郭明興，蘇婷婷，傅春升

(1.山東省衛(wèi)生健康委員會(huì)醫(yī)療管理服務(wù)中心，山東 濟(jì)南 250014；2.濟(jì)南市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014)

肝癌嚴(yán)重危害著人類(lèi)健康,是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。根據(jù)流行病學(xué)資料,我國(guó)肝癌的發(fā)病率和死亡率占全部惡性腫瘤的第二位,僅次于肺癌[1-2]?？鄥A能夠抑制鼠移植性肝腫瘤[3-6]，但是苦參堿存在普通劑型溶出速度慢，吸收較差等缺陷[7]。自微乳化給藥系統(tǒng)在37 ℃環(huán)境下，通過(guò)溫和攪拌即可自發(fā)乳化成粒徑小于100 nm的微乳[8]。本研究制備苦參堿自微乳和原料藥含藥血清，比較不同含藥血清對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制、殺傷作用，為苦參堿自微乳治療肝癌提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 CKX-31倒置顯微鏡(Olympus公司)；BIOBASE-EL10A型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(山東博科)；CO2培養(yǎng)箱(上海勝衛(wèi)電子科技有限公司)；離心機(jī)(奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司)。

1.2 試藥 苦參堿自微乳(自制，含藥量為4.76%)；苦參堿(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110805-200306)；RPMI-1640培養(yǎng)基；胎牛血清；噻唑藍(lán)(MTT)；96孔板；二甲基亞砜(DMSO，批號(hào)：201301013，MP Biomedicals公司)。

1.3 腫瘤細(xì)胞株和研究對(duì)象 HepG2細(xì)胞；Wistar大鼠，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖有限公司提供，體重(220±30)g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(魯)20140007。

2 方法

2.1 苦參堿自微乳的制備 自微乳處方：苦參堿∶油酸∶油酸乙酯∶EL-40∶異丙醇=0.5∶1.5∶1.5∶3.5∶3.5。稱(chēng)取處方量的油酸、油酸乙酯、EL-40、異丙醇，加入到50 mL燒杯中，渦旋混勻至無(wú)分層，得空白自微乳液；將處方量的苦參堿加入到空白微乳溶液中，將燒杯置于磁力攪拌器上，轉(zhuǎn)速100 rpm，攪拌10 min制得苦參堿自微乳液。

2.2 含藥血清的制備 Wistar大鼠分空白組、自微乳組、原料藥組，每組8只，按含藥量60 mg·kg-1劑量灌胃，空白組給予相同體積的蒸餾水，早晚各1次，灌胃21 d，禁食1 d，第22天給藥2 h后，麻醉大鼠，下腔靜脈取血，收集上清，過(guò)濾除菌，低溫保存。

2.3 MTT實(shí)驗(yàn) 用對(duì)數(shù)期細(xì)胞制備懸液，調(diào)整密度為5×104/mL，吹打均勻。96孔板鋪板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，四周每孔加入200 μL PBS，置于CO2培養(yǎng)箱18 h。設(shè)置自微乳組、原料藥組、陰性對(duì)照組、空白組，每組鋪6孔。細(xì)胞貼壁，棄去培養(yǎng)液，加入含藥血清干預(yù)，于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h和48 h。每孔加5 mg·mL-1MTT溶液10 μL，培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，恒溫?fù)u床8 min，上機(jī)測(cè)定吸光值。

2.4 凋亡率測(cè)定 設(shè)置30%自微乳組、20%自微乳組、30%原料藥組、20%原料藥組、對(duì)照組(不加含藥物血清)5組細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，處理細(xì)胞，收集所有懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞，離心機(jī)離心，沉淀物重懸計(jì)數(shù)。加入5 μL AnnexinV-FITC、10 μL碘化丙啶染色液混勻，加MTT溶液10 μL，培養(yǎng)4 h。棄掉培養(yǎng)液，每孔加150 μL DMSO。室溫避光孵育15 min，上機(jī)檢測(cè)。

2.5 細(xì)胞周期檢測(cè) 對(duì)數(shù)期細(xì)胞過(guò)夜貼壁。棄掉舊培養(yǎng)液，加入20%原料藥血清，30%原料藥血清，20%自微乳血清，30%自微乳血清，設(shè)對(duì)照組，24 h后收集所有細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，取1 mL單細(xì)胞懸液。離心，沉淀物用70%乙醇固定，4 ℃保存。加入100 μL RNaseA，37 ℃水浴35 min，400 μL PI染色均勻，4 ℃避光35 min后測(cè)定數(shù)值。

3 結(jié)果

3.1 運(yùn)用MTT法檢測(cè)得的OD值，計(jì)算自微乳與原料藥對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的抑制率，不同血藥濃度血清對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的影響見(jiàn)表1。

表1 不同濃度含藥血清對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的影響

注：相同時(shí)間點(diǎn)、相同濃度兩組比較，*P<0.05,**P<0.01

結(jié)果，自微乳組與原料藥組對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用有明顯差異。干預(yù)24 h，20%含藥血清處理細(xì)胞，自微乳組的抑制率明顯大于原料藥組；30%含藥血清處理細(xì)胞，自微乳組的抑制率明顯大于原料藥組。干預(yù)24 h，20%含藥血清處理細(xì)胞，自微乳組的抑制率明顯大于原料藥組；30%含藥血清處理細(xì)胞，自微乳組的抑制率明顯大于原料藥組。

3.2 苦參堿含藥血清對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用具有明顯的時(shí)間和劑量依賴(lài)性(見(jiàn)圖1)。

圖1 體外抑瘤活性曲線(xiàn)

3.3 凋亡率結(jié)果 20%自微乳含藥血清、30%自微乳含藥血清干預(yù)HepG2細(xì)胞的凋亡率為47.53%、72.19%。20%原料藥含藥血清、30%原料藥含藥血清干預(yù)HepG2細(xì)胞的凋亡率為31.97%、42.19%。

3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果 20%自微乳含藥血清、30%自微乳含藥血清干預(yù)HepG2細(xì)胞，S期所占比例為15.17%、19.10%。20%原料藥含藥血清、30%原料藥含藥血清干預(yù)HepG2細(xì)胞，S期所占比例為11.42%、13.11%。

圖2 含藥血清誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡

圖3 含藥血清干擾細(xì)胞周期

4 討論

張思維等[9]分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)肝癌僅次于肺癌為中國(guó)腫瘤登記地區(qū)死亡率第二位的癌癥類(lèi)型。隨著對(duì)苦參堿及其制劑研究的不斷深入，苦參堿藥理作用逐漸被發(fā)現(xiàn)，其用于治療肝損傷、肝纖維化、肝癌的療效深受醫(yī)藥工作者重視[10]。金艷書(shū)等[5]研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿能夠誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡，影響人肝癌細(xì)胞周期。細(xì)胞凋亡是機(jī)體對(duì)異常細(xì)胞或衰老細(xì)胞的有效清除手段[11]。

本研究采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果表明：自微乳含藥血清對(duì)細(xì)胞的抑制作用與原料藥含藥血清對(duì)細(xì)胞的抑制作用差異明顯。含藥血清作用于細(xì)胞的時(shí)間越長(zhǎng)或含藥血清的濃度越大，其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用越大。細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果表明，相同血清濃度下，自微乳含藥血清組誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力明顯高于原料藥含藥血清組，且隨著含藥血清濃度的增大，其細(xì)胞凋亡率越高。通過(guò)自微乳組和原料藥組對(duì)細(xì)胞周期影響的研究表明，自微乳組的作用顯著高于原料藥組。將苦參堿制備成自微乳化制劑能夠改善苦參堿難溶于水，吸收困難的缺點(diǎn)，明顯提高其在體內(nèi)的吸收利用率。因此，將苦參堿制備成自微乳化制劑有利于提高苦參堿的生物利用度，為苦參堿自微乳治療肝癌提供理論依據(jù)。