曾 晶，戢穎瑞，藍(lán)東明，楊 博，戚穗堅(jiān)，王衛(wèi)飛

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640； 2.華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510006； 3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所， 廣州 510610)

反式脂肪酸一般是指化學(xué)結(jié)構(gòu)上至少含有1個(gè)非共軛反式構(gòu)型雙鍵的不飽和脂肪酸，包括反式單不飽和脂肪酸和反式多不飽和脂肪酸。在食品中最常見的反式脂肪酸是反式油酸，主要來源于天然動(dòng)植物油脂的氫化加工過程。研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)植物油脂中的不飽和脂肪酸，如油酸、亞油酸、亞麻酸等，由于熱穩(wěn)定性差，在熱加工過程中易形成反式異構(gòu)體[1- 2]。這些具有反式雙鍵的脂肪酸與其順式結(jié)構(gòu)相比，在人和動(dòng)物體內(nèi)的生理功能和代謝過程有顯著的差異[3-4]。

長(zhǎng)鏈ω-3多不飽和脂肪酸(ω-3PUFA)特別是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)具有防治心腦血管疾病、促進(jìn)腦組織及視網(wǎng)膜的正常生長(zhǎng)發(fā)育等生理作用，是維持人體健康的重要脂肪酸[5-8]。EPA和DHA是天然脂肪酸，主要來源于海洋魚油和部分藻類油脂。從天然動(dòng)植物原料中提取得到富含EPA、DHA的油脂后，需要加工處理才能作為食品、保健品或醫(yī)藥品的原材料使用。與油酸和亞油酸相比，EPA和DHA分子中的雙鍵數(shù)目更多，在精煉加工或其他處理工藝中更容易發(fā)生反式異構(gòu)化[9]。

由于EPA和DHA在人和動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、維持生理健康等方面具有重要的功能，人們對(duì)反式EPA/DHA越來越關(guān)注。本文對(duì)反式EPA/DHA的來源、檢測(cè)技術(shù)與生理功能進(jìn)行了綜述分析，以期為EPA和DHA等長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的深加工技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 反式EPA/DHA的來源

反式長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸產(chǎn)生的途徑有生物轉(zhuǎn)化、化學(xué)催化劑(對(duì)甲苯磺酸)催化異構(gòu)化和高溫處理等[10]。

根據(jù)產(chǎn)生途徑，可將反式EPA/DHA來源分為兩類：一類為天然存在的，其產(chǎn)生途徑是由生物體中的亞麻酸反式異構(gòu)體在特殊酶的作用下生物轉(zhuǎn)化。天然存在的反式EPA/DHA很少，一般分布在動(dòng)物體內(nèi)以及一些微藻的體內(nèi)；另一類是加工過程中產(chǎn)生的，加工過程中的催化劑和高溫會(huì)促使EPA和DHA發(fā)生反式異構(gòu)化，特別是油脂精煉加工(脫臭)、油脂使用過程中(煎炸、烹飪等)高溫處理環(huán)節(jié)會(huì)產(chǎn)生反式EPA/DHA，這是反式EPA/DHA的主要來源。

1.1 反式EPA/DHA的天然來源

自然界中存在微量的反式EPA/DHA，在生物體內(nèi)反式EPA/DHA由亞麻酸反式異構(gòu)體在特殊酶的作用下經(jīng)延長(zhǎng)、去飽和轉(zhuǎn)化而來。研究發(fā)現(xiàn)，9cis, 12cis, 15trans亞麻酸會(huì)在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)化為5cis, 8cis, 11cis,14cis, 17transEPA[11]。Chardigny等[11]在大鼠的肝臟中檢測(cè)到11transEPA和11trans,17transEPA兩種反式EPA異構(gòu)體，研究發(fā)現(xiàn)這兩種異構(gòu)體分別由9trans,12cis,15cis和9trans,12cis,15trans亞麻酸轉(zhuǎn)化而來，這兩種亞麻酸反式異構(gòu)體是精煉油脂和煎炸油脂中常見的反式脂肪酸。據(jù)報(bào)道，在大鼠的許多組織中，反式亞麻酸會(huì)被延長(zhǎng)、去飽和。用熱處理后的亞麻籽油(富含反式亞麻酸)喂養(yǎng)大鼠8周后，在大鼠視網(wǎng)膜和肝臟中均發(fā)現(xiàn)了EPA和DHA的反式異構(gòu)體。與血液、視網(wǎng)膜和肝臟中的情況相反，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，腦組織中不能積累反式DHA[12]。Ferreri等[13]首次證實(shí)了大鼠攝入含有一個(gè)反式雙鍵的EPA異構(gòu)體后，反式EPA結(jié)合在肝臟的線粒體膜上。在人體內(nèi)，反式EPA/DHA主要分布于肝臟、血液及體脂肪中，但含量均很低。Chardigny等[14]對(duì)人體血小板脂肪酸中的EPA、DHA進(jìn)行了研究，在大部分樣品中均檢測(cè)到17transEPA(約為總脂肪酸的0.48%)，在一些樣本中還有19transDHA(最大含量約為總脂肪酸的0.05%)。

此外，一些海洋生物中也含有不常見的反式長(zhǎng)鏈脂肪酸，如Marty等[15]在扇貝中檢測(cè)到其特有脂肪酸——4cis,7cis,10cis,13transC22∶4。海洋微藻類微生物體內(nèi)也含有ω-3系列的transPUFA，如Chang等[16]在海洋半角藻屬圓形伊曼托尼亞菌株發(fā)現(xiàn)了在ω-3位置具有單個(gè)反式雙鍵的C18～C22 反式ω-3多不飽和脂肪酸。這些反式ω-3多不飽和脂肪酸的種類及含量分別為9cis，12cis，15transC18∶3(0.2%～1.8%)、6cis，9cis，12cis，15transC18∶4(1.9%～4.1%)、3cis，6cis，9cis，12cis，15transC18∶5(0.7%～8.8%)、5cis，8cis，11cis，14cis，17transC20∶5(1.2%～4.1%)以及4cis，7cis，10cis，13cis，16cis，19transC22∶6(0.3%～4.3%)。

1.2 反式EPA/DHA的加工來源

油脂加工過程產(chǎn)生反式脂肪酸的原理是在高溫或者催化劑的作用下，脂肪酸鏈中的分子發(fā)生化學(xué)鍵旋轉(zhuǎn)，從而生成反式異構(gòu)體。溫度和催化劑是脂肪酸分子雙鍵發(fā)生順反異構(gòu)化的限制性因素。在常溫且沒有催化劑的條件下，順式的不飽和脂肪酸幾乎不發(fā)生異構(gòu)化反應(yīng)；但當(dāng)溫度超過一定值時(shí)，不飽和脂肪酸的異構(gòu)化反應(yīng)在不借助任何催化劑的情況下也很容易進(jìn)行，從而生成反式脂肪酸異構(gòu)體[17-18]。相對(duì)于油脂部分氫化產(chǎn)生的反式脂肪酸而言，經(jīng)過高溫精煉工藝的動(dòng)植物油脂中反式脂肪酸的組成要簡(jiǎn)單得多，因?yàn)橛椭诟邷叵聝H發(fā)生順反異構(gòu)，不發(fā)生位置異構(gòu)[19]。催化劑一般應(yīng)用于油脂氫化過程，魚油精煉加工過程中很少或不用催化劑，而溫度貫穿于油脂精煉脫臭以及后期使用(煎炸、烹飪)全過程。研究發(fā)現(xiàn)，海洋魚油深加工過程中分子蒸餾和脫臭處理溫度過高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致EPA和DHA反式異構(gòu)體的產(chǎn)生，這是反式EPA/DHA的主要來源。溫度是魚油加工、使用過程中產(chǎn)生反式EPA/DHA的主要因素。因此，引起EPA、DHA反式異構(gòu)化的溫度閾值成為海洋魚油加工工藝研究中的重要內(nèi)容。

Wijesundera等[20]將EPA乙酯或EPA裝在10 mL具塞離心管中，在常壓狀態(tài)下置于220℃的硅油浴中加熱5 h后發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生EPA反式異構(gòu)體，但雙鍵的位置不會(huì)發(fā)生變化。Fournier等[21]在180℃脫臭處理半精煉魚油3 h，發(fā)現(xiàn)EPA、DHA僅有微弱的反式異構(gòu)化反應(yīng)發(fā)生；當(dāng)脫臭溫度為220℃和250℃時(shí)，反式EPA和反式DHA含量分別達(dá)到4.2%和7.6%；但是，即使脫臭溫度在250℃以上時(shí)，主要的反式異構(gòu)體也只含有1個(gè)或2個(gè)反式雙鍵。Fournier等[22]分別在180、220℃和250℃下脫臭處理半精煉魚油時(shí)，發(fā)現(xiàn)由高溫(熱)引起的EPA、DHA反式異構(gòu)化過程是一個(gè)定向的異構(gòu)化反應(yīng)，脂肪酸鏈上某些位置的雙鍵更容易發(fā)生異構(gòu)化，如ω-3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸比ω-6長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸更容易發(fā)生反式異構(gòu)化。Mj?s等[23]在常壓、140～240℃下熱處理濃縮魚油乙酯2～8 h，發(fā)現(xiàn)在180℃以上時(shí)加熱EPA、DHA 2 h以上有明顯的反式異構(gòu)化；相比已報(bào)道的亞油酸和亞麻酸，所有順式異構(gòu)體的異構(gòu)化速率常數(shù)(k)更大，而且lnk和熱處理溫度(熱力學(xué)溫度)的倒數(shù)呈線性關(guān)系。另外，在煎炸和燒烤魚油類食品時(shí)，也可能會(huì)產(chǎn)生反式EPA/DHA。Sebedio等[24]在利用菜籽油煎炸的鯖魚的脂肪中檢測(cè)到了5cis,8trans,11cis,14trans, 17cisC20∶5，其含量低于總EPA的0.1%。

海洋魚油深加工后一般作為食品和醫(yī)藥保健品原料進(jìn)行使用，在加工過程中產(chǎn)生的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的反式異構(gòu)體也隨之進(jìn)入食品或醫(yī)藥保健品中。Sciotto等[25]收集了歐洲市場(chǎng)上77種ω-3產(chǎn)品，并對(duì)其中的反式EPA/DHA含量進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，單反式EPA占全順式EPA的0.19%～4.51%，單反式DHA占全順式DHA的0.25%～5.89%；在所收集到的樣品中，EPA的異構(gòu)體和DHA的異構(gòu)體具有顯著的對(duì)應(yīng)關(guān)系，一般反式DHA與順式DHA的比例是反式EPA與順式EPA比例的1.26倍；對(duì)樣本進(jìn)行分類分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)品的脫臭處理是產(chǎn)生反式異構(gòu)體的主要原因，而且反式異構(gòu)化可以在加工中避免(見表1)。Menounou等[26]收集了意大利和西班牙共19份含有DHA補(bǔ)充劑的膠囊，對(duì)其中的反式DHA進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)單反式DHA含量為0.11%～2.70%， DHA含量較高的產(chǎn)品中單反式DHA含量也較高，不同碳位上的單反式DHA也有差異性，4transC22∶6ω-3的含量總體最低(見表2)。

表1 歐州市場(chǎng)ω-3產(chǎn)品反式EPA/DHA的含量[25]

表2 意大利和西班牙市場(chǎng)DHA補(bǔ)充劑中反式DHA含量調(diào)查情況[26]

2 反式EPA/DHA的檢測(cè)技術(shù)

目前，關(guān)于反式長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸檢測(cè)技術(shù)的報(bào)道不多，基本還處于探索階段。反式異構(gòu)體的數(shù)量遵照2n原則，其中n為雙鍵數(shù)目。由于雙鍵數(shù)目較多，EPA和DHA的反式異構(gòu)體的種類較多，難以對(duì)每個(gè)異構(gòu)體進(jìn)行分離，現(xiàn)階段的檢測(cè)技術(shù)也只能確定單反式和雙反式異構(gòu)體的反式雙鍵數(shù)量以及位置，難以對(duì)所有的反式異構(gòu)體進(jìn)行分離鑒別，反式EPA/DHA的檢測(cè)技術(shù)還有待進(jìn)一步發(fā)展。

色譜法是檢測(cè)順/反脂肪酸的常見方法，檢測(cè)反式EPA/DHA關(guān)鍵在于將順式和反式EPA/DHA分離。但由于EPA和DHA脂肪酸鏈長(zhǎng)度和雙鍵數(shù)目的特殊性，利用常規(guī)的色譜分離方法難以將反式異構(gòu)體分離。為了更好地分離EPA和DHA反式異構(gòu)體，準(zhǔn)確地測(cè)定反式異構(gòu)體含量，還需要輔以銀離子色譜等分離技術(shù)。一般的處理方法是先用色譜分離純化EPA和DHA脂肪酸甲酯，再利用銀離子色譜將EPA、DHA反式異構(gòu)體分開，最后進(jìn)行定量分析。為了確保氣相色譜分離效果，一般采用強(qiáng)極性色譜柱(如CP-Sil 88,SP-2560,BPX-70)，再使用氫火焰離子化檢測(cè)器或質(zhì)譜檢測(cè)器對(duì)反式EPA/DHA進(jìn)行檢測(cè)，由于缺少反式EPA/DHA的標(biāo)準(zhǔn)品， 其定量方法大多采用面積歸一化法，誤差較大。

Fournier等[21]將熱處理后的魚油甲酯化，利用反相液相色譜(RP-HPLC)分離純化得到EPA、DHA甲酯，然后利用銀離子液相色譜和銀離子薄層色譜分離EPA、DHA的反式異構(gòu)體，最后利用氣相色譜對(duì)得到的異構(gòu)體進(jìn)行定量和定性分析。在優(yōu)化的操作流程和分析條件下，可以對(duì)EPA及其反式異構(gòu)體進(jìn)行定性分析。由于全順式的DHA和單反式雙鍵的DHA異構(gòu)體在銀離子液相色譜分離時(shí)有共洗脫現(xiàn)象，該方法還不能用于DHA及其反式異構(gòu)體的定量檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)半精煉海洋魚油進(jìn)行高溫處理(250℃，3 h)后，得到的EPA、DHA異構(gòu)體中，僅檢測(cè)到含有1、2個(gè)反式雙鍵的EPA異構(gòu)體和含有1、2、3個(gè)反式雙鍵的DHA異構(gòu)體；而且11transEPA和14transEPA是其主要的單反式雙鍵異構(gòu)體，這可能是由于EPA的ω-9位雙鍵處在碳鏈的中間位置，更易于發(fā)生反式異構(gòu)化，相應(yīng)地在DHA分子中，其ω-9、12位的雙鍵更易于反式異構(gòu)化。Mj?s等[27]利用銀離子液相色譜分離純化EPA和DHA甲酯的反式異構(gòu)體，并進(jìn)行了氣相色譜分析，得到分別含有1、2、3、4、5個(gè)反式雙鍵的反式異構(gòu)體。EPA的主要異構(gòu)體為含有1個(gè)和2個(gè)反式雙鍵的反式EPA，DHA的主要異構(gòu)體為含有1、2、3個(gè)反式雙鍵的DHA。

為了建立更為便捷的反式EPA/DHA檢測(cè)方法，Mj?s等[23]在常壓下熱處理濃縮EPA、DHA乙酯，不經(jīng)分離純化直接利用GC-MS分析含有單反式雙鍵的EPA、DHA異構(gòu)體的含量，發(fā)現(xiàn)含有單反式雙鍵的EPA、DHA異構(gòu)體的含量和全順式異構(gòu)體的變化量呈線性關(guān)系，可以用來預(yù)測(cè)反式異構(gòu)體的總量。氣相色譜分離和檢測(cè)反式脂肪酸時(shí)一般采用強(qiáng)極性色譜柱，最常用的是以羥甲基聚硅氧烷為固定液的毛細(xì)管色譜柱。Sciotto等[25]將其在歐洲市場(chǎng)上收集的ω-3產(chǎn)品甲酯化后，利用BPX-70色譜柱直接測(cè)定反式EPA、DHA含量，發(fā)現(xiàn)單反式EPA占全順式EPA的0.19%～4.51%，單反式DHA占全順式DHA的0.25%～5.89%。Fournier等[28]利用CP-Sil 88氣相色譜柱測(cè)定熱處理后半精煉金槍魚油中反式EPA、DHA的含量，發(fā)現(xiàn)直接檢測(cè)法(不經(jīng)過銀離子色譜分離)適用于反式異構(gòu)體含量較少的EPA、DHA樣品，EPA和DHA反式異構(gòu)體的定量限分別為0.16 g/100 g和0.56 g/100 g，而且該方法具有良好的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性。

由于缺少反式EPA和DHA的標(biāo)準(zhǔn)品，反式EPA/DHA的反式雙鍵數(shù)目還無法確定，但可以通過核磁共振技術(shù)鑒別出反式雙鍵的位置[29-30]。鑒別反式雙鍵位置的方法是先建立EPA/DHA單反式異構(gòu)體的脂質(zhì)庫，單反式異構(gòu)體的合成有兩種方法：一是順式EPA/DHA甲酯直接噻吩基自由基催化異構(gòu)化；二是順式EPA/DHA甲酯通過單環(huán)氧化物作為中間體，然后消除雙鍵位置兩步合成反式異構(gòu)體[26]。第二種為常見構(gòu)建單反式EPA/DHA標(biāo)準(zhǔn)品方法，該方法全程通過二維核磁共振波譜進(jìn)行掃描，由于烯烴的順反異構(gòu)體的耦合常數(shù)存在差異，雙鍵 消除的位點(diǎn)即可確定為反式雙鍵的位置。Menounou等[26]對(duì)從意大利和西班牙收集的19份含有DHA補(bǔ)充劑的軟膠囊甲酯化后，利用DB23氣相色譜柱直接測(cè)定順、反式脂肪酸含量，發(fā)現(xiàn)單反式DHA含量為0.11%～2.70%，DHA含量較高的產(chǎn)品中單反式DHA含量也較高；然后利用13C NMR確定反式烯烴的位置，發(fā)現(xiàn)單反式DHA的反式烯烴的位置分別在4， 13，19碳位上。反式EPA/DHA檢測(cè)方法見表3。

表3 反式EPA/DHA檢測(cè)方法

3 反式EPA和DHA生理功能

反式脂肪酸對(duì)生物體的有益或有害的生理功能取決于反式脂肪酸在生物體內(nèi)的代謝特征。反式脂肪酸在動(dòng)物體內(nèi)的代謝特征與順式脂肪酸有明顯的不同，由于反式脂肪酸(油酸)對(duì)肝臟中的n-6脫氫酶的活性具有抑制作用，食用反式脂肪酸(油酸)可以使得動(dòng)物體內(nèi)亞油酸含量升高，花生四烯酸(AA)和DHA含量降低[36]。在動(dòng)物體內(nèi)含有反式雙鍵的亞麻酸可以通過碳鏈延長(zhǎng)和脫氫產(chǎn)生帶有反式雙鍵的EPA、DHA異構(gòu)體。

有一個(gè)常見的具有誤導(dǎo)性的假設(shè)是，所有的反式脂肪酸都有相似的代謝和影響。然而，反式脂肪酸的生物活性還與脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度、雙鍵數(shù)目以及反式雙鍵位點(diǎn)有關(guān)。反式EPA/DHA脂肪酸碳鏈更長(zhǎng)、雙鍵數(shù)目更多以及反式雙鍵位點(diǎn)多樣，以致于其生理功能與十八碳反式脂肪酸截然不同。研究表明，反式油酸、反式亞油酸等會(huì)增加心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)，危害人體健康。而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，反式EPA/DHA具有抗炎、抗腫瘤以及調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等生理功能。

Lo?等[37]考察了11transEPA、17transEPA和11trans, 17transEPA 3種反式EPA異構(gòu)體對(duì)大鼠血小板聚集和AA氧化作用的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：11transEPA和11trans, 17transEPA的抗凝聚效果是全順式EPA的2倍，3種反式EPA異構(gòu)體均可以抑制環(huán)氧合酶代謝產(chǎn)物的生成；進(jìn)一步的研究表明11trans的雙鍵可能是引起反式EPA異構(gòu)體和全順式EPA分子具有不同生理功能的原因。Zaima等[38]研究發(fā)現(xiàn)，反式EPA幾何異構(gòu)體可以通過抑制SREBP-1c和PGC-1b減少LXRa誘導(dǎo)的細(xì)胞三酰甘油，從而調(diào)節(jié)血脂水平。EPA的反式異構(gòu)體增加了EPA對(duì)脂肪生成基因表達(dá)的有利作用，在體內(nèi)反式EPA比順式EPA更能降低血脂濃度。Okada等[4]研究發(fā)現(xiàn)，喂養(yǎng)反式DHA的實(shí)驗(yàn)組大鼠，其血漿總脂質(zhì)水平(191 mg/dL)、總膽固醇水平(48.2 mg/dL)顯著低于喂食大豆油的對(duì)照組(286、68.0 mg/dL)，喂養(yǎng)反式EPA的實(shí)驗(yàn)組大鼠血漿總脂質(zhì)水平(233 mg/dL)、總膽固醇水平(53.7 mg/dL)顯著低于喂食大豆油的對(duì)照組(286、68.0 mg/dL)。反式EPA/DHA可改變大鼠血漿脂質(zhì)組成，促進(jìn)大鼠脂質(zhì)代謝。Zheng等[39]發(fā)現(xiàn)南極磷蝦反式EPA/DHA對(duì)MCF-72等7種不同類型腫瘤細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制活性，且其抑制活性比來自市售魚油、阿穆爾魚肝油及標(biāo)準(zhǔn)品的3種順式EPA/DHA高3～7倍。

4 展 望

脂肪酸組成和性質(zhì)對(duì)于油脂的理化性質(zhì)和生理功能具有重要意義，EPA和DHA是最重要的兩種長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，對(duì)人體生長(zhǎng)發(fā)育、維持健康具有重要的作用。從總體上看，順式EPA/DHA的研究已較為深入，但反式EPA/DHA的研究還處于起始階段。首先，通用的檢測(cè)與定性定量分析方法尚未建立。EPA和DHA中的雙鍵數(shù)目較多，難以區(qū)分開是哪個(gè)位置上的雙鍵反式異構(gòu)體；同時(shí)，由于缺少反式EPA和DHA的標(biāo)準(zhǔn)品，難以對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。其次，關(guān)于長(zhǎng)鏈反式多不飽和脂肪酸生理功能的基礎(chǔ)研究較少。研究發(fā)現(xiàn)，反式EPA/DHA具有與反式油酸、反式亞油酸等十八碳反式脂肪酸不同的生物活性，現(xiàn)有研究表明反式EPA/DHA在抗炎、促進(jìn)脂質(zhì)代謝以及抗腫瘤方面具有廣泛的應(yīng)用前景。反式EPA/DHA與順式EPA/DHA在生理功能上有相似性，甚至反式EPA/DHA的生理功效更佳，但目前的相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持不夠充分，需要進(jìn)行大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，以及更加廣泛和深入的探索。