方敏，李家明，李寧，趙娣，陳西敬，張廣欽

(1.中國藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院臨床藥學(xué)研究室，江蘇 南京 211198；2.中國藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院臨床藥物代謝動力學(xué)研究室，江蘇 南京 211198；3.中國藥科大學(xué)國家藥學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，江蘇 南京 211198)

熊果酸(ursolic acid,UA)是一種來自各種藥用植物[1]和水果[2]中的五環(huán)三萜類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。近年來，各項(xiàng)研究表明，熊果酸可以作為抗氧化劑[3]、抗炎劑[4-5]、抗菌劑[6]、肝臟保護(hù)劑[7-8]，還能抑制白血病細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。該化合物通過多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞的分化、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成[10]，對乳腺癌[11]、肺癌[12]、子宮內(nèi)膜癌[13]、前列腺癌[14]和黑色素瘤[15]等腫瘤的治療效果顯著。雖然熊果酸具有良好的抗腫瘤活性，但它水溶性差[16]，口服給藥體內(nèi)吸收差，體外釋放度小，體內(nèi)半衰期短，生物利用度低[17]，這些缺點(diǎn)限制了其在藥學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，影響其療效的發(fā)揮。

圖1 熊果酸化學(xué)結(jié)構(gòu)式

納米藥物遞送系統(tǒng)(NDDS)在藥物遞送等方面應(yīng)用日益廣泛[18]，其可以顯著延長藥物作用時(shí)間[19]、提高水溶性差的藥物治療性能和改善生物安全性[20]。多種新型納米載體，如脂質(zhì)體、膠束和納米粒等，可以通過增強(qiáng)的滲透性和保留(EPR)效應(yīng)更好地作用于腫瘤[21-22]?；贜DDS的廣泛應(yīng)用，多種熊果酸的新型納米制劑相繼被研發(fā)出來，如熊果酸脂質(zhì)體、納米粒等。本文就其現(xiàn)有研發(fā)的納米制劑進(jìn)行總結(jié)，討論了各種納米制劑的優(yōu)勢和不足，期望能夠?yàn)槠湫滦图{米制劑的研發(fā)及后續(xù)研究提供思路和參考。

1 脂質(zhì)體

脂質(zhì)體是一種常見的納米制劑，其磷脂雙分子層能夠很好地包載疏水性藥物，改善其水溶性，以下根據(jù)脂質(zhì)體靶向進(jìn)入作用部位的類型分別展開介紹。

1.1 被動靶向脂質(zhì)體 一般脂質(zhì)體可通過實(shí)體瘤的高通透性和滯留(EPR)效應(yīng)，被動靶向腫瘤細(xì)胞。Zhong 等[23]實(shí)驗(yàn)室曾構(gòu)建出熊果酸和拉米夫定以酰胺鍵和酯鍵連接的共聚物(LMX)，具有抗肝炎病毒和保肝的雙重效果。此次研究利用合成的LMX，采用薄膜水化法制備共聚物脂質(zhì)體[24]。所制備的脂質(zhì)體分別經(jīng)靜脈注射和灌胃后，大鼠體內(nèi)血漿藥時(shí)曲線下面積(AUC0～t)和平均駐留時(shí)間(MRT0～t)較熊果酸溶液明顯增加。靜注給藥后熊果酸生物利用度提高了1.35倍，口服生物利用度是溶液的10.75倍，在體內(nèi)有效時(shí)間明顯延長。此研究對脂質(zhì)體分別進(jìn)行靜注和灌胃，不管是哪種給藥途徑，脂質(zhì)體相對于溶液的相對生物利用度均有提高。脂質(zhì)體在靜注給藥時(shí)，既可以避免胃腸道對藥物非治療作用的代謝，又能夠減少疏水性藥物溶劑的毒副作用[25]，達(dá)到很好的治療效果。體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)試驗(yàn)很好地為熊果酸脂質(zhì)體提高生物利用度、延長半衰期提供了有力的參考。

齊娜等[26]根據(jù)熊果酸油水分布系數(shù)較大(lgP>0.5)的特點(diǎn)，優(yōu)化出處方工藝(磷脂∶膽固醇=2∶1)，通過薄膜-超聲法成功制備了熊果酸脂質(zhì)體。該脂質(zhì)體體外釋放過程符合一級速率方程，具有緩釋特點(diǎn)。制備出的脂質(zhì)體改善了熊果酸體外釋放度低的缺點(diǎn)，為熊果酸脂質(zhì)體的體內(nèi)分布和藥效等更深入的研究提供依據(jù)。脂質(zhì)體藥物的釋放很大程度上受到其理化性質(zhì)的影響，如類脂質(zhì)材料的組成、脂質(zhì)體表面的電荷等情況。脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)在體內(nèi)被代謝或者在體外被破壞后，包載的藥物才會釋放成游離藥物，發(fā)揮藥效。所以，根據(jù)脂質(zhì)體的釋放特點(diǎn)可以制備出在特定環(huán)境下釋放，即具有靶向作用的脂質(zhì)體。

1.2 主動靶向脂質(zhì)體 添加具有某些靶向作用的材料，如：抗體、核酸、葉酸后，制備出的脂質(zhì)體根據(jù)這些材料的靶向性而具有主動靶向作用。楊光等[27]采用薄膜分散法制備了靶向葉酸受體的熊果酸長循環(huán)脂質(zhì)體(F-PEG-L-UA)。由于PEG的修飾，該脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出明顯的緩釋特性和長循環(huán)效應(yīng)。通過建立BALB/c荷瘤裸鼠人口腔表皮樣癌KB腫瘤模型，實(shí)驗(yàn)表明該脂質(zhì)體能夠顯著抑制腫瘤生長，有效延長荷瘤鼠的生存期，具有顯著的抗腫瘤效果。并且，由于葉酸配體在腫瘤組織中的主動靶向作用，該脂質(zhì)體対非靶向的組織和器官影響較小，能夠有效減少藥物的副作用，突顯出主動靶向修飾的熊果酸脂質(zhì)體應(yīng)用于癌癥治療中增效減毒的潛在價(jià)值。

1.3 環(huán)境響應(yīng)性靶向脂質(zhì)體 某些靶向脂質(zhì)體的材料因?yàn)榄h(huán)境因素，例如pH值、溫度等因素而具有一定的靶向性。Rocha等[28]選用二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、半琥珀酸膽固醇(CHEMS)、二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG 2000)等材料，通過脂質(zhì)水合法[29]制備UA的長循環(huán)pH敏感脂質(zhì)體(SpHL-UA)。此研究中，用pH敏感性脂質(zhì)體處理的動物，因?yàn)槟げ脑谀[瘤酸性條件下分解，釋放出UA，藥物在腫瘤部位的攝取量約是游離藥物處理的2倍，驗(yàn)證了藥物在各組織分布的數(shù)據(jù)。該實(shí)驗(yàn)通過建模觀察到UA抗血管生成作用的實(shí)質(zhì)證據(jù)：SpHL-UA處理的動物模型中，血流動力學(xué)參數(shù)，例如組織血流量(FT)、表面通透性(PS)等，均明顯降低。該研究首次評估了熊果酸脂質(zhì)體的體內(nèi)抗血管生成作用和靶向效果，在乳腺腺癌的治療或膠質(zhì)肉瘤的化學(xué)預(yù)防中具有啟示意義。

熊果酸脂質(zhì)體的后續(xù)研究還有很多，所制備的脂質(zhì)體承襲了脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)的優(yōu)勢，改善了藥物水溶性差的問題，提高生物利用度，達(dá)到緩釋、增效減毒的目的，使其更好地應(yīng)用于腫瘤預(yù)防和治療。熊果酸藥理活性廣泛，脂質(zhì)體的主動或被動靶向性均能很好的使其在靶向部位發(fā)揮療效，使熊果酸的應(yīng)用范圍更加廣闊。但是，脂質(zhì)體不穩(wěn)定，易氧化降解，重現(xiàn)性不易把握，這些缺點(diǎn)在一定程度上也限制了其臨床實(shí)踐。

2 膠束

膠束是聚合物自組裝形成的一種納米制劑，一般具有兩親性?，F(xiàn)有的膠束根據(jù)其形成原理可分為嵌段型、接枝型、共價(jià)型和非共價(jià)鍵型等。關(guān)于熊果酸，其膠束研究的較少。Zhang等[30]通過縮合反應(yīng)合成了細(xì)胞內(nèi)pH敏感的聚唾液酸-熊果酸聚合物(PSAU)，為了進(jìn)一步測試藥物負(fù)載能力，實(shí)驗(yàn)者通過納米沉淀法制備了載有紫杉醇的聚唾液酸-熊果酸兩親性共聚物膠束(PTX-loaded-PSAU)。在該研究中，裝載PTX的PSAU膠束在生理pH下具有優(yōu)異的穩(wěn)定性，因?yàn)镻SA在腫瘤微酸性條件下易于水解[31]，所以PSAU能夠在腫瘤部位釋放負(fù)載的PTX。體外細(xì)胞毒性研究表明，PSAU膠束對胃腺癌細(xì)胞(SGC-7901)幾乎沒有細(xì)胞毒性，而載有PTX的膠束顯示出高細(xì)胞毒性。在此研究中，熊果酸膠束不是作為獨(dú)立的抗腫瘤藥物起作用，而是作為一種材料，一種新型的藥物遞送系統(tǒng)，使傳統(tǒng)的化療藥物更好地發(fā)揮作用。通過本試驗(yàn)，可以看出PSAU膠束用于癌癥化學(xué)療法的藥物遞送系統(tǒng)的潛力，為熊果酸的膠束制劑應(yīng)用開拓了一種新思路。

聚合物膠束作為常見的納米制劑類型，在熊果酸的應(yīng)用方面相比較其他納米制劑類型卻并不常見。因?yàn)槟z束包載熊果酸的量較少，熊果酸在少量的情況下難以發(fā)揮預(yù)期效果。而且膠束的重現(xiàn)性和大規(guī)模生產(chǎn)的可能性較低，所以熊果酸的膠束研究還有待進(jìn)一步探索。

3 納米粒

納米粒是目前較為常見的納米制劑，將藥物包載于各種高分子材料中制備成納米級的顆粒。Zhang等[32]使用兩親性甲氧基聚(乙二醇)-聚己內(nèi)酯(mPEG-PCL)嵌段共聚物作為藥物載體，通過納米沉淀法制備負(fù)載UA的納米顆粒(UA-NPs)。UA-NPs通過納米粒的EPR效應(yīng)，將UA有效轉(zhuǎn)運(yùn)到SGC-7901細(xì)胞中。試驗(yàn)表明，UA-NPs具有更高的細(xì)胞毒性，且與游離熊果酸處理過的細(xì)胞相比，其COX-2和caspase-3表達(dá)水平差異顯著。UA-NPs可以更強(qiáng)地抑制環(huán)氧化酶-2 (COX-2)和更多地激活細(xì)胞凋亡蛋白酶(caspase 3)，從而誘導(dǎo)更多的細(xì)胞凋亡。納米粒一般通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，UA-NPs在穿透細(xì)胞膜方面明顯優(yōu)于游離UA，因此，納米?？梢栽诩?xì)胞水平提高藥效。該研究為通過納米給藥系統(tǒng)提高UA在細(xì)胞水平的抗癌效率提供了有力證據(jù)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供了參考。

Alvarado等[33]用聚(dl-丙交酯-共-乙交酯)酸(PLGA)和泊洛沙姆(P188)采用溶劑置換法負(fù)載熊果酸和齊墩果酸(OA/UA-PLGA NPs)。試驗(yàn)結(jié)果表明，該納米粒6個(gè)月儲存穩(wěn)定性良好，且包封的藥物以穩(wěn)定的速率釋放，顯著增加眼組織中有效藥物的積聚，延長眼睛停留時(shí)間。針對兔子的眼部炎癥，納米制劑的抗炎效果顯著增強(qiáng)。此研究制備的納米粒側(cè)重于使藥物穩(wěn)定有效地釋放，延長作用時(shí)間，減少給藥次數(shù)，體現(xiàn)了熊果酸納米制劑的一大優(yōu)勢。

Zhao等[34]使用乳糖酸修飾、pH敏感的殼聚糖-共軛介孔二氧化硅納米復(fù)合物共同遞送熊果酸和索拉非尼(USMNs-CL)。該納米粒可以提高肝癌細(xì)胞Huh-7、SMMC-7721和HepG 2細(xì)胞的攝取，增強(qiáng)細(xì)胞毒性，抑制癌細(xì)胞增殖、黏附、遷移和血管生成。人肝癌H22細(xì)胞造模的荷瘤小鼠和肺轉(zhuǎn)移模型小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該納米制劑能夠明顯抑制肝細(xì)胞癌(HCC)的生長和轉(zhuǎn)移，對HCC的化學(xué)預(yù)防具有重要價(jià)值。此研究制備的納米粒是一種包括熊果酸和索拉非尼兩種藥物的復(fù)合物，表明熊果酸可以和某些藥物共同作用于腫瘤的治療和預(yù)防，為熊果酸納米粒的應(yīng)用提供了一種新的可能。雙藥聯(lián)用，既可以通過協(xié)同效應(yīng)增強(qiáng)藥效、降低用藥劑量，又可以通過藥理活性上的互補(bǔ)減小毒副作用，還可以延緩藥物依賴性。針對兩種不同的藥物，納米粒的遞送一方面可以控制兩種藥物的劑量，使其以最簡單有效的比例發(fā)揮預(yù)期效果；另一方面可以有效減少兩者在理化方面的相互作用，借助載體材料可以使藥物都到達(dá)靶向部位發(fā)揮療效。此外，納米粒遞送可以使藥物達(dá)到預(yù)期效果的同時(shí)減小或者延緩藥物依賴，改善甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性，更好地發(fā)揮雙藥聯(lián)用的優(yōu)勢。

Jiang等[35]設(shè)計(jì)并合成了基于介孔二氧化硅，葉酸靶向并用pH敏感的殼聚糖修飾的熊果酸納米粒(UA M-CS-FA)。體外細(xì)胞試驗(yàn)表明UA M-CS-FA抑制癌細(xì)胞生長，使細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，抑制癌細(xì)胞侵襲和遷移。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)UA M-CS-FA抑制荷瘤裸鼠的腫瘤進(jìn)展和肺轉(zhuǎn)移。UA M-CS-FA的顯著效果表明UA在抗癌和預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移方面潛力巨大。熊果酸的靶向納米粒同其他藥物的靶向納米粒一樣，介孔二氧化硅納米粒子(MSN)介孔結(jié)構(gòu)有序、體積小、生物相容性好，藥物加載到MSN中以控制藥物輸送；pH敏感的殼聚糖修飾使其在腫瘤的酸性環(huán)境中更易釋放；葉酸靶向使其集中在葉酸受體較多的腫瘤部位，體現(xiàn)出納米制劑靶向治療癌癥，減少毒副作用的優(yōu)勢。

Fan等[36]利用UA分子間的相互作用開發(fā)了無載體納米藥物(UA NPs)。簡而言之，在劇烈攪拌下將UA/乙醇溶液緩慢倒入10 mL水中，混合后超聲15 min，使UA通過分子間疏水相互作用和氫鍵相互作用，自組裝形成表面帶負(fù)電荷的UA-NPs，最后干燥其中的有機(jī)溶劑，除去沉淀物，使其通過溶劑交換的方法制備。UA NPs表現(xiàn)出更高的抗增殖活性，顯著降低COX-2/VEGFR2/VEGFA的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且提高TNF-α、IL-6和IFN-β的免疫應(yīng)激活性。研究發(fā)現(xiàn)，UA NPs可刺激CD4+T細(xì)胞的活化，這表明UA NPs具有免疫治療的潛力。由此可見，無載體的UA納米藥物可能是一種充滿前景的藥物，可進(jìn)一步增強(qiáng)其抗癌功效和免疫功能。同時(shí)，Zhao等[37]通過UA、LA和ICG自組裝開發(fā)了一種新型無載體和共組裝納米藥物UA-LA-ICG NP，用于靶向癌癥成像和有效的化學(xué)光療法。UA-LA-ICG NPs + NIR處理組在H22異種移植小鼠中顯示出明顯的抗腫瘤活性，表明這種新型納米制劑在癌癥成像和光化學(xué)療法應(yīng)用中前景廣闊。

在后來的實(shí)驗(yàn)中，涌現(xiàn)出大量關(guān)于熊果酸納米粒的研究。Zhang等[38]發(fā)現(xiàn)熊果酸的-COOH和乙二醇?xì)ぞ厶悄z束的-NH2可以通過靜電相互作用形成納米粒(UA-GC)，通過多種機(jī)制作用于腫瘤細(xì)胞，為骨肉瘤的治療提供一個(gè)新的策略。邱琳等[39]采用乳化溶劑蒸發(fā)法，制備了熊果酸納米粒(UANs)凍干粉，優(yōu)化制備處方，篩選出最佳工藝并考察其溶解度和溶出速率。Ahn等[40]在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用一種簡單的電泳法制備了葉酸偶聯(lián)熊果酸納米粒子(FA-UA)，對人口腔表皮樣癌細(xì)胞(KB)效果更明顯。Wang等[41]將金-熊果酸加載到聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)中制備納米粒子。數(shù)據(jù)表明，與對照組相比，熊果酸納米顆粒通過激活caspase和p53，抑制抗凋亡相關(guān)信號，顯著抑制了宮頸癌細(xì)胞的增殖，侵襲和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。各種關(guān)于熊果酸納米粒的制備和應(yīng)用還有很多，大量的試驗(yàn)證明了納米粒在熊果酸新型制劑中的重要作用和廣闊前景。

熊果酸的納米粒研究之所以火熱，是因?yàn)榧{米粒遞送能夠改善熊果酸的水溶性、提高生物利用度、延長半衰期。熊果酸對多種癌癥均有治療效果，以上多項(xiàng)研究表明，納米遞送的熊果酸能夠在細(xì)胞水平提高其抗腫瘤效果，增強(qiáng)其靶向作用，還可以同其他抗腫瘤藥物合用，增強(qiáng)療效的同時(shí)減少毒副作用。但是，熊果酸納米粒的應(yīng)用相對單一，大部分都是應(yīng)用于抗腫瘤，針對熊果酸的其他活性，比如抗氧化、抗炎等所涉較少。

4 納米混懸劑

納米混懸液是一種亞微級別的分散體系，將藥物均勻分散在介質(zhì)中。Wang等[42]使用流動多入口渦旋混合器(MIVM)，將含有穩(wěn)定劑[0.05%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP) K90和十二烷基硫酸鈉(SDS)]的水作為反溶劑相，含UA的乙醇溶液作為溶劑相填充，通過反溶劑沉淀法制備熊果酸納米混懸液，研究兩種不同粒徑大小的UA納米混懸液對MCF-7細(xì)胞的毒性。結(jié)果表明，粒徑為300 nm的納米懸浮液比100 nm的表現(xiàn)出更高的抗增殖活性，且細(xì)胞凋亡更多集中在早期和晚期階段，粒徑可能是UA納米懸浮液抗腫瘤效果的關(guān)鍵決定因素。此研究在制備熊果酸懸浮液的基礎(chǔ)上，通過抗增殖能力的不同篩選影響納米懸浮液療效的因素，為后續(xù)懸浮液的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

欽富華等[43]以卡波姆940為基質(zhì)，采用反溶劑沉淀法制成熊果酸納米混懸凝膠劑(UA-NS-gel)，該制劑能夠有效地增加熊果酸的皮膚滲透性能和皮膚的滯留量。結(jié)果顯示，UA-NS-gel的皮膚滲透量為普通凝膠劑UA-gel的3.66倍，皮膚滯留量是UA-gel的1.96倍。此研究突顯出熊果酸懸浮凝膠劑良好的皮膚滲透性能，為其在創(chuàng)新給藥方式方面創(chuàng)造可能性。

5 納米乳

納米乳是在表面活性劑作用下形成的乳劑，具有良好的生物相容性。Alvarado等[44]以蓖麻油作為油相，丙二醇為水相，辛酸甘油酯為表面活性劑，二乙二醇單乙醚為輔助表面活性劑制備熊果酸納米乳。體內(nèi)試驗(yàn)的結(jié)果表明，所開發(fā)的制劑無毒，對皮膚無刺激性，表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗炎能力。該發(fā)現(xiàn)明確地證實(shí)了O/W納米乳劑對包括熊果酸在內(nèi)的五環(huán)三萜類化合物在透皮吸收中具有重要價(jià)值，為其更廣泛地發(fā)揮抗炎效果提供了一種新的制劑形式。

Vargas de Oliveira等[45]以蒸餾水作為水相，丙二醇單辛酸酯(Capryol 90)和聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)/二乙二醇單乙醚(Transcutol P)作為油相，制備包載熊果酸的納米乳。生物學(xué)研究表明，含有熊果酸的納米乳劑是無毒的，且對寄生蟲的復(fù)制形式有效。此研究表明，穩(wěn)定且有效的納米乳劑是用于治療諸如南美錐蟲病等威脅性疾病非常前途的新型制劑。

熊果酸的納米乳常應(yīng)用于發(fā)揮其抗炎、抗菌作用。尤其針對皮膚炎癥，納米乳可以直接涂抹，通過透皮吸收發(fā)揮藥效，方便快捷高效。熊果酸的納米乳應(yīng)用前景廣闊，除卻口服和注射這些常見的給藥系統(tǒng)，還可以應(yīng)用于皮膚給藥，充分發(fā)揮其抗炎、抗菌的藥理活性作用；也可以用于眼部等黏膜組織給藥，針對靶向部位直接作用。由此可見，熊果酸納米乳是非常有潛力的納米制劑，當(dāng)然，也存在穩(wěn)定性差，易集聚，重現(xiàn)性不易把握等缺點(diǎn)，有待進(jìn)一步研究。

6 總結(jié)

熊果酸的藥理活性廣泛，為了改善其水溶性差，生物利用度低的問題，大量的納米制劑應(yīng)運(yùn)而生。這些納米制劑根據(jù)不同的目的而設(shè)計(jì)，有些為了增加療效；有些為了減少非靶向部位的蓄積從而減少毒副反應(yīng)；有些為了延長藥物作用時(shí)間，使其緩慢有效地釋放，但在一定程度上都是為了能夠促進(jìn)其更好地應(yīng)用于臨床。納米制劑所具有的靶向能力，對熊果酸這類藥理活性廣泛，多靶點(diǎn)的藥物，能夠使其發(fā)揮預(yù)期的治療作用，避免產(chǎn)生非治療部位的毒副反應(yīng)，治療效果更為明確。

目前研究的熊果酸納米制劑都能很好地達(dá)到預(yù)期效果，但是基本都停留在研究室基礎(chǔ)研究階段。熊果酸的藥理活性及其作用機(jī)制還在不斷探索完善，相應(yīng)的納米制劑也在不斷進(jìn)步發(fā)展中，能夠應(yīng)用于臨床實(shí)踐中的納米制劑還需進(jìn)一步研究。