dá)，而此階段也正是大腦皮層神經(jīng)元放射狀遷移以及胼胝體投射神經(jīng)元軸突生長的關(guān)鍵時(shí)期。這提示，基因可能在大腦發(fā)育過程中皮層神經(jīng)元的放射狀遷移以及胼胝體神經(jīng)元軸突投射中發(fā)揮著重要的作用。

大腦皮層的發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)的過程，在正常情況下，這種過程受多種信號(hào)通路協(xié)同調(diào)控以及細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)平衡來完成[18]，這對(duì)于后續(xù)神經(jīng)環(huán)路以及神經(jīng)系統(tǒng)功能的正常發(fā)揮起著重要作用。大量研究表明，在細(xì)胞分裂周期或者在細(xì)胞骨架形成過程中扮演重要角色的蛋白質(zhì)分子，如參與調(diào)控細(xì)胞骨架中肌動(dòng)蛋白絲狀分支的N-WASP蛋白，下調(diào)或者過表達(dá)N-WASP均會(huì)造成大腦皮層神經(jīng)元遷移障礙[19]；與智力障礙相關(guān)的候選基因成纖維細(xì)胞生長因子13 (FGF13)及其受體在神經(jīng)發(fā)育早期具有調(diào)節(jié)功能，沉默F(xiàn)GF13的表達(dá)可以增加嚙齒動(dòng)物胼胝體神經(jīng)元軸突的分枝[20]；SOX5 (L-SOX5)作為轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)神經(jīng)元遷移、分化和深層神經(jīng)元的軸突投射都有著重要作用[21]。本研究利用小鼠子宮內(nèi)胚胎電轉(zhuǎn)的方法結(jié)合RNAi技術(shù)分析小鼠大腦中基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)基因敲減的小鼠在E18.5時(shí)皮層大部分神經(jīng)元仍位于皮層的深層IZ和VZ/SVZ區(qū)，在P3時(shí)大部分遷移到了皮質(zhì)的淺層。因此，在胚胎期敲減基因延緩了皮層神經(jīng)元的放射狀遷移。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)在E14.5時(shí)對(duì)基因進(jìn)行敲減后，可使P3小鼠胼胝體投射神經(jīng)元的軸突延長發(fā)生障礙。綜合以上研究結(jié)果，降低基因在腦內(nèi)的表達(dá)，不僅會(huì)影響皮層神經(jīng)元的放射狀遷移而且對(duì)胼胝體投射神經(jīng)元的軸突延伸也發(fā)揮著重要的作用。本研究初步闡明了在大腦發(fā)育過程中的調(diào)節(jié)功能，揭示了皮層神經(jīng)元發(fā)育調(diào)控的一個(gè)新分子機(jī)制，并為今后進(jìn)一步了解在發(fā)育期腦內(nèi)的生理作用以及相關(guān)腦疾病發(fā)病機(jī)制提供了新的科學(xué)依據(jù)。BMAL1作為重要的生物鐘調(diào)節(jié)因子，既可以參與小鼠晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)，又參與小鼠大腦神經(jīng)發(fā)育系統(tǒng)的調(diào)控。在調(diào)節(jié)生物晝夜節(jié)律的負(fù)反饋環(huán)路中，BMAL1作為轉(zhuǎn)錄因子與周期基因啟動(dòng)子上的E-box相結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。最新研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎期敲除基因也可以影響神經(jīng)元的遷移[22]。負(fù)反饋環(huán)路有多個(gè)分子參與，那么在這一環(huán)路中的其他分子是否也參與了胚胎發(fā)育期大腦皮層神經(jīng)元的發(fā)育調(diào)控？仍有待進(jìn)一步研究。因此，尋找BMAL1在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮功能的下游底物或相互作用分子將更有利于人們了解BMAL1在體內(nèi)的正常功能和致病機(jī)制方面的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)基因?qū)ε咛テ谄由窠?jīng)元的放射狀遷移和胼胝體投射神經(jīng)元的軸突延伸是必不可少的。

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The role ofin neuronal radial migration and axonal projection of the embryonic mouse cerebral cortex

Fang Li1, Qingyun Huang2, Sijia Liu1,2,3,4, Zhongxin Guo1,2,3,4, Xinxin Xiong1, Lin Gui2, Huijuan Shu1, Shaoming Huang1,4, Guohe Tan1,2,3,4, Yuanyuan Liu1,2,3,4

Normal development of the cerebral cortex is a basis for the formation and function of mammalian brains. During this process, the radial migration of cortical neurons, as well as the axon projection into specific layers, are the most important steps regulated by some transcription factors, but the underlying molecular mechanisms are still obscure. BMAL1 (brain and muscle Arnt-like protein 1) is a newly identified transcription factor that plays important roles in the circadian rhythms. It was recently found to regulate the proliferation of hippocampal neuronal progenitor/precursor cells (NPCs), implicatingin the brain development. Here we employed both RT-RCR and real-time PCR to explore the expression pattern of thegene in the developing brain. We found BMAl1 is enriched in the brain cortex during the perinatal stages and peaked in P3 mouse brains. Combined with in utero electroporation and interference with RNAi, we found that reducing the expression level ofin neurons, the radial migration of embryonic cortical neurons was largely delayed, in a gene dose-effect pattern. Moreover, reducing the level ofexpression in mouse brains, the axonal projection in the corpus callosum was also disrupted from ipsilateral to the lateral cerebral hemisphere. These findings indicate that BMAL1is essential for the radial migration of neurons in the cerebral cortex and the axonal projection of the corpus callosum, providing insights into the molecular mechanisms of cerebral cortex development..

cortical development;; neuronal migrationaxon projection; in utero electroporation

2019-05-05;

2019-05-28

廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：YCSW2018115，YCSW2017113，YCSW2019102，JGY2017039)，廣西“新世紀(jì)十百千人才工程”項(xiàng)目(2015) (編號(hào)：201501)，廣西杰出青年基金項(xiàng)目(編號(hào)：2015GXNSFGA139005)和廣西科技基地與人才專項(xiàng)(編號(hào)：桂科AD17195079)資助[Supported by the Innovation Project of Guangxi Graduate Education (Nos. YCSW2018115, YCSW2017113, YCSW2019102, JGY2017039), the New Centuary Ten, Hundred, and Thousand Talent Project of Guangxi Province (No. 201501), the Natural Science Foundation for Distinguished Young Scholars of Guangxi Province (No. 2015GXNSFGA139005) and the Special Project for Platforms and Talents of Science and Technology Foundation of Guangxi Province (No. AD17195079)]

李芳，碩士研究生，專業(yè)方向：人體解剖與組織胚胎學(xué)。E-mail: 1689795367@qq.com

劉媛媛，博士，副教授，研究方向：干細(xì)胞與神經(jīng)發(fā)育再生。E-mail: 382890945@qq.com

譚國鶴，博士，教授，研究方向：腦疾病和神經(jīng)發(fā)育的分子細(xì)胞機(jī)制。E-mail: tanguohe@gxmu.edu.cn

10.16288/j.yczz.19-123

2019/6/6 11:30:39

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190606.1130.002.html

(責(zé)任編委: 王曉群)