李啟潤(rùn)，張小強(qiáng)，崔新健，趙 磊，代昌平，蔣小崗，張 健

蘇州大學(xué)藥學(xué)院，蘇州 215123

佛波醇酯(phorbol ester)——二萜類(lèi)化合物，廣泛存在于大戟科和瑞香科植物中，具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗HIV、抗炎、抗菌等[1-4]。其中，12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate,TPA)在進(jìn)行白血病治療的臨床II期試驗(yàn)[5]，12-去氧佛波醇-13-乙酯(prostratin)在進(jìn)行抗艾滋病(human immunodeficiency virus,HIV)的臨床I期試驗(yàn)[6]。佛波醇酯化合物結(jié)構(gòu)相近，化合物的分離具有工作繁瑣、分離難度大、量微等缺點(diǎn)，這就對(duì)佛波醇酯的生物活性測(cè)試和構(gòu)效關(guān)系研究帶來(lái)困難；佛波醇酯生物活性多樣，但也具有一定的毒性，但其毒性與化合物結(jié)構(gòu)關(guān)系研究較少，本研究首先對(duì)巴豆油水解工藝進(jìn)行優(yōu)化，制備佛波醇(phorbol)；并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，以二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)為代表的長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸和以花生酸為代表的長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸對(duì)佛波醇進(jìn)行酯化反應(yīng)；考察了佛波醇酯化衍生物對(duì)人正常胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)的毒性；實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為佛波醇酯類(lèi)藥物制備提供參考。

1 試劑與方法

1.1 儀器與試劑

Rudolph AutopolII旋光儀；Bruker VERTEX 70紅外光譜儀；Shimadzu UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；Agilent 1260高效液相色譜儀；Agilent 6540超高解析度四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀；Unity Inova 400、600MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀；TECAN INFINITE M1000多功能酶標(biāo)儀。

佛波醇(phorbol)和二十碳五烯酸(EPA)為實(shí)驗(yàn)室自制，二十二碳六烯酸(購(gòu)于MedChemExpress 公司)。其他試劑與溶劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 佛波醇制備工藝優(yōu)化

佛波醇制備工藝目前比較成熟[7,8]，但其制備周期需一周左右，為了縮短制備周期，本研究從水解時(shí)堿的濃度、水解時(shí)間、調(diào)節(jié)pH的節(jié)點(diǎn)、柱層析的選擇四個(gè)方面對(duì)制備過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化。

1.3 佛波醇衍生物合成線路

佛波醇結(jié)構(gòu)修飾過(guò)程主要包括羥基的選擇性保護(hù)、選擇性酯化、去保護(hù)等[9,10]。

圖1 佛波醇衍生物合成路線Fig.1 Synthesis of phorbol derivatives

1.4 化學(xué)合成

1.4.1 中間體(Z1、Z2)

參照文獻(xiàn)[9,11]制備得到中間體佛波醇-13，20-二乙酯(Z1)和佛波醇-20-三苯基甲醚(Z2)。

1H NMR (CDCl3,600 MHz)δ:7.56 (1H,s,H-1),5.66 (1H,m,H-7),4.45 (2H,m,H-20),3.98 (1H,d,J=9.8 Hz,H-12),3.20 (1H,s,H-8),3.12 (1H,s,H-10),2.51/2.38 (2H,dd,J=19.2 Hz,H-5),2.10 (3H,s,COCH3),2.04 (3H,s,COCH3),1.98 (1H,m,H-11),1.22 (3H,s,H-16),1.21 (3H,s,H-17),1.02 (1H,d,J=5.7 Hz,H-14),1.01 (1H,d,J=6.5 Hz,H-18)。(中間體Z1，白色固體，1.90 g，產(chǎn)率80%)。

1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:7.51 (1H,s,H-1),7.39 (6H,m,Tr),7.28 (6H,m,Tr),7.22 (3H,m,Tr),5.55 (1H,m,H-7),4.11 (1H,d,J=10.8 Hz,H-12),3.54 (2H,m,H-20),3.03 (1H,s,H-8),2.91 (1H,s,H-10),2.41/2.34 (2H,dd,J=19.2 Hz,H-5),1.85 (1H,m,H-11),1.73 (3H,m,H-19),1.27 (3H,s,H-16),1.14 (3H,s,H-17),1.00 (1H,d,J=6.2 Hz,H-18),0.76 (1H,d,J=5.2 Hz,H-14)。(中間體Z2，淡黃色固體，1.946 g，產(chǎn)率58%)。

1.4.2 佛波醇-12，13，20-三二十碳五烯酸酯(1)，佛波醇-13，20-二二十碳五烯酸酯(2)

在100 mL圓底燒瓶中投入佛波醇(150 mg，0.41 mmol)，二十碳五烯酸(457 mg，1.5 mmol)，DMAP(153 mg，1.23 mmol)和EDCI(485 mg，2.46 mmol)，用20 mL二氯甲烷溶解，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。待反應(yīng)完畢，經(jīng)后處理用硅膠柱層析得產(chǎn)物1(石油醚∶乙酸乙酯 =20∶1，300 mg，60%)。

參照產(chǎn)物1的合成，不同的是所用原料、催化劑、反應(yīng)時(shí)間均減小一半，得產(chǎn)物2(石油醚∶乙酸乙酯 =5∶1，247 mg，68%)。

1.4.3 佛波醇-13-二十碳五烯酸酯(3)，佛波醇-13-花生酸酯(4)，佛波醇-13-二十二碳六烯酸酯(5)，佛波醇-12，13-二二十碳五烯酸酯(6)，佛波醇-12，13-二花生酸酯(7)

在100 mL圓底燒瓶中投入中間體Z2(200 mg，0.33 mmol)，二十碳五烯酸(150 mg，0.5 mmol)，DMAP(60 mg，0.5 mmol)和EDCI(190 mg，1 mmol)，用20 mL二氯甲烷溶解，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。待反應(yīng)完畢，經(jīng)后處理用硅膠柱柱層析洗脫得粗品(石油醚∶乙酸乙酯 =3∶1，174 mg，33.7%)，將粗品加入10 mL 0.35 %高氯酸甲醇溶液反應(yīng)60 min，加入適量NaHCO3中和反應(yīng)，回收溶劑。加入水和二氯甲烷分層，經(jīng)后處理用硅膠柱層析得產(chǎn)物3(石油醚∶乙酸乙酯 =1∶1，105 mg，80%)。

參照產(chǎn)物3的合成，得產(chǎn)物4(石油醚∶乙酸乙酯 =3∶2，160 mg，88%)，產(chǎn)物5(石油醚∶乙酸乙酯 =1∶1，86mg，74%)，產(chǎn)物6(石油醚∶乙酸乙酯 =5∶1，180 mg，78%)和產(chǎn)物7(石油醚∶乙酸乙酯 =5∶1，200 mg，70%)。

1.4.4 12-O-二十碳五烯酰佛波醇-13-乙酯(8)，12-O-二十碳五烯酰佛波醇-13-丁酯(9)，12-O-二十二碳六烯酰佛波醇-13-乙酯(10)，12-O-二十二碳六烯酰佛波醇佛波醇-13-丁酯(11)

在100 mL圓底燒瓶中投入中間體Z1(216 mg，0.48 mmol)，參照產(chǎn)物1的合成得到12-O-二十碳五烯酰佛波醇-13，20-二乙酯(石油醚∶乙酸乙酯 =4∶1，250 mg，70%)，直接加入10 mL 0.35%高氯酸甲醇溶液水解12 h。參照產(chǎn)物3的后處理方法得到產(chǎn)物8(石油醚∶乙酸乙酯 =3∶2，150 mg，64%)。

參照產(chǎn)物8的合成，得到產(chǎn)物9(石油醚∶乙酸乙酯 =3∶2，95 mg，52%)，產(chǎn)物10(石油醚∶乙酸乙酯 =3∶2，150 mg，79%)和產(chǎn)物11(石油醚∶乙酸乙酯 =3∶2，78 mg，85%)。

1.4.5 佛波醇-12-二十碳五烯酸酯(12)，佛波醇-12-花生酸酯(13)，佛波醇-12-二十二碳六烯酸酯(14)

在100 mL圓底燒瓶中投入12-O-二十碳五烯酰佛波醇-13，20-二乙酯(550 mg，0.67 mmol)，10 mL 0.05 M氫氧化鉀甲醇溶液，室溫反應(yīng)60 min。待反應(yīng)完畢加入適量稀鹽酸中和反應(yīng)，回收溶劑，加入水和二氯甲烷分層。經(jīng)后處理用硅膠柱層析得到產(chǎn)物12(石油醚∶乙酸乙酯 =1∶1，340 mg，76%)。

參照產(chǎn)物12的合成，得到產(chǎn)物13(石油醚∶乙酸乙酯 =1∶1，200 mg，75%)和產(chǎn)物14(石油醚∶乙酸乙酯 =2∶3，203 mg，76%)。

1.4.6 12-O-二十碳五烯酰佛波醇-20-乙酯(15)，12-O-十四烷酰佛波醇-20-乙酯(16)，12-O-花生酰佛波醇-20-乙酯(17)，12-O-二十二碳六烯酰佛波醇-20-乙酯(18)

在100 mL圓底燒瓶中投入化合物12(290 mg，0.45 mmol)，乙酸酐(275 mg，2.7 mmol)和三乙胺(227 mg，2.25 mmol)，用20 mL二氯甲烷溶解，室溫反應(yīng)12 h。待反應(yīng)完畢，經(jīng)后處理用硅膠柱層析得到產(chǎn)物15(石油醚∶乙酸乙酯 =3∶2，150 mg，48.7%)。

參照產(chǎn)物15的合成，得到產(chǎn)物16(石油醚∶乙酸乙酯 =3∶1，156 mg，68%)，產(chǎn)物17(石油醚∶乙酸乙酯 =3∶1，352 mg，84%)和產(chǎn)物18(石油醚∶乙酸乙酯 =3∶1，100 mg，86%)。

1.5 對(duì)正常胚肺成纖維細(xì)胞的毒性測(cè)試

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常胚肺成纖維細(xì)胞 (MRC-5，5 × 104/mL) 接種于96孔板，每孔100 μL細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行藥物處理。藥物最小終濃度1 μmol/L，最大100 μmol/L，按等比設(shè)置5個(gè)濃度。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。給藥48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，并放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h。最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔中的吸光度(450 nm)，并計(jì)算IC50。

2 結(jié)果與討論

2.1 佛波醇水解工藝優(yōu)化結(jié)果

傳統(tǒng)的水解工藝以11.0 g氫氧化鋇溶于400 mL甲醇(2.75 mg/mL)，對(duì)100 mL巴豆油水解24h，此過(guò)程中并未對(duì)堿的濃度和水解時(shí)間進(jìn)行考察。本研究在其他條件不變的情況下，將堿的濃度提高到4.13 mg/mL(1.5倍)、4.95 mg/mL(1.8倍)和5.50 mg/mL(2.0倍)分別對(duì)100 mL巴豆油進(jìn)行水解，每2 h取一次樣對(duì)水解情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，連續(xù)取7次樣，經(jīng)高效液相檢測(cè)佛波醇的含量。水解曲線見(jiàn)圖2。

如圖所示，佛波醇的含量大致是從增加到下降再到平衡的一個(gè)過(guò)程。堿的濃度為4.13 mg/mL時(shí)，佛波醇含量較低；堿的濃度為5.50 mg/mL時(shí)，佛波醇含量在2 h達(dá)到最高，但考慮到堿的濃度過(guò)高會(huì)破壞佛波醇母核，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量粘稠物質(zhì)使攪拌停止，所以堿的濃度不宜過(guò)高。而堿的濃度為4.95 mg/mL時(shí)，佛波醇含量較高，水解時(shí)間較短，所以堿濃度最優(yōu)選擇是4.95 mg/mL。

圖2 佛波醇水解曲線Fig.2 Hydrolysis curve of phorbol

同時(shí)可見(jiàn)，攪拌6 h后佛波醇含量開(kāi)始下降，所以選定6 h為終止時(shí)間。

傳統(tǒng)工藝水解完成后，未經(jīng)調(diào)節(jié)pH直接減壓旋蒸除去甲醇，但佛波醇長(zhǎng)時(shí)間處于堿性條件下會(huì)發(fā)生構(gòu)型變化，由佛波醇轉(zhuǎn)化為異佛波醇[12]，所以水解完畢應(yīng)該立即調(diào)節(jié)pH至弱酸性，這在目前的水解工藝中被忽視。本研究將水解完畢的水解液分為等體積的兩份(各100 mL)，一份調(diào)節(jié)pH至弱酸性，一份未調(diào)節(jié)。經(jīng)減壓旋蒸除去甲醇，然后加入等體積水，分別取樣經(jīng)液相分析。分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 調(diào)節(jié)pH至弱酸性對(duì)佛波醇和異佛波醇含量的影響Table 1 The effect of adjusting pH to weakly acidic on the concentration of phorbol and isophorbol

如表1所示，水解液調(diào)pH至弱酸性時(shí)，佛波醇含量較未調(diào)的高，同時(shí)異佛波醇含量較未調(diào)的低。說(shuō)明提前調(diào)節(jié)pH，可有效防止佛波醇向異佛波醇轉(zhuǎn)化。

此外，不同于硅膠柱分離，本研究對(duì)佛波醇的分離純化采用減壓ODS柱，用15%～20%的甲醇水溶液沖洗10個(gè)柱體積即可富集大部分佛波醇(純度 > 90%)，產(chǎn)率1.2%左右。

今日下午二點(diǎn)出殯，葬送至小石川念速寺。但同寺在朱引內(nèi)(譯者注：日語(yǔ)，讀音：しゅびきうち，即政府規(guī)定的東京市區(qū))，埋葬被禁，故埋葬于近地同宗新福寺。與前年死去的花子和去年死去的岳母同處。法名命為文操。[注]中野實(shí)等翻刻：《加藤弘之日記——明治十一年一月-明治十三年》，《東京大學(xué)史紀(jì)要》第11號(hào)，1993年3月，第141頁(yè)。

水解工藝優(yōu)化的結(jié)果：氫氧化鋇的用量為文獻(xiàn)報(bào)道的1.8倍(4.95 mg/mL)；水解時(shí)間為6 h；水解完畢立即調(diào)pH至弱酸性；分離純化采用減壓ODS柱。整個(gè)制備周期可縮短至3天，能夠?yàn)榉鸩ù嫉慕Y(jié)構(gòu)修飾快速提供原料。

2.2 化合物理化與波譜數(shù)據(jù)

化合物2無(wú)色油狀液體；[α]25 D 24 (c0.2,MeOH);UV (MeOH)λmax (log ε) 234 (3.80) nm；IR (KBr)λmax 3 414,2 961,1 711,1 653,1 628 cm-1;1H NMR (CDCl3,600 MHz)δ:7.58 (1H,s,H-1),5.68 (1H,m,H-7),5.42-5.30 (m,20H CH=CH×10),4.45 (2H,m,H-20),3.97 (1H,d,J=9.8 Hz,H-12),3.20 (1H,s,H-8),3.15 (1H,s,H-10),2.84-2.80 (m,16H,=CHCH2CH=×8),2.57/2.51 (2H,dd,J=19.3 Hz,H-5),2.37-2.31 (3H,t,J=7.6 Hz,4H,COCH2CH2×2),2.14-2.05 (8H,m,CH2CH2CH=×2 and =CHCH2CH3×2),1.99 (1H,m,H-11),1.78 (3H,m,H-19),1.73-1.67 (4H,m,COCH2CH2×2),1.25 (3H,s,H-16),1.22 (3H,s,H-17),1.06 (1H,d,J=6.4 Hz,H-18),1.02 (1H,d,J=5.5 Hz,H-14),0.97 (6H,t,J=7.6 Hz,CH2CH3×2)；13C NMR (CDCl3,151 MHz)δ:208.69,176.68,173.38,160.53,136.21,133.23,132.71,132.20,132.18,129.28,129.04,129.01,128.78,128.74,128.71,128.46,128.43,128.41,128.36,128.31,128.24 (2C),128.18,128.03,127.99,127.16,127.14,78.38,77.51,73.49,69.47,68.01,56.81,45.22,39.51,39.18,35.54,33.84,33.76,26.71 (2C),26.66,25.79 (6C),25.69 (2C),24.91,24.74,23.87,20.71 (2C),17.01,15.22,14.43 (2C),10.28;HR-ESI-MS:m/z955.606 8 [M+Na]+(Calcd 955.606 4)。

2.3 佛波醇衍生物對(duì)正常細(xì)胞的毒性研究

表2 佛波醇衍生物對(duì)正常細(xì)胞毒性結(jié)果Table 2 Results of cytotoxicity of phorbol derivatives (n

如表2所示，13個(gè)化合物毒性較高(IC50< 38.12 μmol/L)，5個(gè)化合物毒性較低(IC50> 100 μmol/L)。佛波醇與長(zhǎng)鏈飽和、不飽和脂肪酸形成三酯、二酯衍生物時(shí)，毒性較低(化合物1，6和7，IC50> 100 μmol/L)；佛波醇的13位羥基成乙酯或丁酯，12位羥基與長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸成酯時(shí)毒性較高(化合物8，9，10和11的IC508.10 → 16.15 μmol/L)；佛波醇13位羥基與長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸成單酯時(shí)毒性較大(化合物3和5的 IC50分別為26.97 μmol/L 和7.40 μmol/L)，與長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸成單酯時(shí)毒性較小(化合物4，IC50> 100 μmol/L)；佛波醇12位羥基形成單酯化衍生物與佛波醇13位羥基形成單酯化衍生物的結(jié)果類(lèi)似(化合物12和14的 IC50分別為5.39 μmol/L和1.52 μmol/L，而化合物13的 IC50> 100 μmol/L)；佛波醇-12，20-二酯化衍生物普遍具有細(xì)胞毒性(化合物15，16，17和18的IC505.01 → 38.12 μmol/L)。

3 結(jié)論

本研究對(duì)佛波醇制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，使制備周期縮短至3天，可快速獲得佛波醇；對(duì)佛波醇進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，合成了18個(gè)新化合物，包括佛波醇單酯、二酯、三酯化衍生物；考察了佛波醇衍生物對(duì)正常細(xì)胞的毒性，結(jié)果表明：長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸(EPA，DHA)的引入使大部分衍生物具有毒性，以佛波醇酯作為抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)時(shí)，應(yīng)該避免引入長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸；佛波醇-12，20-二酯化衍生物同樣具有毒性，在佛波醇結(jié)構(gòu)修飾時(shí)應(yīng)該避免合成這類(lèi)產(chǎn)物；而佛波醇12位羥基、13位羥基分別與長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸形成單酯時(shí)毒性較低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為佛波醇的結(jié)構(gòu)修飾提供參考。