汪慶玲，傅珊珊，譚春江

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；3.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是由于心臟功能或結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致心室充盈和(或)射血功能受損，心排血量不能滿足機(jī)體組織代謝需要的臨床綜合征。CHF是各種心臟疾病進(jìn)行性發(fā)展的終末階段，發(fā)病率死亡率居高不下，嚴(yán)重威脅著人類健康。

前期研究證實(shí)，心水通膠囊對(duì)CHF患者具有利水消腫、提高左室射血分?jǐn)?shù)、改善心功能的作用，能提高患者生活質(zhì)量，且未見(jiàn)毒副反應(yīng)[1-3]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該藥物能通過(guò)改善線粒體膜電位，改善心肌細(xì)胞功能，同時(shí)提高缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的存活率[1-3]。然而，該藥物對(duì)CHF心肌損傷后外周血液蛋白和凝血系統(tǒng)的影響尚不清楚?；诖?，本研究通過(guò)檢測(cè)慢性心衰大鼠N-端腦利鈉肽前體(NT-proBNP)、心肌肌鈣蛋白(cTNⅠ)、射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、凝血指標(biāo)[凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、纖維蛋白原(FIB)、凝血酶時(shí)間(TT)]的水平，研究該藥物對(duì)這些指標(biāo)的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar雄性大鼠，120只，體重(200±10)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005。動(dòng)物飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)房間，溫度(24±0.5)℃，濕度45%～50%，每天光照12 h，飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料(福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，自由飲水；醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施許可證號(hào)：SYXK(閩)2014-0005。

1.2 藥品與試劑 心水通膠囊處方中藥材黃芪、丹參、建澤瀉等購(gòu)于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院。鹽酸阿霉素(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：20180525)；卡托普利(華中藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20170403)。

1.3 儀器與設(shè)備 小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)[富士膠片(中國(guó))投資有限公司，VisualSonics Vevo 2100]；渦旋儀(IKA公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-D(III)型循環(huán)水式真空泵(邦西儀器科技有限公司)；石蠟切片機(jī)(Leica公司，RM2235)；生物組織石蠟包埋機(jī)(湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司，ZT-14S,YB-bLF)；顯微鏡照相系統(tǒng)(美國(guó)Media Cybernetics公司，DM4000B)。

2 方法

2.1 心水通膠囊中藥水提物的制備 太子參、黃芪、桂枝等中藥材，按處方比例稱量后置于圓底燒瓶，10倍量蒸餾水室溫浸泡2 h，加熱提取2次，每次2 h；過(guò)濾，合并濾液，收集濾液至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，減壓濃縮，最后得水提物高劑量相當(dāng)于生藥量濃度1.94 g·mL-1。中、低劑量由高劑量稀釋，其中中劑量相當(dāng)于心水通處方臨床等效劑量。

2.2 造模 適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)選取12只大鼠作為正常組，1.25 mL·kg-1注射生理鹽水。其余大鼠用阿霉素1.25 mg·kg-1劑量腹腔注射造模，每周2次，連續(xù)6周。

2.3 心功能檢測(cè) 造模6周后，小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)檢測(cè)各組大鼠心功能。大鼠麻醉后胸部脫毛，置于電極板上固定，連接生理信號(hào)采集系統(tǒng)，選擇大鼠心超探頭MS-250，M-Mode測(cè)量3個(gè)心動(dòng)周期的左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)和左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)，取均值計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù) (LVEF)，LVEF≤50%為模型成功。

2.4 分組和給藥 將心衰模型成功的大鼠隨機(jī)分為模型組(M)，心水通膠囊水提液低劑量(L)4.9 g·kg-1、中劑量(B)9.8 g·kg-1、高劑量(H)19.6 g·kg-13個(gè)治療組和卡托普利(D)2.25 mg·kg-1對(duì)照組。各組灌胃給予相應(yīng)劑量的藥物溶液，正常組(N)和模型組給予等容積的蒸餾水，每天1次，連續(xù)30 d。在給藥15 d、30 d后分別檢測(cè)各組大鼠心功能。

2.5 行為體征觀察指標(biāo) 觀察給藥期間各組大鼠毛發(fā)、大便、腹水、精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、飲食、體重變化以及死亡率。參照正常組大鼠的行為活動(dòng)，比較各組大鼠之間的行為體征變化情況。

2.6 血液樣本采集及檢測(cè) 給藥后麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血3～5 mL，血液送檢福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院，采用干式免疫熒光法檢測(cè)NT-proBNP、cTNⅠ濃度，儀器法檢測(cè)凝血功能相關(guān)指標(biāo)。

2.7 心肌組織HE染色 采完血后打開(kāi)胸腔，取出心臟，生理鹽水沖洗，4%多聚甲醛固定組織，梯度酒精脫水，二甲苯透明，之后石蠟包埋、切片，脫蠟、復(fù)水，蘇木精-伊紅(HE)染色，樹(shù)脂封片。鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)。

3 結(jié)果

3.1 行為體征觀察 造模期間大鼠共死亡5只，造模失敗3只。給藥期間，正常組大鼠精神狀態(tài)好，活動(dòng)多，大便正常，無(wú)腹水，體重正常增長(zhǎng)，無(wú)死亡。模型組大鼠精神狀態(tài)差，飲食減少，喜歡聚團(tuán)，出現(xiàn)腹水、便溏，皮毛黃白、松軟，體重未見(jiàn)明顯增加，死亡8只，死亡率40%；心水通低劑量組精神狀態(tài)差，皮毛黃白、松軟，喜歡聚團(tuán)，腹水明顯，體重未見(jiàn)明顯增加，死亡7只，死亡率35%；心水通中劑量組精神狀態(tài)較差，腹水較明顯，體重增加較快，死亡5只，死亡率25%；心水通高劑量組精神狀態(tài)較好，腹水不明顯，體重增加較快，死亡2只，死亡率10%；卡托普利組活動(dòng)較多，腹水較明顯，體重增加較快，死亡3只，死亡率15%。提示，心水通膠囊能改善心衰大鼠精神狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)活力，增強(qiáng)體質(zhì)，改善心衰預(yù)后，降低心衰大鼠死亡率。

3.2 大鼠心功能檢測(cè)結(jié)果 造模完成后，與正常組大鼠相比，造模大鼠LVIDs和LVIDd增加，LVEF≤50%，提示大鼠心衰模型成功。

給藥后，與模型組相比，心水通低劑量組大鼠LVIDs降低，LVEF升高(P<0.05)，LVIDd無(wú)明顯變化(P>0.05)；中、高劑量組LVIDs、LVIDd明顯降低，LVEF明顯升高(P<0.01)。同組給藥后與給藥前相比，高劑量組給藥30 d后LVIDs和LVIDd降低最明顯，LVEF升高最明顯(P<0.05)。同組給藥30 d與給藥15 d相比，模型組LVIDs、LVIDd升高，LVEF降低(P<0.05)；而高劑量組LVIDs顯著降低，且LVEF升高最明顯(P<0.05)(見(jiàn)表1)。提示，CHF模型大鼠心功能出現(xiàn)進(jìn)行性惡化，心水通膠囊干預(yù)后能增加心衰大鼠心肌收縮能力，提高LVEF。隨著治療逐漸延長(zhǎng)，其中高劑量組能顯著改善心衰大鼠心功能。

表1 給藥前后各組大鼠心功能

注：與模型組相比，ΔP<0.05，※P<0.01；同組給藥30 d、給藥15 d分別與給藥前相比，◎P<0.05；同組給藥30 d與給藥15 d相比，*P<0.05

3.3 HE染色觀察心肌變化 正常組大鼠心肌纖維排列整齊，胞核橢圓、位于細(xì)胞中間，相鄰細(xì)胞連接緊密，未見(jiàn)細(xì)胞變性、壞死；相比之下，模型組可見(jiàn)大鼠心肌細(xì)胞肥大，心肌纖維呈波浪形，可見(jiàn)部分潤(rùn)盤裂開(kāi)，胞核移位、固縮，細(xì)胞變性、壞死，間質(zhì)增寬；心水通低劑量組心肌細(xì)胞肥大程度略低于模型組，排列紊亂，胞核靠近細(xì)胞邊緣，可見(jiàn)部分肌纖維斷裂，心肌間質(zhì)增寬；心水通中、高劑量組和卡托普利對(duì)照組大鼠的心肌纖維排列較致密，細(xì)胞肥大、變性、壞死程度均較模型組降低，其中高劑量組心肌改善尤為明顯(見(jiàn)圖1)。

3.4 BNP、cTNⅠ和凝血指標(biāo)檢測(cè) 如表2可見(jiàn)，模型組大鼠血清NT-proBNP、cTNⅠ和FIB濃度顯著升高，PT、APTT、TT顯著降低，提示心肌損傷嚴(yán)重，并伴有凝血功能紊亂。與模型組相比，心水通中、高劑量組NT-proBNP、cTNⅠ、FIB水平顯著降低(P<0.01)，PT、APTT、TT水平顯著升高(P<0.01)；低劑量組大鼠cTNⅠ、FIB水平降低(P<0.05)，APTT顯著升高(P<0.01)，而NT-proBNP、PT、TT水平無(wú)顯著性差異(P>0.05)。提示，心水通中、高劑量不僅改善心肌損傷和心肌功能，同時(shí)調(diào)節(jié)凝血因子，改善血流變學(xué)，這可能是該藥物防治心衰的機(jī)制之一。

4 討論

cTNⅠ屬于心肌組織特有的肌鈣蛋白之一，以cTnI-C-T復(fù)合物和游離態(tài)cTnI兩種方式存在于心肌細(xì)胞中，機(jī)體在正常環(huán)境下血液中含量微少。當(dāng)心肌細(xì)胞受損時(shí)，心肌纖維上cTNⅠ復(fù)合物分解成游離態(tài)，胞質(zhì)中游離的cTNⅠ穿過(guò)細(xì)胞膜大量進(jìn)入血液，使血液中cTNⅠ濃度增加。有研究表明，慢心衰時(shí)cTNⅠ濃度升高可能與心臟前負(fù)荷過(guò)重、心肌肥厚引起的細(xì)胞缺血壞死、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)異常激活有關(guān)[4]。NT-proBNP是由心室肌細(xì)胞分泌的一種多肽類激素，由腦鈉肽前體裂解后形成。CHF時(shí)，心室腔壓力、容量負(fù)荷增加，心室壁擴(kuò)張和牽拉增大，鈉尿肽系統(tǒng)激活，引起NT-proBNP合成增加并進(jìn)入血液，使血液NT-proBNP濃度異常升高[5]。研究發(fā)現(xiàn)，血清cTNⅠ和NT-proBNP濃度水平與心臟LVEF呈負(fù)相關(guān)，其濃度隨心肌損傷程度、心衰程度的加重而升高，兩者對(duì)于評(píng)估慢心衰患者的心功能、治療及預(yù)后具有重要意義[6-7]。CHF患者心功能改善時(shí)，血清cTNⅠ和NT-proBNP濃度水平也同時(shí)降低。

表2 給藥30 d后各組大鼠NT-proBNP、cTNⅠ、凝血功能指標(biāo)變化

注：與模型組相比，ΔP<0.05，※P<0.01

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果(40×)

CHF時(shí)血流動(dòng)力學(xué)異常、凝血因子激活，血液呈現(xiàn)出高凝狀態(tài)，約1/3患者易出現(xiàn)較嚴(yán)重并發(fā)癥血栓[8]。研究發(fā)現(xiàn)，凝血指標(biāo)異常導(dǎo)致的血栓事件與心臟功能惡化相關(guān)[9]。心衰患者的高凝血狀態(tài)，是增加其死亡率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，臨床中抗凝血治療、預(yù)防血栓形成，不僅能改善患者預(yù)后，還可以降低死亡率[8]。凝血四項(xiàng)指標(biāo)中，PT、APTT分別是外源性、內(nèi)源性凝血系統(tǒng)中常用監(jiān)測(cè)指標(biāo)，反映了凝血因子的不同水平。FIB是一種血漿蛋白，CHF時(shí)血管內(nèi)皮受損、組織因子釋放等，可促進(jìn)血液FIB濃度升高，誘發(fā)機(jī)體血液高凝狀態(tài)，從而增加血液黏度和血小板的聚集[10]，F(xiàn)IB水平升高，是心衰危險(xiǎn)的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。TT值與血液中的肝素或類肝素物質(zhì)濃度水平有關(guān)，可觀察血中凝血因子抗凝物質(zhì)是否增多。

CHF患者多因心陽(yáng)不振或心氣不足，血行不暢，瘀血內(nèi)停，心陽(yáng)虛為本，血瘀水停為標(biāo)，屬本虛標(biāo)實(shí)之證。心水通膠囊由黃芪、太子參、丹參和建澤瀉等組成，具有益氣溫陽(yáng)利水，活血祛瘀，心腎同治之功。從超聲心動(dòng)圖結(jié)果可以看出，心水通膠囊中藥水提物，能劑量依賴性減低左室LVIDs和LVIDd，同時(shí)提高LVEF，說(shuō)明該藥物能減少心室腔壓力和容量負(fù)荷張力；從心肌HE病理圖片發(fā)現(xiàn)，心水通膠囊中藥水提物中、高劑量能降低CHF大鼠心肌細(xì)胞肥大、變性、壞死，其中高劑量最能明顯改善阿霉素引起的心肌損傷，與心水通膠囊劑量依賴性降低CHF大鼠血液NT-proBNP、cTNⅠ濃度的結(jié)果一致。心功能、病理切片、血清NT-proBNP和cTNⅠ水平等結(jié)果，說(shuō)明該藥物能降低阿霉素對(duì)心肌的毒性作用，修復(fù)重塑心肌，提高心臟射血，改善心功能。從凝血指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，心水通膠囊水提物能顯著降低心衰大鼠血液FIB濃度，提高PT、APTT、TT水平，且作用強(qiáng)度呈劑量依賴性增加。提示，心水通膠囊能改善心衰大鼠的高凝血狀態(tài)。

因此，基于以上理論，以及綜合此次實(shí)驗(yàn)的心功能、血液指標(biāo)、病理切片結(jié)果分析，心水通膠囊一方面直接作用于心肌細(xì)胞，修復(fù)損傷心肌，改善心肌功能，另一方面可能通過(guò)改善CHF凝血而改善心功能，兩者相結(jié)合，共同提高CHF大鼠生存質(zhì)量，并改善預(yù)后，降低死亡率，這與觀察到的大鼠行為體征結(jié)果相一致。前期體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，心水通膠囊能通過(guò)穩(wěn)定線粒體和溶酶體膜電位來(lái)提高缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的存活率[11]。由于凝血機(jī)制涉及多個(gè)環(huán)節(jié)[12]，該藥物可能多途徑多靶點(diǎn)作用于凝血系統(tǒng)相關(guān)的酶、蛋白、受體和因子，抑制血小板聚集途徑和凝血途徑，從而達(dá)到改善心衰大鼠體內(nèi)高凝血狀態(tài)的治療作用，但該藥物對(duì)于CHF凝血系統(tǒng)的具體作用位點(diǎn)和機(jī)制有待以后進(jìn)一步研究。