董圣軍，李欣，高天勤，劉寶輝，程春雷，吳恩剛，王玉玖

(1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濱州 256603；2.濱州市人民醫(yī)院，山東 濱州 255610；3.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南250101)

主動(dòng)脈夾層(Aortic dissection，AD)是一種非常兇險(xiǎn)的疾病，具有起病急驟、臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣、死亡率高，預(yù)后差的特點(diǎn)[1]。 文獻(xiàn)報(bào)道，其年發(fā)病率約2.9/10萬(wàn)，已成為嚴(yán)重威脅國(guó)人生命健康的重要疾病[2]。在AD發(fā)病過(guò)程中，主動(dòng)脈中層變性尤其是血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)密度與分布的改變是重要的病理特征[3]。因此，抑制VSMC增殖、遷移及表象轉(zhuǎn)換是降低血管疾病發(fā)生發(fā)展的方法之一。近年來(lái)，傳統(tǒng)中藥因來(lái)源廣泛、副作用少、病人安全應(yīng)用歷史長(zhǎng)及缺乏耐藥性等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越到關(guān)注。龍膽苦苷(Gentiopicro-side，GPS)是龍膽科龍膽屬植物龍膽的主要有效成分，大量的臨床及實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，GPS不僅有抗炎止痛[4]、保肝利膽[5]、抗氧化[6-7]等功效，近期研究發(fā)現(xiàn)，GPS可抑制心肌細(xì)胞肥厚及重構(gòu)[8]，但在血管平滑肌細(xì)胞的作用卻罕有報(bào)道。因此，本研究的宗旨在于研究GPS對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移是否存在抑制作用，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇4周左右清潔級(jí)SD大鼠[合格證號(hào)：SYXK(魯)20130019]，雌雄兼用，體質(zhì)量180～200 g，由濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑與儀器 PF-3758309 (Pak4特異性抑制劑)、噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。兔源抗大鼠Pak4、MMP-2、β-actin 抗體均購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；二喹啉甲酸 (BCA)×100蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒、組織裂解蛋白提取液、蛋白酶抑制劑均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)公司；酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotech公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；生物顯微鏡是日本Olympus公司產(chǎn)品；電泳、濕轉(zhuǎn)移槽及Western blot發(fā)光照相系統(tǒng)為美國(guó)Rio-Red公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)及分組 組織貼塊法培養(yǎng)胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞。 將大鼠處死后，將胸主動(dòng)脈取下后剔除外周結(jié)締組織，將胸主動(dòng)脈剪成小塊后放置于培養(yǎng)瓶中，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)瓶底朝上。向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入細(xì)胞培養(yǎng)基。將培養(yǎng)瓶放于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h，待組織塊貼附于瓶底后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使得組織塊被培養(yǎng)液充分覆蓋。7 d后取出培養(yǎng)瓶，更換培養(yǎng)基，觀察VSMC的生長(zhǎng)情況。此后隔天更換細(xì)胞培養(yǎng)基，直至細(xì)胞長(zhǎng)至融合成片。所有操作過(guò)程均為無(wú)菌操作。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)現(xiàn)象，原代VSMC傳代培養(yǎng)第4～6代完成純化后進(jìn)行分組干預(yù)：①對(duì)照組：不加特殊處理，僅DMEM培養(yǎng)48 h；②GPS組：給予 200 μg·mL-1GPS培養(yǎng)48 h；③PF-3758309+GPS組：加入PF-3758309(100 μmol·L-1),半小時(shí)后再給予200 μg·mL-1GPS培養(yǎng)48 h。

1.3.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 將各組VSMC細(xì)胞接種于96孔板，并給予上述干預(yù)處理。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，在37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)48 h后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，沖洗后加入MTT的培養(yǎng)液(10 μL)孵育4 h，棄去上清液，每孔加入150 mL DMEM。震蕩10 min后用酶標(biāo)儀計(jì)于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值，并重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)3次。增殖抑制率=(對(duì)照組OD值-各組實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.3.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移率 實(shí)驗(yàn)步驟依據(jù)參考文獻(xiàn)[9]。將混勻的血管內(nèi)皮細(xì)胞以5×105均勻種于6孔板內(nèi)，并鋪滿(mǎn)整個(gè)孔板。各組給予上述相應(yīng)處理后，以P200移液器槍頭垂至于6孔板劃出三條平行的“損傷”。用PBS洗細(xì)胞3次，去處劃下的細(xì)胞，加入5%胎牛血清培養(yǎng)基后，放入37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h。運(yùn)用倒置相差顯微鏡(Olympus BX61,Japan)對(duì)遷移的各組細(xì)胞進(jìn)行拍照，并計(jì)算出劃痕上下界限之間距離的平均值。經(jīng)對(duì)照組的設(shè)定為100%。

1.3.4 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PAK、MMP-2蛋白表達(dá)水平 VSMC細(xì)胞的前期培養(yǎng)與干預(yù)方案同上。各組細(xì)胞處理48 h后用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞蛋白，并根據(jù)BCA蛋白定量方法所得結(jié)果加入各組蛋白樣品。依次通過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，然后滴加抗Pak4、MMP-2(1∶1 000稀釋)4 ℃過(guò)夜，清膜、孵育對(duì)應(yīng)二抗后，再次洗膜后用配置新鮮發(fā)光液進(jìn)行曝光顯影，Bio-Rad照相系統(tǒng)進(jìn)行照相并用其附帶的軟件分析蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 GPS對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖率的影響 MTT法結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，GPS組作用細(xì)胞后的吸光度明顯降低(P<0.01)；與GPS組相比，PF-3758309+GPS組作用細(xì)胞后的吸光度明顯上升(P<0.05)。表明GPS對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的增殖存在一定的抑制作用，而PF-3758309可以逆轉(zhuǎn)GPS對(duì)血管平滑肌增殖的抑制作用(見(jiàn)圖1)。

2.2 GPS對(duì)血管平滑肌細(xì)胞遷移率的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：與對(duì)照組相比，GPS組細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)所致“損傷”邊界的距離顯著降低(P<0.01)；而與GPS組相比，PF-3758309+GPS組“損傷”邊界的距離顯著增加(P<0.05)。表明GPS對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的遷移能力存在一定的抑制作用，而PF-3758309可以逆轉(zhuǎn)GPS對(duì)血管平滑肌的遷移能力的抑制作用(見(jiàn)圖2)。

圖2 GPS對(duì)血管平滑肌細(xì)胞遷移率的影響

2.3 GPS對(duì)血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)Pak4、 MMP-2蛋白表達(dá)水平的影響 Western blot法結(jié)果提示：與對(duì)照組相比，GPS組細(xì)胞內(nèi)Pak4蛋白表達(dá)水平、 MMP-2蛋白表達(dá)水平水平明顯降低(P<0.01)；而與GPS組相比，PF-3758309+GPS組細(xì)胞內(nèi)MMP-2蛋白表達(dá)水平水平明顯上升(P<0.05)。表明GPS對(duì)血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)Pak4、MMP-2蛋白表達(dá)水平有一定抑制作用，而PF-3758309可以逆轉(zhuǎn)GPS對(duì)血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)MMP-2蛋白表達(dá)水平的抑制作用(見(jiàn)圖3)。

圖3 GPS對(duì)血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)Pak4、MMP-2蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

主動(dòng)脈夾層是指主動(dòng)脈腔內(nèi)血液從主動(dòng)脈內(nèi)膜撕裂處進(jìn)入主動(dòng)脈中膜，使中膜分離，并沿主動(dòng)脈長(zhǎng)軸方向擴(kuò)展，形成主動(dòng)脈壁的二層分離狀態(tài),是累及主動(dòng)脈的災(zāi)難性疾病[10]。引起主動(dòng)脈壁撕裂的主要因素：①主動(dòng)脈中層有病理改變(基礎(chǔ))；②心臟搏動(dòng)引起的主動(dòng)脈運(yùn)動(dòng)；③左心室射血對(duì)動(dòng)脈壁的沖擊力。囊性中膜壞死、纖維化、彈力纖維變脆是AD特有的組織病理學(xué)改變。主動(dòng)脈中層退行性變被認(rèn)為是主動(dòng)脈夾層發(fā)病的主要病理基礎(chǔ)[3]。主動(dòng)脈中層由血管平滑肌(SMC)及膠原纖維、黏多糖等構(gòu)成的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。因此，抑制 VSMC 過(guò)度增殖、遷移及ECM降解是AD形成過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)[11]。而降解ECM最主要的酶——基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在AD的形成過(guò)程中起著十分重要的作用。

GPS屬于裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物，其分子式是C16H20O9，是龍膽屬植物的主要藥效成分之一。GPS的給藥途徑也多種多樣，龍膽根提取物基本都可以溶解在酒精和水中，所以可以將藥物加在酒精酊溶液、酒精溶液和茶中，更容易被患者接受[12]。除了有抗炎、止痛、保肝利膽等作用外。在心血管方面，王戈等[8]發(fā)現(xiàn)GPS可抑制心肌細(xì)胞肥厚及重構(gòu)；喬慧蓮等[13]發(fā)現(xiàn)，GPS可以減輕缺血再灌注致的心肌細(xì)胞凋亡。GPS對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移作用及MMP-2表達(dá)量是否存在作用卻罕有研究。在本研究中對(duì)血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示GPS血管平滑肌細(xì)胞的增殖率與遷移率均有一定的抑制作用；在Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GPS可明顯降低血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)MMP-2、PKA的蛋白表達(dá)水平。上述結(jié)果表明GPS不僅能抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移，更有可能通過(guò)降低MMP-2的蛋白表達(dá)水平，阻止細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)一步增加了主動(dòng)脈中層結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。且GPS對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移的抑制作用可能與Pak4相關(guān)。

P21激活激酶(p-21 activated kinase，Paks)是一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為Rho家族小鳥(niǎo)苷三磷酸酶(Rho-GTPaSe) Cdc42/Racl、生長(zhǎng)因子信號(hào)的下游主要靶蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[14]。迄今為止PAK家族共發(fā)現(xiàn)6個(gè)成員，其中Pak4是首先被發(fā)現(xiàn)且目前研究得最深入的成員，它在組織發(fā)育過(guò)程中及成熟組織中廣泛表達(dá)，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、生存、增殖及遷移侵襲中起作用[15]。在心血管方面，Pak4 在心臟胚胎發(fā)育過(guò)程中是必須的，在胚胎時(shí)期高表達(dá) 而在成熟后表達(dá)量明顯減少[16]。在血管平滑肌細(xì)胞中，GPS可明顯降低血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)Pak4蛋白表達(dá)水平，提示Pak4可能參與GPS對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移能力的作用。本實(shí)驗(yàn)組通過(guò)應(yīng)用PF-3758309(Pak4特異性抑制劑)發(fā)現(xiàn)，GPS對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增值率、遷移率及MMP-2蛋白表達(dá)水平。PF-3758309可顯著逆轉(zhuǎn)由GPS導(dǎo)致的血管平滑肌細(xì)胞增殖率、遷移率及細(xì)胞內(nèi)MMP-2蛋白表達(dá)水平的抑制作用。進(jìn)一步提示GPS對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移的抑制作用可能與Pak4相關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)GPS對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移存在一定的抑制作用，其作用機(jī)制可能通過(guò)抑制Pak4降低血管平滑肌細(xì)胞內(nèi) MMP-2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。上述實(shí)驗(yàn)為GPS防治主動(dòng)脈夾層病理過(guò)程中血管中層重構(gòu)提供了部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。