李澤琴，李錦濤，邴杰，張根發(fā)

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擬南芥APX家族基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育與非生物逆境脅迫響應(yīng)中的作用分析

李澤琴1，李錦濤1，邴杰2，張根發(fā)2

1. 山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，太原 030001 2. 北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，抗性基因資源與分子發(fā)育北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100875

活性氧造成的氧化脅迫是植物主要非生物逆境脅迫之一。在不利的生長(zhǎng)條件下，植物細(xì)胞內(nèi)的各種代謝過程不協(xié)調(diào)可導(dǎo)致過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)含量增加，從而對(duì)細(xì)胞造成多種威脅和傷害。抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)是植物中清除H2O2的一種重要酶，擬南芥() APX家族包括8個(gè)成員：APX1~APX6、sAPX和tAPX。本研究以擬南芥野生型和突變體為材料，對(duì)擬南芥不同發(fā)育時(shí)期和不同逆境脅迫下的8種基因表達(dá)模式進(jìn)行了分析，同時(shí)研究了其相應(yīng)的缺失突變體對(duì)鹽、干旱和熱脅迫的耐受性。mRNA差異表達(dá)模式分析顯示：在擬南芥生長(zhǎng)的第4~8周，表達(dá)量最高，表達(dá)量最低，、和隨著生長(zhǎng)發(fā)育的時(shí)間進(jìn)程表達(dá)量逐漸減少，但表達(dá)量不斷增加；在非生物脅迫下，、和受熱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)明顯，響應(yīng)鹽脅迫，和對(duì)鹽、干旱和熱脅迫均表現(xiàn)出明顯的誘導(dǎo)表達(dá)應(yīng)答。鹽和干旱脅迫耐受性分析結(jié)果表明：無論是在擬南芥的萌發(fā)期還是成熟期，任何一個(gè)基因缺失均使抗逆性降低；在萌發(fā)期，與鹽脅迫相比，突變體對(duì)干旱脅迫更敏感；在成熟期，與野生型和其他突變體相比，和對(duì)鹽和干旱脅迫更加不耐受。生理指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示：干旱脅迫10 d后，所有突變體植株中的H2O2含量均明顯高于野生型，其中、和中最高；鹽脅迫5 d后，突變體中丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量顯著高于野生型；熱脅迫2 h就會(huì)導(dǎo)致、和中H2O2和MDA含量大幅增加，其中在中最高。本研究結(jié)果表明，擬南芥基因家族的8個(gè)成員均不同程度地參與植物生長(zhǎng)發(fā)育及非生物脅迫響應(yīng)的過程，在不同發(fā)育時(shí)期或逆境響應(yīng)過程有特定的一種或幾種APX發(fā)揮主要作用。

擬南芥()；抗壞血酸過氧化物酶(APX)；活性氧(ROS)；逆境響應(yīng)

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中會(huì)受到各種各樣的環(huán)境脅迫，如干旱、冷凍、高鹽、重金屬和高溫等非生物脅迫，以及病毒和真菌等生物脅迫。不良的環(huán)境刺激可導(dǎo)致過量活性氧(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生，并通過脂質(zhì)過氧化和蛋白氧化作用損傷DNA以及其他細(xì)胞成分，對(duì)植物細(xì)胞造成嚴(yán)重的傷害。ROS以自由基和非自由基兩種形式存在，自由基狀態(tài)包括超氧自由基(O2-)、羥自由基(OH)等，非自由基狀態(tài)包括過氧化氫(H2O2)和單線態(tài)氧(1O2)[1,2]。ROS主要在葉綠體、過氧化物酶體和線粒體中產(chǎn)生，但也會(huì)作為脅迫誘導(dǎo)或常規(guī)代謝途徑的副產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)外體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生[1]。ROS產(chǎn)生速率受環(huán)境條件的影響，如在強(qiáng)光照條件下，終端電子受體NADP+消耗殆盡，光合電子傳遞鏈過度還原，促進(jìn)ROS產(chǎn)生[2]。ROS具有雙重功能：一方面適量的活性氧為生物體所必須，作為信號(hào)分子參與信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控；另一方面，過量的活性氧對(duì)細(xì)胞有毒害作用，須盡快清除[3,4]。因此，細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除的平衡十分重要，植物會(huì)通過酶或非酶機(jī)制維系機(jī)體活性氧的動(dòng)態(tài)平衡，并在進(jìn)化過程中形成了完整的抗氧化系統(tǒng)[5,6]。

清除活性氧的過氧化物酶系在生物體內(nèi)普遍存在，包括谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)、過氧化氫酶(catalase, CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)。APX是非常有效的H2O2清除劑，在所有H2O2代謝酶中，其與H2O2的親和力最高[7]。植物APX屬于Ⅰ型血紅素過氧化物酶和銅氧化酶家族，可通過抗壞血酸(ascorbic acid, ASA)-谷胱甘肽(glutathione, GSH)循環(huán)，以ASA為電子供體將H2O2還原為O2和H2O[2]。

APX廣泛存在于綠色植物、藻類和具有葉綠體的原生生物中[8]。根據(jù)亞細(xì)胞定位，高等植物APX分為4個(gè)亞家族，分別是細(xì)胞質(zhì)APX、線粒體APX、葉綠體APX和過氧化物酶體APX[6]。水稻() APX家族有8個(gè)成員，分別位于細(xì)胞質(zhì)(OsAPX1和OsAPX2)、過氧化物酶體(OsAPX3和OsAPX4)、線粒體(OsAPX6)和葉綠體(OsAPX7和OsAPX8)，OsAPX5同時(shí)定位于線粒體和葉綠體中[9~11]。擬南芥()APX家族也有8個(gè)成員，APX1、APX2和APX6位于細(xì)胞質(zhì)，APX3和APX5位于過氧化物酶體，APX4、sAPX和tAPX位于葉綠體，其中APX4是一種類囊體腔蛋白，tAPX結(jié)合在類 囊體膜上，sAPX同時(shí)結(jié)合在葉綠體基質(zhì)和線粒體 上[3,12~14]。全基因組分析發(fā)現(xiàn)，番茄()有7個(gè)APX編碼基因[15]。其他植物如菠菜(L.)、豇豆()等由于全基因組序列未知，只發(fā)現(xiàn)了部分APX[16]。

Teixeira等[10]對(duì)水稻APX家族基因進(jìn)行了系統(tǒng)研究，檢測(cè)了野生型水稻在正常生長(zhǎng)發(fā)育過程中的表達(dá)量及其在鹽脅迫條件下的表達(dá)量變化。而擬南芥的8個(gè)APX中，只有APX1和葉綠體APX 研究較多，其他APX在擬南芥正常生長(zhǎng)發(fā)育和各種非生物脅迫響應(yīng)過程中的作用鮮有研究報(bào)道[3,12,17~24]。本文以擬南芥野生型和突變體為材料，對(duì)擬南芥在不同發(fā)育時(shí)期和不同逆境脅迫下APX家族的8個(gè)基因的表達(dá)模式以及相應(yīng)突變體對(duì)鹽、干旱和熱脅迫的耐受性進(jìn)行了系統(tǒng)的探究，以揭示擬南芥APX家族成員在植物正常生長(zhǎng)發(fā)育和非生物逆境脅迫響應(yīng)中的作用。

1 材料和方法

1.1 載體、菌株和實(shí)驗(yàn)材料

克隆載體pMD 18-T Simple Vector購自日本TaKaRa公司；大腸桿菌克隆表達(dá)菌株DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金公司；野生型擬南芥(, Columbia Ecotype)由張根發(fā)教授實(shí)驗(yàn)室保存；擬南芥APX家族基因T-DNA插入雜合突變體(SALK_143111)、(SALK_057686C)、(SALK_017480C)、(SALK_119726)、(SALK_075060C)、(WiscDsLox321c09)、(SALK_083737C)和(SALK_027804C)種子購于美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)擬南芥生物資源中心(Biological Resource Center, ABRC)。

1.2 突變體篩選以及鑒定

1.2.1 擬南芥基因組DNA粗提取

從生長(zhǎng)4周的植株上選取約1.0 cm×1.2 cm大小的葉片(不考慮葉齡和葉位)放入1.5 mL離心管中，置于液氮中速凍并搗碎。加入400 μL Gp1 buffer (購自北京天根生化科技有限公司，以下簡(jiǎn)稱天根)，用移液器吹勻，再加入400 μL氯仿。13 000 ×離心10 min，將300 μL上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入300 μL異丙醇，顛倒混勻，?20℃放置20 min。13 000 ×離心10 min，沉淀DNA，去除上清液，用70%的乙醇洗滌沉淀，13 000 ×離心5 min，去除上清液，常溫干燥DNA 15 min，用20 μL無菌水溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 T-DNA插入純合突變體篩選以及插入位點(diǎn)鑒定

將擬南芥突變體種子播種于含卡那霉素(Kan, 50 μg/mL)的MS培養(yǎng)基(1 L MS固體培養(yǎng)基含4.4 g MS粉、30 g蔗糖、7 g瓊脂粉，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至5.8，121℃高壓滅菌20 min)上進(jìn)行篩選。培養(yǎng)10 d后，將正常生長(zhǎng)的小苗移栽到營(yíng)養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)。生長(zhǎng)3周后，提取葉片基因組DNA (方法見1.2.1)，以其為模板，通過PCR擴(kuò)增鑒定純合突變體。鑒定擬南芥8個(gè)突變體所用的引物由美國(guó)索爾科研究所基因組分析實(shí)驗(yàn)室(http://signal.salk. edu/tdnaprimers.2.html)完成，引物序列見附表1。以各個(gè)突變體基因組DNA為模板，利用上下游引物(引物信息見附表1)分別擴(kuò)增8個(gè)基因，經(jīng)電泳分離并經(jīng)膠回收后連接到pMD18-T克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆，經(jīng)鑒定后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，分析測(cè)序序列即可確定突變體中T-DNA的精確插入位點(diǎn)。

1.2.3 擬南芥T-DNA插入純合突變體中目的基因表達(dá)檢測(cè)

將8種擬南芥純合突變體種子種在營(yíng)養(yǎng)土(營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=3∶1)中萌發(fā)，待其生長(zhǎng)至第5周時(shí)，用RNeasy Plant Mini Kit試劑盒(荷蘭Qiagen公司)提取各突變體植株的總RNA，用RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0試劑盒(日本TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以合成的cDNA為模板，利用特異引物半定量RT-PCR擴(kuò)增每種突變體相應(yīng)的基因(~、和)，引物序列見附表1。以(GenBank登錄號(hào)：U41998)基因?yàn)閮?nèi)參，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。由于部分基因的表達(dá)量極低，取材之前對(duì)相應(yīng)的突變體植株進(jìn)行一定程度的脅迫處理，使其表達(dá)量易于檢測(cè)。其中，用于檢測(cè)的突變體材料于45℃放置2 h；用于檢測(cè)、和的突變體材料用200 mmol/L NaCl處理12 h。

1.2.4 擬南芥T-DNA插入純合突變體APX活性檢測(cè)

分別稱取1 g突變體或野生型擬南芥葉片，迅速置于預(yù)冷的研缽中，加入5 mL APX提取液[50 mmol/L PBS(K2HPO4-KH2PO4緩沖液)，pH 7.8；2 mmol/L ASA；5 mmol/L EDTA]，于冰水浴條件下快速充分研磨，勻漿置于離心管中，18000 ×、4℃離心40 min，收集上層清液備用。用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定APX活性。

每次檢測(cè)從10株生長(zhǎng)4周的植株中隨機(jī)取葉片(不考慮葉位和葉齡)，每批檢測(cè)3次，設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 APX基因表達(dá)定量分析

1.3.1 擬南芥APX家族基因本底表達(dá)量研究

野生型擬南芥種子春化處理3 d后，播種于滅菌的營(yíng)養(yǎng)土中，保鮮膜(扎有小孔)覆蓋3~5 d，種子全部萌發(fā)后去除保鮮膜。每隔3 d澆一次水，前3次用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌[945 mg/L Ca(NO3)2，506 mg/L KNO3，80 mg/L NH4NO3，136 mg/L KH2PO4，493 mg/L MgSO4，鐵鹽溶液2.5 mL (500 mL蒸餾水中溶有2.78 g FeSO4·7H2O，3.73 g Na2EDTA·H2O，pH 5.5)，微量元素混合溶液5 mL (每升蒸餾水中含0.83 mg KI，6.2 mg H3BO3，22.3 mg MnSO4，8.6 mg ZnSO4，0.25 mg Na2MoO4·2H2O，0.025 mg CuSO4，0.025 mg CoCl2)，pH 6.0]，幼苗分別生長(zhǎng)至第4、6和8周時(shí)，利用RNeasy Plant Mini Kit試劑盒(Qiagen公司)提取擬南芥葉片總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，應(yīng)用分光光度計(jì)檢測(cè)其純度以及濃度。運(yùn)用TransScriptTMOne-Step gDNA removal and a cDNA synthesis SuperMix kit試劑盒(全式金公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板，利用每個(gè)基因的特異引物進(jìn)行Real-time qPCR (qRT-PCR)擴(kuò)增，以基因?yàn)閮?nèi)參基因，設(shè)= 100REU (relative expression units)。每次檢測(cè)從10株植株中隨機(jī)剪取葉片，每批檢測(cè)3次，設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。實(shí)時(shí)定量所用引物序列見附表1。

1.3.2 鹽、干旱和熱脅迫下擬南芥APX家族基因表達(dá)模式變化

砂培種植的擬南芥生長(zhǎng)至1個(gè)月時(shí)，分別用含200 mmol/L NaCl和300 mmol/L甘露醇的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌處理72 h，分別于處理0 h、4 h、8 h、12 h、24 h和72 h時(shí)剪取葉片；或在45℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，分別于0 h、0.5 h、1 h、2 h和3 h時(shí)取樣，用鋁箔紙包好迅速置于液氮中冷凍，再放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。利用RNeasy Plant Mini Kit試劑盒(Qiagen公司)提取RNA，運(yùn)用TransScriptTMOne-Step gDNA removal and a cDNA synthesis SuperMix kit試劑盒(全式金公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以此為模板，利用每個(gè)基因的特異引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，所用引物序列同1.3.1。每次檢測(cè)從10株植株中隨機(jī)取葉片，每批檢測(cè)3次，設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.4 鹽和干旱脅迫處理后的表型觀察

1.4.1 種子萌發(fā)以及幼苗生長(zhǎng)期的脅迫處理

將表面消毒(0.1% HgCl消毒5 min，滅菌蒸餾水清洗5次，每次3 min)的擬南芥種子于4℃春化處理2~3 d后，播種于含NaCl(分別為0、50、100、150或200 mmol/L)或甘露醇(分別為0、100、200、300或400 mmol/L)的MS培養(yǎng)基上，置于植物培養(yǎng)間(培養(yǎng)間條件為：溫度22℃，相對(duì)濕度60%~70%，16 h光照/8 h黑暗，光照強(qiáng)度110 μmol /m2s)，MS板垂直擺放。7 d后統(tǒng)計(jì)胚根萌發(fā)率，10 d后統(tǒng)計(jì)幼苗的根長(zhǎng)。每個(gè)株系每個(gè)MS板中點(diǎn)種40粒，每次同時(shí)培養(yǎng)兩板，共80粒，設(shè)2個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.4.2 對(duì)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)后期以及生殖生長(zhǎng)期植株的脅迫處理

將野生型擬南芥和純合突變體種子表面消毒，4℃春化處理3 d，點(diǎn)種在MS固體培養(yǎng)基上，放入植物培養(yǎng)間培養(yǎng)。7 d后，將生長(zhǎng)情況一致的幼苗移栽至裝有滅菌營(yíng)養(yǎng)土(營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=3∶1)的育苗小方盆(口徑7 cm，高8 cm)中，每個(gè)小盆種9株。繼續(xù)在植物培養(yǎng)間培養(yǎng)，每3 d澆一次水，待植株生長(zhǎng)至第4周(開花前)時(shí)進(jìn)行以下操作：(1)接受鹽脅迫的植株，第一次用50 mmol/L的NaCl澆灌，以后每次澆灌均增加50 mmol/L NaCl，直至NaCl終濃度達(dá)到200 mmol/L為止，每3 d澆灌一次，鹽脅迫持續(xù)28 d。每周定期拍照記錄生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)植株的存活率；(2)接受干旱脅迫的植株，從第4周開始停止給水，其他生長(zhǎng)條件不變，每周定期拍照記錄生長(zhǎng)情況，21 d后復(fù)水，復(fù)水3 d后統(tǒng)計(jì)植株存活率。每個(gè)株系每批種植36株(9株/盆×4盆)，設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.5 突變體和野生型植株中H2O2和MDA含量檢測(cè)

將生長(zhǎng)4周的擬南芥植株分為4組：第1組用200 mmol/L NaCl脅迫處理，分別于處理后的6 h、24 h、72 h和5 d取葉片；第2組干旱處理，分別在干旱5 d和10 d后取葉片；第3組熱脅迫處理，在45℃的培養(yǎng)箱中放置2 h，然后立即取葉片；第4組作為對(duì)照。所有材料凍存于-80℃冰箱中備用。

利用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定H2O2、MDA和葉片總蛋白含量。

1.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用平均值(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示；用生物學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差(One-way ANOVA)分析；用SigmaPlot 12.5軟件制作柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥APX家族基因T-DNA插入純合突變體篩選與鑒定

通過基因組DNA檢測(cè)篩選出8個(gè)基因的純合突變體，對(duì)其T-DNA插入位置進(jìn)行分析。測(cè)序結(jié)果顯示，突變體中T-DNA插入基因的第4個(gè)外顯子，在翻譯起始密碼之后第803~804 bp之間(+803~+804)；、、、、、和中T-DNA分別插入、、、、、和基因的第1個(gè)外顯子、第7個(gè)內(nèi)含子、第9個(gè)外顯子、3￠UTR、第7個(gè)外顯子、第1個(gè)外顯子和5￠UTR (圖1A)。RNA檢測(cè)結(jié)果表明，8個(gè)突變體中相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄均被抑制(圖1B)。APX活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，、和3個(gè)突變體中酶活降低最顯著(<0.01)，、、和中APX活性也明顯降低(<0.05)，中無明顯變化(圖1C)。

2.2 擬南芥APX家族基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量

本研究對(duì)擬南芥APX家族8個(gè)基因在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量進(jìn)行了分析，結(jié)果見圖2所示。8個(gè)基因在第4、6和8周的表達(dá)量不同。、和在第4周表達(dá)量最高，此后逐漸減少，第8周最少，和在第4周和第8周的mRNA量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(<0.05)；、、和在第6周表達(dá)最多，第4周均多于第8周，和在第6周與第8周的表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(<0.05)；而隨著植株成熟以及衰老mRNA表達(dá)量不斷增加，第4周最少，第8周最多，且兩個(gè)時(shí)期之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(<0.05)。除與生長(zhǎng)發(fā)育周期有關(guān)外，在相同時(shí)期，各個(gè)基因的表達(dá)量也有較大差別。無論第4、6還是第8周，的表達(dá)量均最多，平均為80 REU；表達(dá)量最少，均小于0.2 REU；其次為，mRNA量在0.25~ 0.45 REU之間；和在3個(gè)檢測(cè)期的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，約為25 REU，介于6~ 9 REU之間；在3個(gè)檢測(cè)期的表達(dá)差異比較大，尤其是第4、6周與第8周之間(<0.05)，介于4~ 15 REU間；的差異最大，第4周表達(dá)量高達(dá)65 REU，而第8周小于10 REU (<0.01)。

圖1 純合突變體篩選與鑒定

A：突變體中T-DNA精確插入位點(diǎn)。黑色方框代表基因的外顯子，黑色方框之間的細(xì)線代表內(nèi)含子，白色方框代表UTR區(qū)，倒三角形指示的位置為T-DNA插入位點(diǎn)；表示缺失突變體，1941 bp表示基因的mRNA長(zhǎng)，其他以此類推；0.2 kb表示長(zhǎng)度比例；最右邊是T-DNA在每個(gè)基因中的精確插入位置；B：突變體中相應(yīng)基因的mRNA表達(dá)情況；C：突變體和野生型株系的APX活性。誤差線上方用不同的小寫字母(a~e)標(biāo)示代表彼此間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(<0.05)，若用相同字母標(biāo)示說明無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 鹽、滲透和熱脅迫對(duì)擬南芥APX家族基因表達(dá)的影響

為更好地了解基因表達(dá)與非生物逆境的相關(guān)性，本研究對(duì)8個(gè)s在鹽、滲透和熱脅迫條件下的表達(dá)響應(yīng)進(jìn)行了研究。如圖3A所示，用200 mmol/L NaCl處理4 h后，8個(gè)基因均表達(dá)上調(diào)，其中、和受到明顯誘導(dǎo)表達(dá)(< 0.05)；在鹽處理8~24 h之間，、、和處于明顯誘導(dǎo)表達(dá)狀態(tài)(<0.05)。8個(gè)s中，受鹽誘導(dǎo)最強(qiáng)，脅迫24 h時(shí)，其相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的3.67倍。用300 mmol/L甘露醇處理后，表達(dá)下調(diào)，、、、、和的表達(dá)量明顯增加(<0.05) (圖3B)。熱脅迫對(duì)的影響最顯著，除外，其他均表現(xiàn)出明顯誘導(dǎo)表達(dá)(<0.05)，尤其是。熱處理0.5 h后，基因的相對(duì)表達(dá)量上升了573倍，其最高誘導(dǎo)表達(dá)量達(dá)790倍；和也受到較強(qiáng)的熱誘導(dǎo)，其最高誘導(dǎo)表達(dá)量分別為4.9倍和4.6倍(圖3C)。

圖2 擬南芥APX家族基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量

誤差線上方不同的小寫字母(a~c)代表彼此間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(<0.05)，用相同字母標(biāo)示或無標(biāo)示則代表無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖3 擬南芥APX家族基因?qū)}、滲透和熱脅迫的響應(yīng)

A：鹽脅迫下基因的表達(dá)量。S0、S4、S8、S12和S24表示鹽脅迫處理時(shí)間(h)；B：滲透脅迫下基因的表達(dá)量。D0、D4、D8、D12和D24表示滲透脅迫處理時(shí)間(h)；C：熱脅迫下基因的表達(dá)量。H0、H0.5、H1、H2和H3表示熱脅迫處理時(shí)間(h)。*表示處理組與對(duì)照組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異：*表示<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；**表示<0.01，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.4 apx突變體在萌發(fā)期以及幼苗生長(zhǎng)期對(duì)鹽和滲透脅迫的耐受性

在含50、100、150或200 mmol/L NaCl的MS固體培養(yǎng)基上萌發(fā)并生長(zhǎng)10 d的擬南芥幼苗的表型和統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖4。當(dāng)NaCl濃度為50 mmol/L時(shí)，所有突變體與野生型種子的萌發(fā)情況無明顯差別；而與野生型相比，、和的根長(zhǎng)生長(zhǎng)受到明顯抑制(<0.05)當(dāng)NaCl濃度為100 mmol/L時(shí)，突變體與野生型、脅迫處理組與對(duì)照組的胚根萌發(fā)率依然無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但根生長(zhǎng)均受到明顯抑制。當(dāng)NaCl濃度為150 mmol/L時(shí)，25%~30%的突變體、40%的野生型種子可萌發(fā)。在200 mmol/L NaCl環(huán)境中，約5%的野生型種子能萌發(fā)，而所有突變體均被抑制(<0.01)。

*表示處理組與對(duì)照組(CK)之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異：*表示P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；**表示P<0.01，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

此外，在含100、200、300或400 mmol/L甘露醇的MS固體培養(yǎng)基上萌發(fā)并生長(zhǎng)10 d的結(jié)果顯示(圖4)，甘露醇對(duì)擬南芥種子的萌發(fā)和幼苗根生長(zhǎng)有抑制作用，且隨著甘露醇濃度增加，抑制作用增大。當(dāng)甘露醇濃度為100 mmol/L時(shí)，野生型擬南芥的萌發(fā)率為94%，突變體的萌發(fā)率介于63% ()~ 92.9% ()之間；幼苗的根生長(zhǎng)受到抑制，但突變體和野生型幼苗的根長(zhǎng)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。當(dāng)甘露醇濃度高達(dá)400 mmol/L時(shí)，42%的野生型、1%的和突變體的胚根可萌發(fā)，其余突變體的萌發(fā)均被抑制。

2.5 apx突變體在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)后期以及生殖發(fā)育期對(duì)鹽和干旱脅迫耐受性

鹽脅迫處理結(jié)果如圖5A和5B所示，鹽處理前和處理7 d后突變體與野生型(WT)的生長(zhǎng)狀況沒區(qū)別；脅迫14 d時(shí)，所有植株的葉片開始干枯，部分植株死亡，死亡率最高，約3.7%。21 d時(shí)，葉片干枯現(xiàn)象更嚴(yán)重，大量植株死亡，存活率為51.9% ()~ 75.7% (WT)不等。當(dāng)鹽脅迫持續(xù)到28 d時(shí)，大部分植株死亡，的存活率最低，僅為11.1%；WT存活率最高，為33.6%。

干旱脅迫處理結(jié)果如圖5C和5D所示，干旱處理7 d之前，突變體和野生型植株的生長(zhǎng)狀況無明顯變化；14 d時(shí)，葉片開始干枯；21 d時(shí)，植株明顯萎蔫。復(fù)水3 d后，40.7%的野生型植株恢復(fù)生長(zhǎng)；大部分突變體死亡，尤其和，存活率分別為4.6%和7.4% (<0.01)。

2.6 鹽、干旱和熱脅迫對(duì)植株H2O2和MDA含量的影響

通過葉片H2O2含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照條件(即未經(jīng)受逆境脅迫)下，植株H2O2含量較低，所有突變體和野生型之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖6)。鹽脅迫使H2O2含量增加，且隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)以及脅迫強(qiáng)度增加，H2O2含量持續(xù)上升；除外，其他突變體與野生型均有較大差異(<0.05)，尤以、和最明顯(圖6A)。干旱處理5 d對(duì)植株H2O2含量無影響；干旱脅迫10 d后，所有植株H2O2含量均顯著上升，突變體明顯高于野生型(<0.05)，其中仍以、和最高(圖6B)。熱脅迫2 h可導(dǎo)致葉片中H2O2含量大幅增加，、和的H2O2含量明顯高于野生型(<0.05)，尤其，其H2O2含量高達(dá)野生型的5.86倍(圖6B)。

經(jīng)受非生物脅迫后，植株中氧化蛋白的含量也升高，但沒有H2O2含量升高明顯。鹽脅迫6 h和24 h時(shí)，、和的MDA含量增加較野生型明顯(<0.05)；當(dāng)鹽脅迫達(dá)到72 h以上時(shí)，所有植株MDA含量明顯增加，且突變體與野生型有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(<0.05)，其中仍以、和最高(圖6A)。干旱處理5 d和10 d后，葉片MDA含量均增加，但突變體與野生型之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖6B)。熱處理2 h后，所有植株MDA含量顯著增加，其中，、和顯著高于野生型和其他突變體(<0.05) (圖6B)。

3 討論

3.1 擬南芥不同發(fā)育時(shí)期APX家族基因的表達(dá)分析

細(xì)胞質(zhì)定位的APX1參與很多生物學(xué)過程[3,25]，其在植物的根、莖、葉以及其他許多組織中組成性表達(dá)[17]。本研究通過系統(tǒng)分析進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論，在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的擬南芥葉片均保持高水平的表達(dá)量，且無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)成熟番茄小孢子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)的表達(dá)量低到幾乎無法檢測(cè)[18,26]。李澤琴[19]對(duì)擬南芥的研究也得到了相同的結(jié)果，通過半定量RT-PCR在成熟擬南芥葉片中檢測(cè)不到的表達(dá)[19]。

有關(guān)和在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中的作用目前還未見報(bào)道。本研究通過qRT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與相似，在擬南芥正常生長(zhǎng)發(fā)育過程中表達(dá)量非常低；此外，功能缺失對(duì)擬南芥萌發(fā)以及幼苗生長(zhǎng)均無顯著影響。這些結(jié)果表明，、和在植物正常生長(zhǎng)發(fā)育過程中所起的作用較小。和隨著發(fā)育進(jìn)程表達(dá)量逐漸減少，進(jìn)一步印證了隨著植物衰老，這兩個(gè)蛋白起的作用逐漸變小[20]。Chen等[12]研究表明，擬南芥在種子后成熟期的表達(dá)量非常高[12]；本研究首次發(fā)現(xiàn)，隨著植株成熟以及衰老，擬南芥葉片表達(dá)量呈顯著上升趨勢(shì)。這些結(jié)果說明，APX6可能在植物衰老以及種子后成熟-干燥期起著非常關(guān)鍵的作用。從本研究結(jié)果可以看出，的表達(dá)量比較穩(wěn)定，可能與其功能有很大關(guān)系；定位于葉綠體，而葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的細(xì)胞器。光合作用會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，因此需要持續(xù)表達(dá)，以維持細(xì)胞內(nèi)的活性氧穩(wěn)態(tài)。

圖5 擬南芥apx突變體和野生型植株在鹽脅迫和干旱脅迫下的生長(zhǎng)狀況以及存活率

A：擬南芥突變體和野生型植株在鹽脅迫下的生長(zhǎng)狀況；B：擬南芥突變體和野生型植株在鹽脅迫不同時(shí)期的存活率；C：擬南芥突變體和野生型植株在干旱脅迫下的生長(zhǎng)狀況；D：擬南芥突變體和野生型植株在干旱脅迫下的存活率。A和C括號(hào)中的數(shù)字表示統(tǒng)計(jì)的植株(野生型或突變體株系)總數(shù)。*表示突變體與野生型(WT)之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，<0.05；**表示突變體與野生型(WT)之間存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，<0.01。

圖6 鹽、干旱和熱脅迫下，apx突變體和野生型擬南芥中H2O2和MDA含量變化

A：鹽脅迫下，突變體和野生型擬南芥中H2O2和MDA含量變化；B：干旱和熱脅迫下，突變體和野生型擬南芥中H2O2和MDA含量變化。誤差線上方不同的小寫字母標(biāo)示代表彼此間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(<0.05)，若無標(biāo)示或用相同字母標(biāo)示則代表無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3.2 擬南芥APX家族基因在非生物逆境脅迫中的作用

在各種生物或非生物脅迫響應(yīng)中，擬南芥的表達(dá)量會(huì)顯著上調(diào)[17]。有研究表明，在不同的細(xì)胞器中APX1的功能與ROS信號(hào)通路緊密相連；在整個(gè)細(xì)胞中，APX1參與ROS含量的調(diào)控[3,25,27]。本研究結(jié)果表明，在鹽、干旱和熱脅迫響應(yīng)過程中均有重要作用。此外，在受到非生物脅迫后，突變體中與活性氧代謝相關(guān)的基因和的表達(dá)量發(fā)生顯著變化[19]，該結(jié)果進(jìn)一步證明APX1在ROS含量調(diào)控以及ROS信號(hào)通路中的重要作用。

APX2位于細(xì)胞質(zhì)，在擬南芥中又稱為APX1B，它也參與植物對(duì)非生物逆境脅迫的響應(yīng)[18]。本研究結(jié)果與多篇文獻(xiàn)報(bào)道均表明，植物中的表達(dá)量極低，但當(dāng)處于高溫環(huán)境中時(shí)，植物根、莖、葉和花粉中的受到明顯的誘導(dǎo)表達(dá)[17,26]。研究表明，在植物不同的發(fā)育階段，APX2在熱脅迫響應(yīng)過程中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用[26,28~31]。李澤琴[19]研究表明在熱處理2 h后，與野生型相比，突變體葉片中、、、和等基因的表達(dá)顯著上調(diào)。當(dāng)經(jīng)受機(jī)械損傷和氧化脅迫時(shí)，植物根中的表達(dá)明顯上調(diào)；在響應(yīng)鹽和滲透脅迫時(shí)，植物根和莖中的表達(dá)明顯上調(diào)[17]。本研究也有不同的發(fā)現(xiàn)，擬南芥葉片在鹽脅迫下表達(dá)上調(diào)，而滲透脅迫下表達(dá)下調(diào)，且突變體對(duì)鹽和滲透脅迫的耐受性降低。一個(gè)組成型高表達(dá)的突變體植株對(duì)干旱脅迫有較強(qiáng)的耐受性，且體內(nèi)ABA水平較高[32]。此外，在鹽脅迫下，突變體中、、、和的表達(dá)顯著上調(diào)，而和的表達(dá)顯著下調(diào)[19]；在滲透脅迫下，突變體中、、和的表達(dá)顯著上調(diào)，而、、、和的表達(dá)顯著下調(diào)[19]，說明APX2在鹽和滲透脅迫響應(yīng)過程中均起到響應(yīng)逆境脅迫的調(diào)節(jié)作用。而強(qiáng)光照射下，植物維管和維管束鞘細(xì)胞的表達(dá)受到抑制，并受到H2O2、ABA和葉片含水狀態(tài)等因素的調(diào)控[33~35]。綜合這些結(jié)果，說明APX2在植物逆境響應(yīng)過程中具有不可或缺的作用。

有關(guān)擬南芥過氧化物酶體APX的研究報(bào)道非常少。Wang等[36]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)擬南芥的煙草對(duì)氨基三唑(除草劑)的耐受性增強(qiáng)；Yan等[37]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的煙草在適度干旱條件下種子產(chǎn)量增加。功能缺失后，與野生型相比，突變體的生長(zhǎng)和發(fā)育無明顯影響；即使在高溫、低溫或低鹽條件下，也無主要的形態(tài)或生物量區(qū)別[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，明顯受到鹽、熱和滲透脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，且的抗逆能力下降。這些研究表明，APX3在植物抗逆中的功能仍需進(jìn)一步探討。

目前，有關(guān)APX5的功能研究還未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常生長(zhǎng)條件下，的表達(dá)量低到無法檢測(cè)到；但功能缺失后，突變體的抗逆能力明顯下降，說明可能參與一些信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。

之前一直認(rèn)為APX4與APX3和APX5一樣，是過氧化物酶體定位的蛋白質(zhì)[24]，但最近幾年的研究表明，APX4與tAPX同樣存在于葉綠體的類囊體中，位于類囊體腔內(nèi)[22,23]。APX4既不能與亞鐵血紅素或抗壞血酸結(jié)合，也不具有過氧化物酶活性，將基因突變后，植株的APX總活性無明顯變化[22,24]。盡管如此，也有研究表明擬南芥基因突變后，幼苗表現(xiàn)出子葉萎黃，H2O2積累；種皮屬性發(fā)生變化，最終導(dǎo)致種子的透性、保護(hù)性、品質(zhì)和壽命均發(fā)生變化[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的NaCl和甘露醇對(duì)突變體的種子萌發(fā)、子葉、真葉和根生長(zhǎng)均有較明顯影響；長(zhǎng)時(shí)間的鹽和干旱脅迫也會(huì)促進(jìn)突變體植株死亡。

Chen等[12]的研究結(jié)果表明，擬南芥在種子后成熟期的表達(dá)量非常豐富，突變體種子中積累較多的活性氧，種子氧化損傷嚴(yán)重，在土萌發(fā)率降低，當(dāng)種子受到滲透脅迫、鹽脅迫或熱脅迫時(shí)這種傷害更加嚴(yán)重，突變的成熟種子在熱脅迫條件下的萌發(fā)活力降低。本研究發(fā)現(xiàn)APX6對(duì)植物的抗逆性有影響；在鹽或干旱(滲透)脅迫下，突變體種子萌發(fā)率降低，且植株的生命力明顯減弱。因此，在擬南芥非生物脅迫響應(yīng)過程中有重要作用。

研究表明，在光氧化脅迫下葉綠體APX對(duì)植物光合系統(tǒng)的保護(hù)和基因表達(dá)調(diào)控具有重要作用，但sAPX還是tAPX起主要作用并不清楚[38]。Maruta等[39]發(fā)現(xiàn)，在光氧化脅迫下，sAPX和tAPX不僅可以保護(hù)光合系統(tǒng)，同時(shí)可以調(diào)節(jié)H2O2響應(yīng)基因的表達(dá)，其中tAPX的作用更加顯著。本研究發(fā)現(xiàn)，在熱脅迫下比容易受到誘導(dǎo)表達(dá)；而在響應(yīng)鹽和干旱脅迫的過程中，比更明顯受到誘導(dǎo)表達(dá)；成熟突變體植株的抗旱能力比植株弱。這些結(jié)果可以說明，sAPX在響應(yīng)鹽和干旱脅迫過程中的作用更顯著。

綜上所述，本研究通過對(duì)擬南芥APX家族8個(gè)基因的系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)：在擬南芥正常生長(zhǎng)發(fā)育過程中，和的表達(dá)量比較穩(wěn)定，一直處于最高水平；和的表達(dá)量極低，幾乎無法檢測(cè)到其表達(dá)量；、和隨著發(fā)育進(jìn)程表達(dá)量逐漸下降，而的表達(dá)量卻隨著植株發(fā)育成熟至衰老顯著增加。在非生物逆境脅迫響應(yīng)過程中，和對(duì)鹽、干旱和熱脅迫均有響應(yīng)，但熱誘導(dǎo)表達(dá)量更多；積極響應(yīng)熱脅迫，對(duì)鹽和干旱脅迫的應(yīng)答不明顯；和對(duì)3種脅迫均表現(xiàn)出明顯應(yīng)答；積極響應(yīng)鹽脅迫，而對(duì)鹽脅迫無應(yīng)答反應(yīng)只對(duì)熱脅迫表現(xiàn)出一定反應(yīng)。擬南芥的任意一個(gè)基因的單突變，基本不影響植株的正常生長(zhǎng)發(fā)育過程，但是與野生型相比，突變體植株的抗逆性都明顯降低。這些結(jié)果充分說明，在擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育的每個(gè)階段，都有特定的幾種APX起主要作用；而在逆境脅迫響應(yīng)過程中，8個(gè)APX會(huì)在相同或不同的信號(hào)通路中發(fā)揮各種作用。

附錄：

附表1見文章電子版www.Chinagene.cn。

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The role analysis of APX gene family in the growth and developmental processes and in response to abiotic stresses in

Zeqin Li1, Jintao Li1, Jie Bing2, Genfa Zhang2

Oxidative stress caused by reactive oxygen species (ROS) is one of the major abiotic stresses in plants. Under adverse growth conditions, the incoordination of various metabolic processes in plant cells can result in increased hydrogen peroxide (H2O2), thus causing a variety of threats and injuries to plant cells. Ascorbate peroxidase (APX) is an important enzyme to remove H2O2in plants. In, there are eight APX gene family members, including?,and. In this study, we analyzed the expression patterns of the eightgenes in the wild-type andmutant plants at different developmental stages and under different abiotic stress conditions. Meanwhile, the tolerance of eachmutant to salt, drought and heat stresses was studied. qRT-PCR analysis showed that during development (from 4 to 8 weeks old),andexhibited the highest and lowest expression levels, respectively. In addition, the expression levels of,anddecreased during development, while the expression ofincreased with the maturity of the plants. Moreover, under different abiotic stress conditions,,andwere significantly induced by heat stress,actively responded to salt stress, andandexhibited obvious responses to salt, drought and heat stresses. Further tolerance analysis showed that the resistance of allmutants to salt and drought stresses was lower than that of the wild-type plant at both germination and maturity stages. At germination stage, allmutants were more sensitive to drought stress than to salt stress. At maturity stage, theandmutants were more sensitive to salt and drought stresses than the wild-type and othermutant plants. The physiological indexes indicated that the H2O2content in all mutants, especially in the,and,was significantly higher than that in the wild type 10 days after drought stress treatment, the malondialdehyde (MDA) content in all mutants was significantly higher than that in the wild type 5 days after salt stress treatment, while heat stress treatment for 2 h resulted in a significant increase in the contents of H2O2and MDA in,and, especially in. Taken together, our study revealed that all eight APX members ofparticipate in the growth and developmental processes and the abiotic stress responses, with some specific APXs playing a major role in a certain process.

; ascorbate peroxidase (APX); reactive oxygen species (ROS); abiotic stress response

2019-02-08;

2019-04-27

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81701868，31470399，31872672)和山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：201803D31069)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81701868, 31470399, 31872672) and the Key Research and Development (R&D) Projects of Shanxi Province (No. 201803D31069)]

李澤琴，博士，講師，研究方向：分子遺傳學(xué)和法醫(yī)物證學(xué)。E-mail: zeqin1988.happy@163.com

張根發(fā)，博士，教授，研究方向：植物抗逆分子生物學(xué)。E-mail: gfzh@bnu.edu.cn

10.16288/j.yczz.19-026

2019/6/12 14:28:13

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190612.1427.002.html

(責(zé)任編委: 張紅生)