張佳麗，李 玲，雷家珩，羅 珂

武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430070

高濃度的雙黃酮具有一定的細(xì)胞毒性[1]，在銀杏葉(GinkgoBilobaL.)提取物中，雙黃酮一直被作為限量物質(zhì)。但近年來，銀杏雙黃酮一些特殊藥用價(jià)值，如抗流感病毒[2]、抗氧化[3]、治療阿爾茨海默癥[4]以及動(dòng)脈粥硬化[5]等作用被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。

在雙黃酮分析及其高純單組分對(duì)照品研究方面，國內(nèi)起始于2010年，孔繁晟[6]等首先采用硅膠柱色譜和重結(jié)晶方法得到98.5%的單組分金松雙黃酮。2014年李冰等[7]通過硅膠色譜和半制備色譜，分離得到mg級(jí)純度>95%的金松雙黃酮、銀杏黃素、異銀杏黃素、白果素4種單組分雙黃酮，但純度沒有達(dá)到>98%的對(duì)照品要求，特別是沒有得到單組分阿曼托黃素。因此，國內(nèi)雙黃酮的定量分析一直落后于其藥用研究，從而限制了其資源開發(fā)。

本工作以銀杏葉粗提物為原料，反溶劑沉淀分離得到80.40%的多組分雙黃酮粗品，再用半制備色譜分離制備得到>98%的高純金松雙黃酮、阿曼托黃素、白果素、銀杏黃素異構(gòu)體，系統(tǒng)研究了制備條件，并對(duì)銀杏黃素異構(gòu)體進(jìn)行了分離，為單組分銀杏雙黃酮新藥的研究與開發(fā)提供了重要的技術(shù)支持。

1 儀器與材料

半制備液相色譜儀 LC3000 北京創(chuàng)新恒通科技有限公司，Daisogel C18(50 mm×250 mm)色譜柱；高效液相色譜儀AgilentLC-1260，Elite Hypersil ODS2(200 mm×4.0 mm，5 μm)色譜柱；超導(dǎo)傅里葉核磁共振波譜儀 AscendTM 600 MHZ 瑞士Bruker 公司；二維液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀 Agilent 1100LC/MSD Trap；紫外分光光度計(jì)N4上海儀電電子股份有限公司；甲醇、乙腈為色譜純；水為雙蒸水；DPPH、ABTS、K2S2O8均購自阿拉?。黄渌噭┚鶠榉治黾儯辉香y杏葉采自本校南湖校區(qū)。

2 分離方法與結(jié)果

2.1 雙黃酮粗品分離與提取

60%乙醇提取的銀杏葉浸膏，用5倍水溶散后，加入等體積1∶1乙酸乙酯-正丁醇，攪拌提取3次。合并有機(jī)相，旋蒸濃縮，再用水分散，加入石油醚攪拌沉淀得到雙黃酮粗提物。

取5 g雙黃酮粗提物溶于40 mL乙酸乙酯，分3次加入80 mL石油醚，邊加邊攪拌，析出沉淀，離心分取，沉淀再溶于50 mL甲醇，加水再次沉淀。反復(fù)多次，得到含量為80.40%雙黃酮粗品。圖1為三次加水沉淀后的HPLC圖譜。

圖1 三次加水沉淀后雙黃酮粗品HPLC譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of crude biflavonoids after three times of water precipitation注：化合物1～4分別為：阿曼托黃素、 白果素、銀杏黃素異構(gòu)體、金松雙黃酮。Note:Compounds 1-4 :amentoflavone, bilobetin,ginkgetin,isomers,sciadopitysin.

2.2 單組分雙黃酮色譜制備

稱取1.00 g雙黃酮粗品，用80%甲醇約100 mL至固體恰好溶解，離心分離，微孔濾膜過濾后進(jìn)半制備色譜，洗脫分離，流速30 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長330 nm。

收集目標(biāo)液，采用紅外、核磁氫譜、質(zhì)譜和分析型高效液相色譜對(duì)其結(jié)構(gòu)及純度進(jìn)行檢測(cè)。

2.2.1 洗脫梯度考察

考察流動(dòng)相組成和多個(gè)洗脫梯度對(duì)分離效果影響。結(jié)果表明，制備條件為甲醇(A)-有機(jī)酸水溶液(B)，0～2 min，76%A；2～45 min，76%～100%A；45～50 min，100%A，可完全分離阿曼托黃素、白果素、銀杏黃素異構(gòu)體和金松雙黃酮(分別記為目標(biāo)化合物1、2、3、4)，其保留時(shí)間分別為14.1 min、18.5 min、28.2 min和41.1 min。此外，實(shí)驗(yàn)證明，流動(dòng)相中加入0.005 mol/L三氟乙酸以及0.005 mol/L乙酸可規(guī)整峰型。

2.2.2 二次制備

將一次制備所得的阿曼托黃素(化合物1)和白果素(化合物2)用適量甲醇復(fù)溶，調(diào)節(jié)洗脫梯度為：甲醇(A)-有機(jī)酸水溶液(B)，0～2 min，50%～80%A；2～45 min，80%～100%A；45～50 min，100%A。兩次制備所得4種單組分雙黃酮的HPLC譜圖如圖2。

4種單組分雙黃酮阿曼托黃素、白果素、銀杏黃素異構(gòu)體、金松雙黃酮產(chǎn)率(mg/kg)經(jīng)計(jì)算分別為：22.5、23.8、192.5、71.8。

圖2 4種高純單組分雙黃酮的HPLC譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of four high-purity one-component biflavonoids

3 定性及定量分析

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

對(duì)得到的4個(gè)化合物進(jìn)行了熔點(diǎn)、紅外、紫外、質(zhì)譜、1H NMR、13C NMR等檢測(cè)，結(jié)果如下：

化合物1黃色粉末，mp.268～269 ℃，易溶于DMSO、甲醇、乙酸乙酯、丙酮。UV (MeOH) λMax266,337 nm;IR (KBr) νmax3 453 (OH),1 653 (共扼C = O),1 498 (芳C),1 240,827 cm-1;Positive ESI-MS:m/z539.1 [M+H]+(Calcd for C30H18O10);1H NMR (500 MHz,DMSO-d6) δ13.11 (s,1H,OH-5′′),12.98 (s,1H,OH-5),10.86 (s,2H,OH-7,7′′),10.31 (s,2H,OH-4′,4′′′),8.03 (d,J= 2.5 Hz，1H，H-2′),8.0 (dd,J= 8.8,2.5 Hz,1H,H-6′),7.58 (d,J= 8.5 Hz,2H,H-2′′′,6′′′),7.17 (d,J= 8.5 Hz,1H,H-5′),6.85 (s,1H,H-3),6.81 (s,1H,H-3′′),6.73 (d,J= 8.4 Hz,2H,H-3′′′,5′′′),6.48 (d,J= 2.1 Hz,1H,H-8),6.42 (s,1H,H-6′′),6.20 (d,J= 2.1 Hz,1H,H-6);13C NMR (150 MHz,DMSO-d6) δ182.1 (C-4,4′),166.4 (C-7),163.6 (C-2,2′),163.5 (C7′′),161.8 (C-5),160.7 (C-5′′),160.5 (C-2′),158.8 (C-9),157.7 (C-4′′′),156.3 (C-9′′),132.6 (C-4′),129.2 (C-2′′′,6′′′),128.1 (C-6′),123.4 (C-5′),122.9 (C-1′′′),120.8 (C-3′),117.6 (C-1′),115.8 (C-3′′′,5′′′),104.5 (C-3,3′),104.4 (C-10),104.1 (C-8′′),104.0 (C-10′′),98.8 (C-6′′),98.3 (C-6),94.0 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9,10]基本一致，故確定化合物1為阿曼托黃素(amentoflavone)。

化合物2黃色晶體(CH2Cl2-CH3OH)，mp.233～235 ℃，易溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮。UV (MeOH) λMax267,335 nm;IR (KBr) νmax3 498 (OH),1 654 (共扼C = O),1 496 (芳C),1 243,836 cm-1;Negative ESI-MS:m/z551.0 [M-H]-(Calcd for C31H20O10);1H NMR (500 MHz,DMSO-d6) δ13.11 (s,1H,OH-5′′),12.94 (s,1H,OH-5),10.85 (s,1H,OH-7′′),10.83 (s,1H,OH-7),10.29 (s,1H,OH-4′′′),8.20 (dd,J= 8.8,2.5 Hz,1H,H-6′),8.08 (d,J= 2.4 Hz,1H,H-2′),7.52 (d,J= 8.9 Hz,2H,H-2′′′,6′′′),7.36 (d,J= 8.9 Hz,1H,H-5′),6.95 (s,1H,H-3),6.82 (s,1H,H-3′′),6.72 (d,J= 8.9 Hz,2H,H-3′′′,5′′′),6.50 (d,J= 2.1 Hz,1H,H-8),6.41 (s,1H,H-6′′),6.21 (d,J= 2.1 Hz,1H,H-6),3.79 (s,3H,OCH3-4′);13C NMR (150 MHz,DMSO-d6),δ182.1 (C-4,4′′),166.4 (C-7),163.6 (C-2,2′′),163.5 (C-7′′),161.8 (C-5),161.7 (C-2′),160.7 (C-5′′),1588.8 (C-9),157.7 (C-4′′′),156.3 (C-9′′),132.2 (C-4′),129.2 (C-2′′′,6′′′),127.7 (C-6′),123.1 (C-5′),122.9 (C-1′′′),121.9 (C-3′),115.8 (C-3′′′,5′′′),111.0 (C-1′),104.5 (C-3,3′′),104.4 (C-10),104.1 (C-8′′),104.0 (C-10′′),98.8 (C-6′′),98.3 (C-6),94.0 (C-8),56.1 (OCH3-2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9,11]一致，故確定化合物2為白果素(bilobetin)。

化合物3黃色晶體(CH2Cl2-CH3OH)，mp.24～246 ℃，易溶于乙酸乙酯、丙酮。UV (MeOH) λMax266,330 nm;IR (KBr) νmax3 434 (OH),1 658 (共扼C = O),1 500 (芳C),1 249,836 cm-1;Negative ESI-MS:m/z564.9 [M-H]-(Calcd for C32H22O10);由1H NMR譜圖推出化合物3為銀杏黃素(ginkgetin)與異銀杏黃素(isoginkgetin)的混合物，將其進(jìn)一步分離后得到銀杏黃素1H NMR (500 MHz,DMSO-d6) δ13.10 (s,1H,OH-5′′),12.93 (s,1H,OH-5),10.83 (s,1H,OH-7′′),10.29 (s,1H,OH-4′′′),8.24 (d,J= 9.1 Hz,1H,H-1′),8.11 (d,J= 2.4 Hz,1H,H-5′),7.51 (d,J= 8.5 Hz,2H,H-2′′′,6′′′),7.38 (d,J= 8.8 Hz,1H,H-2′),7.03 (s,1H,H-8),6.83 (d,J= 2.8 Hz,2H,H-3,3′′),6.72 (d,J= 8.6 Hz,2H,H-3′′′,5′′′),6.43～6.36 (m,2H,H-6,6′′′),3.84 (s,3H,OCH3-7),3.80 (s,3H,OCH3-4′);13C NMR (150 MHz,DMSO-d6) δ182.1 (C-4,4′′),167.3 (C-7),163.6 (C-2,2′′),163.5 (C-7′′),161.7 (C-2′),161.4 (C-5),160.7 (C-5′′),158.4 (C-9),157.7 (C-4′′′),156.3 (C-9′′),132.2 (C-4′),129.2 (C-2′′′,6′′′),127.7 (C-6′),123.1 (C-5′),122.9 (C-1′′′),121.9 (C-3′),115.8 (C-3′′′,5′′′),111.0 (C-1′),104.5 (C-3,3′′),104.1 (C-10,8′′),104.0 (C-10′′′),98.8 (C-6′′),98.0 (C-6),92.8 (C-8),56.1 (OCH3-2′),55.8 (OCH3-7);異銀杏黃素1H NMR (500 MHz,DMSO-d6) δ13.07 (s,1H,OH-5′′),12.94 (s,1H,OH-5),10.85 (d,J= 8.2 Hz,2H,OH-7,7′′),8.21 (dd,J= 8.8,2.4 Hz,1H,H-1′),8.07 (d,J= 2.3 Hz,1H,H-5′),7.63 (d,J= 8.8 Hz,2H,H-2′′′,5′′′),7.37 (d,J= 8.9 Hz,1H,H-2′),6.94 (dd,J= 9.3,4.9 Hz,4H,H-3,3′′,3′′′,5′′′),6.49 (d,J= 2.2 Hz,1H,H-6′′),6.42 (s,1H,H-8),6.20 (d,J= 2.1 Hz,1H,H-6),3.78 (d,J= 16.3 Hz,6H,OCH3-4′,4′′′);13C NMR (150 MHz,DMSO-d6) δ182.1 (C-4,4′′),166.4 (C-7),163.6 (C-2,2′′),163.5 (C-7′′),161.8 (C-5),161.7 (C-2′),160.7 (C-5′′),159.8 (C-4′′′),158.8 (C-9),156.3 (C-9′′),132.2 (C-4′),128.8 (C-2′′′,6′′′),127.7 (C-6′),123.1 (C-5′),122.6 (C-1′′′),121.9 (C-3′),114.2 (C-3′′′,5′′′),111.0 (C-1′),104.5 (C-3,3′′),104.4 (C-10),104.1 (C-8′′),104.0 (C-10′′′),98.8 (C-6′′),98.3 (C-6),94.0 (C-8),56.1 (OCH3-2′),55.8 (OCH3-4′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9,12]基本一致，故確定化合物3為銀杏黃素異構(gòu)體(ginkgetin isomers)。

化合物4淡黃色晶體(CH2Cl2,CH3OH)，mp.298～300 ℃，易溶于DMF、丙酮。UV (MeOH) λMax268,330 nm;IR (KBr) νmax3 423 (OH),1 652 (共扼C = O),1 504 (芳C),1 245,827 cm-1;Negative ESI-MS:m/z578.8 [M-H]-(Calcd for C33H24O10);1H NMR (500 MHz,DMSO-d6) δ13.07 (s,1H,OH-5′′),12.93 (s,1H,OH-5),10.86 (s,1H,OH-7′′),8.25 (dd,J= 8.8,2.5 Hz,1H,H-6′),8.10 (d,J = 2.4 Hz,1H,H-2′),7.62 (d,J= 9.0 Hz,2H,H-2′′′,6′′′),7.38 (d,J= 8.9 Hz,1H,H-5′),7.03 (s,1H，H-3),6.95 (d,J= 9.0 Hz,2H，H-3′′′,5′′′),6.93 (s,1H,H-3′′),6.82 (d,J= 2.3 Hz,1H,H-8),6.43 (s,1H,H-6′′),6.38 (d,J= 2.3 Hz,1H,H-6),3.91-3.70 (m,9H，OCH3-7,4′,4′′′);13C NMR (150 MHz,DMSO-d6) δ182.1 (C-4,4′′),167.3 (C-7),163.6 (C-2,2′′),163.5 (C-7′′),161.7 (C-2′),161.4 (C-5),160.7 (C-5′′),159.8 (C-4′′′),158.4 (C-9),156.3 (C-9′′),132.2 (C-4′),128.8 (C-2′′′,6′′′),127.7 (C-6′),123.1 (C-5′),122.6 (C-1′′′),121.9 (C-3′),114.2 (C-3′′′,5′′′),111.0 (C-1′),104.5 (C-3,3′′),104.1 (C-10,8′′),104.0 (C-10′′′),98.8 (C-6′′),98.0 (C-6),92.8 (C-8),56.1 (OCH3-2′),55.8 (OCH3-7,4′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9,13]一致，故確定化合物4為金松雙黃酮(sciadopitysin)。

圖3 單組分雙黃酮的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of one-component bioflavonoids注：阿曼托黃素、白果素、銀杏黃素異構(gòu)體、 金松雙黃酮(A)銀杏黃素及異銀杏黃素(B)。Note:Amentoflavone,Bilobetin,Ginkgetin isomers, Sciadopitysin (A) Ginkgetin and Isoginkgetin(B).

表1 兩次色譜制備得到的單組分雙黃酮純度定值Table 1 Purity assessment of one-component biflavonoids after two chromatographic preparation

3.2 HPLC-DAD測(cè)定純度

根據(jù)中國計(jì)量科學(xué)研究院關(guān)于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度測(cè)定的要求[14]，對(duì)雙黃酮制備品以面積歸一法計(jì)算純度，測(cè)定4種雙黃酮色譜純度。

采用硅膠薄層色譜法對(duì)單組分雙黃酮定性分析，觀察發(fā)現(xiàn)4種單組分雙黃酮均為單一黃綠色斑點(diǎn)。以質(zhì)量平衡法測(cè)定單組分雙黃酮純度，結(jié)果如表1所示。

4 抗氧化活性和異構(gòu)體分離

4.1 抗氧化活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[8]測(cè)定桑椹根化學(xué)成分的抗氧化活性方法，分別在517 nm及734 nm處測(cè)定4種雙黃酮樣品清除DPPH、ABTS+自由基的清除率及半數(shù)抑制率IC50值。每份樣品平行操作測(cè)定3次，取平均值，得到4種雙黃酮的抗氧化活性結(jié)果見表2。結(jié)果顯示4種雙黃酮具有明顯的抗氧化活性，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

4.2 銀杏黃素異構(gòu)體進(jìn)一步分離

關(guān)于銀杏黃素異構(gòu)體的進(jìn)一步分離，我們嘗試采用乙腈-水體系的方法[7]，將甲醇-水分離體系得到的銀杏黃素異構(gòu)體(化合物3)用適量丙酮復(fù)溶，以60%乙腈和有機(jī)酸水溶液洗脫分離，所用有機(jī)酸為0.005 mol/L三氟乙酸-0.005 mol/L乙酸混合物，可實(shí)現(xiàn)銀杏黃素和異銀杏黃素的完全分離，其純度定值分別為98.56%、95.70%，所得HPLC譜圖如圖4。

表2 待測(cè)化合物清除DPPH自由基和ABTS+自由基的IC50值Table 2 IC50 values of DPPH and ABTS+radical scavenging of the isolated compounds

圖4 銀杏黃素及異銀杏黃素的HPLC譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of ginkgetin and isoginkgetin

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以60%乙醇提取的銀杏葉浸膏為原料，水-石油醚多次反溶劑沉淀分離得到純度為80.40%的雙黃酮粗品。再以甲醇-水為流動(dòng)相，用制備色譜梯度洗脫分離得到4種符合中藥化學(xué)對(duì)照品要求的單組分雙黃酮，并采用60%乙腈和有機(jī)酸水溶液對(duì)銀杏黃素異構(gòu)體進(jìn)行了完全分離，得到了5種純度均大于95%的雙黃酮，為雙黃酮標(biāo)樣的生產(chǎn)提供思路，通過DPPH和ABTS+體外自由基清除實(shí)驗(yàn)，此次分離得到的五種雙黃酮均具有一定抗氧化活性，也為雙黃酮的開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。