張懷波，馬榮龍，張德景

（河南省濮陽(yáng)市油田總醫(yī)院 普外三科，河南 濮陽(yáng) 457001）

原發(fā)性肝癌是指發(fā)生于肝細(xì)胞內(nèi)或者肝內(nèi)膽管細(xì)胞的癌癥，是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，病死率居全國(guó)惡性腫瘤第二位，其中絕大多數(shù)為肝細(xì)胞癌。治療困難，極易復(fù)發(fā)[1-2]。Clara細(xì)胞分泌蛋白10（CC10）又名子宮珠蛋白，由固醇誘導(dǎo)產(chǎn)生，隸屬分泌珠蛋白家族，具有多種生理功能，在抗炎和免疫調(diào)節(jié)等生理活動(dòng)中發(fā)揮重要的作用[3-4]。CC10主要在與外部環(huán)境直接相通的人體器官上皮細(xì)胞中表達(dá)，包括鼻、舌下腺、支氣管、肺和乳腺等[3，5-6]。研究表明，CC10是炎癥和過(guò)敏反應(yīng)的重要介質(zhì)，是呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤的早期標(biāo)志物[7]。目前對(duì)CC10的研究多集中在乳腺及呼吸系統(tǒng)，在肝癌細(xì)胞中尚未見(jiàn)研究報(bào)道。細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）是細(xì)胞周期素家族的關(guān)鍵成員之一，通過(guò)調(diào)節(jié)G1期正向調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展[8]。Cyclin D1的過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致增殖失控，引發(fā)細(xì)胞癌變。研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1過(guò)表達(dá)可能是肝癌發(fā)生的早期標(biāo)志，在腫瘤分化中起重要作用，對(duì)肝癌的診斷及患者預(yù)后有重要的意義[9]。本研究用含CC10基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2，檢測(cè)外源性CC10對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響以及對(duì)Cyclin D1表達(dá)的影響，初步探索CC10對(duì)肝癌的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

人正常肝細(xì)胞LO2和肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3B購(gòu)自ATCC公司；RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)自GIBCO公司；胎牛血清購(gòu)自浙江四季青生物科技有限公司；青霉素、鏈霉素、總蛋白提取試劑盒、胰蛋白酶購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectionTM購(gòu)自InivoGene公司；pcDNA 3.1空載體質(zhì)粒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo公司；SYBR Premix Ex TaqTMII購(gòu)自Takara公司；pcDNA 3.1-CC10質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；引物由北京六合華大基因科技有限公司合成；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；鼠抗人CC10多抗、GAPDH單抗和HRP標(biāo)記山羊抗鼠抗體購(gòu)于Santa Cruz公司；兔抗大鼠Cyclin D1抗體購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；Transwell小室購(gòu)自Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液中（10% FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素），培養(yǎng)箱設(shè)置成以下參數(shù)：37 ℃、5% CO2。每隔1～2 d傳代1次，選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

將對(duì)數(shù)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞，接種于含RPMI 1640培養(yǎng)液的六孔板上（每孔2×105個(gè)細(xì)胞），于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞密度為90%左右時(shí)，按照LipofectionTM說(shuō)明書(shū)提示的操作步驟分別用4 μg pcDNA3.1空載體質(zhì)粒（記為pcDNA 3.1組）和4 μg pcDNA 3.1-CC10質(zhì)粒（記為pcDNA 3.1-CC10組）轉(zhuǎn)染細(xì)胞，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.3 細(xì)胞中CC10和Cyclin D1的表達(dá)檢測(cè)

用TRIzol試劑提取人正常肝細(xì)胞LO2和肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3B以及pcDNA 3.1組和pcDNA 3.1-CC10組（轉(zhuǎn)染48 h）細(xì)胞總RNA，取1 μg RNA作為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以此為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，分別檢測(cè)CC10和Cyclin D1的相對(duì)表達(dá)量。CC10的上游引物序列為5’-GATCAAGACATGAGGGAGGCA-3’，下游引物序列為5’-CACAGTGAGCTTTGGGCTATTT-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-CAGCGACACCCACTCCTC-3’，下游引物序列為5’-TGAGGTCCACCACCCTGT-3’；Cyclin D1的上游引物序列為5’-CTGGCCATGAA CTACCTGGA-3’，下游引物序列為5’-GTCACACTT GATCACTCTGG-3’。qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；58 ℃ 30 s，39個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，分析溶解曲線，利用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 外源性CC10的表達(dá)檢測(cè)

采用Western blotting法。轉(zhuǎn)染48 h后，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取細(xì)胞的總蛋白，并以BCA法對(duì)總蛋白定量。將蛋白樣品上樣至SDS-PAGE凝膠進(jìn)行蛋白分離后，轉(zhuǎn)膜。取PVDF膜于封閉液中封閉1 h。分別加入1：500倍稀釋的CC10多抗、GAPDH單抗和Cyclin D1抗體于4 ℃孵育24 h。經(jīng)封閉液洗滌后，加入1：5 000倍稀釋的二抗于37 ℃孵育1 h。暗室內(nèi)加入ECL化學(xué)發(fā)光劑顯影后，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.5 細(xì)胞活力檢測(cè)

采用CCK-8法。分別于轉(zhuǎn)染24、48和72 h后，棄培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，再加入100 μL無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液和10 μL CCK-8檢測(cè)液，37 ℃避光孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm處的OD值。

1.6 細(xì)胞凋亡情況檢測(cè)

采用一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒。轉(zhuǎn)染48 h后，棄培養(yǎng)液，PBS清洗1次、4%多聚甲醛固定1 h、0.1%的Triton X-100冰浴5 min、加入50 μL TUNEL檢測(cè)液，37 ℃避光1 h，封片后立即在熒光顯微鏡（×100）下觀察。隨機(jī)選5個(gè)視野，對(duì)凋亡細(xì)胞（發(fā)綠色熒光）進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值，計(jì)算細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/視野下細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.7 細(xì)胞遷移、侵襲能力檢測(cè)

采用Transwell實(shí)驗(yàn)法。將轉(zhuǎn)染48 h后兩組細(xì)胞制成懸浮液。在Transwell小室的上室中加入300 μL由RPMI1640培養(yǎng)液稀釋的細(xì)胞懸浮液（約1×105個(gè)細(xì)胞，0.1% FBS），下室中加入700 μL RPMI1640培養(yǎng)液（20% FBS），每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱24 h，用甲醇固定后，0.1%結(jié)晶紫于室溫下染色20 min，倒置顯微鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野（×200）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后取平均值，是為遷移細(xì)胞數(shù)。

細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)需將40 μL稀釋過(guò)的Matrigel基質(zhì)膠（基質(zhì)膠：無(wú)血清培養(yǎng)液=1：5）加入Transwell小室內(nèi)，37 ℃孵育2 h。其余步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CC10在肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3B中的表達(dá)

為了探究CC10在肝癌細(xì)胞中的作用，首先通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)了其在人正常肝細(xì)胞LO2和肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3B中CC10 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果如圖1所示，與正常肝細(xì)胞相較，肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3B中CC10 mRNA的表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），且CC10 mRNA在HepG2中表達(dá)較低，故選擇HepG2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 CC10 mRNA在人正常肝細(xì)胞LO2和肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3B中的表達(dá)情況

2.2 外源性CC10在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)

為了檢測(cè)外源CC10在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染48 h后，分別用RT-qPCR和Western blotting分析其mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后，與pcDNA 3.1組相比，CC10表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），Western blotting的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RT-qPCR的結(jié)果一致（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 外源性CC10對(duì)HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響

為了檢測(cè)外源性CC10對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、凋亡水平的影響，分別用CCK-8法和TUNEL法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞的活力和凋亡率。結(jié)果如圖3所示，與pcDNA 3.1組相比，pcDNA 3.1-CC10組細(xì)胞活力隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加而降低（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染48 h后，凋亡率明顯升高（P＜0.05）。這說(shuō)明外源性CC10抑制HepG2細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡。

2.4 外源性CC10對(duì)HepG2細(xì)胞遷移和侵襲的影響

圖2 外源性CC10在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)情況

為了檢測(cè)外源性CC10對(duì)HepG2細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，分別用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。結(jié)果表明，與pcDNA 3.1組相比，pcDNA 3.1-CC10組細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量均明顯降低（P＜0.05）。說(shuō)明外源性CC10抑制HepG2細(xì)胞增遷移、侵襲，見(jiàn)圖4。

2.5 外源性CC10對(duì)HepG2細(xì)胞中Cyclin D1表達(dá)的影響

為了檢測(cè)外源CC10對(duì)HepG2細(xì)胞中Cyclin D1表達(dá)水平的影響，pcDNA 3.1-CC10質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞48 h后，分別用RT-qPCR和Western blotting分析Cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后，與pcDNA 3.1組相比，Cyclin D1表達(dá)水平明顯下調(diào)（P＜0.05），Western blotting的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RT-qPCR的結(jié)果一致（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖3 外源性CC10對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、凋亡的影響

圖4 外源性CC10對(duì)HepG2細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

圖5 外源CC10對(duì)HepG2細(xì)胞中Cyclin D1表達(dá)水平的影響

3 討論

近年來(lái)肝癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，給人民的生命健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)巨大的挑戰(zhàn)[10]。我國(guó)每年約有38萬(wàn)人死于肝癌，占全球肝癌死亡病例數(shù)的51%[11]。肝癌患者預(yù)后整體較差，主要的治療方式有手術(shù)治療、肝移植、非手術(shù)治療（包括肝動(dòng)脈化療栓塞、射頻消融治療、放射治療、基因治療、中醫(yī)中藥治療等）[12]?；诨虻姆肿影邢蛑委熓悄壳暗难芯繜狳c(diǎn)之一[13]。

Clara細(xì)胞CC10蛋白是一種能抑制腫瘤、抵御炎癥反應(yīng)、維持人體免疫平衡的分泌蛋白，但其作用機(jī)制至今不太明確[14-15]。Weeraratna等[16]研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌細(xì)胞中CC10表達(dá)量較正常上皮細(xì)胞低，CC10蛋白的表達(dá)量下降可作為前列腺癌的一個(gè)診斷指標(biāo)，并且具有預(yù)后價(jià)值；CC10蛋白具有抗腫瘤增長(zhǎng)的活性。Zhong等[17]利用脂質(zhì)體將外源CC10轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549，發(fā)現(xiàn)外源CC10表達(dá)能阻斷G0/G1的細(xì)胞周期進(jìn)程，并抑制A549細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制效應(yīng)可能與Cyclin D1基因的下調(diào)有關(guān)。Wei等[18]于大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)并純化重組大鼠CC10蛋白，然后用重組蛋白處理大鼠ASMCs細(xì)胞，結(jié)果證明重組CC10蛋白可抑制PDGF誘導(dǎo)的大鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，推測(cè)抑制作用可能與抑制細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)有關(guān)。鐘聲等[19]證明CC10表達(dá)下調(diào)與NSCLC細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。最新的一項(xiàng)研究表明，CC10蛋白可通過(guò)抑制Fgl2蛋白的表達(dá)緩解小鼠肝炎病毒株3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3B中CC10的表達(dá)量較人正常肝細(xì)胞LO2顯著降低。且外源CC10能抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，與前人結(jié)果類(lèi)似。

Cyclin D1屬于原癌基因，通過(guò)與CDK6或CDK4結(jié)合形成復(fù)合物在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期過(guò)程中發(fā)揮作用。多種腫瘤細(xì)胞中均可檢測(cè)到該基因的擴(kuò)增、突變和高表達(dá)，且其表達(dá)量與患者預(yù)后呈顯著負(fù)相關(guān)[21-23]。敖然等[24]發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1蛋白在人正常癌旁組織中不表達(dá)，而在肝癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核及肝癌組織中高表達(dá)量。Zhao等[25]研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織。此外，Cyclin D1蛋白在宮頸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常宮頸組織[26]。因此，下調(diào)Cyclin D1基因的表達(dá)可能是抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的一種可能的機(jī)制。本研究中，外源CC10基因表達(dá)使得肝癌細(xì)胞HepG2中Cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)。因此，我們推測(cè)CC10可通過(guò)下調(diào)Cyclin D1的表達(dá)抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，外源CC10基因表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞具有抑制增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，其機(jī)制可能與下調(diào)Cyclin D1蛋白表達(dá)有關(guān)。