郝經(jīng)文， 陳林霖，司華陽，陳乃富，陳乃東，李 彬，劉孝全

1 皖西學(xué)院，六安 237012；2安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥 230031； 3湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢 430065

蕨菜是采自蕨科蕨屬植物蕨Pteridiumaquilinum(L.)Kuhn var.latusculum(Desv)Underw的幼嫩葉，別名拳頭菜、如意菜、龍爪菜等，因其生長于天然林地，少受污染，是我國優(yōu)質(zhì)的綠色天然食品[1-3]。

近年來，隨著蕨菜野生資源的開發(fā)利用，對(duì)蕨菜中化學(xué)成分的研究主要集中于黃酮、氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等物質(zhì)[4-6]，而對(duì)蕨菜多糖的研究相對(duì)較少?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，多糖作為一類重要的大分子化合物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降血糖及降血脂等藥理作用，且毒性小，從而成為藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)[7-10]。開展蕨菜多糖的研究對(duì)蕨菜資源的深度開發(fā)具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)以大別山區(qū)野生蕨菜為原料，利用超聲輔助提取方法，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲輔助提取蕨菜多糖的工藝參數(shù)，以促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖和抑制結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-8)增殖能力的研究為例，對(duì)獲得的蕨菜多糖免疫增強(qiáng)活性和抗腫瘤活性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，旨在為蕨菜多糖的深入研究和蕨菜資源開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

蕨菜材料采自于安徽省霍山縣，品種經(jīng)皖西學(xué)院陳乃東教授鑒定。幼嫩葉鮮品洗凈，在低溫凍干機(jī)中凍干至恒重，粉碎、過40目篩，密封備用。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：葡萄糖(標(biāo)準(zhǔn)品)、刀豆蛋白A(ConA)、DMEM培養(yǎng)基，購于Sigma-aldrich試劑公司；無水乙醇(分析純)，購于上海振興化工試劑公司；乙醚(分析純)，購于上海中試化工試劑公司；丙酮、氯仿、硫酸(分析純)，購于西隴化工試劑公司；正丁醇(分析純)，購于天津博迪試劑公司；紫杉醇(標(biāo)準(zhǔn)品)、蒽酮、二甲基亞砜，均購于阿拉丁試劑公司； RPMI1640培養(yǎng)基，購于?？寺≡噭┕荆籔BS溶液，購于上海立菲生物技術(shù)有限公司；紅細(xì)胞裂解液，購自于Thermo試劑公司。

主要儀器與設(shè)備： TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；KQ-5200B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HH-S6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；GL-200-Ⅱ 型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；GL-20G-Ⅱ 電子分析天平，上海安亭科學(xué)儀器廠；202A-3型數(shù)顯電熱干燥箱，上海錦屏儀器儀表有限公司；BB15型二氧化碳培養(yǎng)箱，ThermoFisher儀器有限公司； Thermo Scientific Microplate Reader 酶標(biāo)儀，ThermoFisher儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照文獻(xiàn)[11]，用蒽酮-硫酸法，于 621 nm下測(cè)樣品吸光度值,得回歸方程A= 9.561 4C+ 0.021 8,R2= 0.998 ,A為吸光度，C為濃度，計(jì)算出各供試樣品的多糖含量[14-16]。

1.3.2 蕨菜樣品粗多糖的提取及測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.5 g的蕨菜凍干粉，加入一定體積蒸餾水，超聲波輔助提取、 5 000 rpm離心，收集上清液，定容，得蕨菜總多糖提取液，備用。

精密吸取 1.0 mL制備的多糖提取液，同“1.3.1操作”于 621 nm 下測(cè)吸光度值(A)，計(jì)算出各供試樣品的多糖含量[14]。

1.3.3 蕨菜精制多糖的制備

蕨菜精制多糖的制備參照相關(guān)文獻(xiàn)[12]，使用Sevag法除去粗多糖溶液中的蛋白質(zhì)，冷凍干燥，得精制多糖。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)分別考察超聲波輔助下液料比、浸提次數(shù)、超聲浸提時(shí)間、超聲功率4 個(gè)因素對(duì)蕨菜多糖提取得率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面法試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[13-16]，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇以液料比(X1)、浸提次數(shù)(X2)、超聲浸提時(shí)間(X3)、超聲功率(X4)作為相應(yīng)變量，編碼水平為-1，0和1，且以蕨菜多糖提取得率(Y)作為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法對(duì)蕨菜多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.6 蕨菜精制多糖對(duì)小鼠脾細(xì)胞增值的影響

小鼠脾淋巴細(xì)胞的制備參考文獻(xiàn)[17]，小鼠短頸處死后，置于70%乙醇溶液中浸泡3 min，于無菌條件下取出脾臟，置于病理級(jí)載玻片，壓碎，PBS緩沖溶液沖洗，過200目篩網(wǎng)，制得脾細(xì)胞懸浮液。將制得的細(xì)胞懸浮液置于離心管中，1 200 rpm 離心5 min，除去上清，向離心管中加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，吹打均勻，靜置4 min，1 200 rpm離心，除去上清液，加入適量的RPMI1640培養(yǎng)基，吹打均勻，使用臺(tái)盼藍(lán)染色，檢測(cè)細(xì)胞活性在95%以上即可。

用RPMI1640培養(yǎng)基將蕨菜精制多糖配制0、1、5、10、50、100、500、1 000 μg/mL7個(gè)給藥濃度。將小鼠淋巴細(xì)胞懸浮液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，5×105個(gè)/孔，每孔加入10 μL不同濃度藥液，以等體積的RPMI1640培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，以最終濃度為5 μg/mL的ConA給藥為陽性對(duì)照組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，采用CCK-8法檢測(cè)[18]，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，在490 nm下測(cè)定其吸光度值，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(OD)，實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.3.7 蕨菜精制多糖對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-8)增殖的影響

蕨菜精制多糖對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-8)增殖抑制及細(xì)胞培養(yǎng)參考文獻(xiàn)[19]，分別將結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8以1×104的數(shù)目接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，空白組加入等體積的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的蕨菜精制多糖藥液10 μL，以最終濃度為100 nmol/L的紫杉醇為陽性對(duì)照[19]， 在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，采用CCK-8法檢測(cè)，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，在490 nm下測(cè)定其吸光度值，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(OD)，實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 23.0和Design Expert.10.0對(duì)響應(yīng)面法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析，擬合二次多項(xiàng)式方程并繪制響應(yīng)面圖，確定蕨菜多糖的較佳提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 液料比對(duì)多糖提取得率的影響

在超聲功率240 W、浸提次數(shù)3次、超聲浸提時(shí)間30 min的條件下，比較不同液料比對(duì)蕨菜多糖提取得率的影響如圖1所示。

圖1 液料比對(duì)多糖提取得率的影響Fig.1 Effect of liquid /solid ratio on the extraction yield of polysaccharide

由圖1可得，隨著液料比的增大，多糖提取得率逐漸增大，當(dāng)液料比(mL/g)在20～40∶1 時(shí)，多糖提取得率上升較快；當(dāng)液料比大于40∶1 時(shí)，增長緩慢。液料比為60∶1和80∶1時(shí)獲得的蕨菜多糖提取得率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，過多使用提取溶液會(huì)造成后續(xù)處理的難度，且提高成本，當(dāng)液料比為40∶1時(shí)獲得較好的多糖提取得率，因此液料比控制在 40∶1為宜。

2.1.2 浸提次數(shù)對(duì)多糖提取得率的影響

在超聲功率240 W、超聲浸提時(shí)間30 min、液料比30∶1(mL/g)的條件下，比較不同浸提次數(shù)對(duì)蕨菜多糖提取得率的影響如圖2所示。

圖2 浸提次數(shù)對(duì)多糖提取得率的影響Fig.2 Effect of extraction times on the extraction yield of polysaccharide

由圖2可得，浸提次數(shù)在1～3之間時(shí)，蕨菜多糖提取得率隨浸提次數(shù)的增加而上升，浸提次數(shù)超過3次后，多糖提取得率的增加幅度趨于平緩，且浸提3次與浸提4次，浸提5次的蕨菜多糖提取得率差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故浸提次數(shù)選擇3次為宜。

2.1.3 超聲浸提時(shí)間對(duì)多糖提取得率的影響

在超聲功率240 W、浸提次數(shù)3次、液料比30∶1 (mL/g)的條件下，比較不同超聲浸提時(shí)間對(duì)蕨菜多糖提取得率的影響如圖3所示。

圖3 浸提時(shí)間對(duì)多糖提取得率的影響Fig.3 Effect of time on the extraction yield of polysaccharide

由圖3可得，隨著超聲浸提時(shí)間的增加，多糖提取得率顯著提高，但當(dāng)超聲浸提時(shí)間超過40 min后，多糖提取得率增長緩慢，且超聲浸提時(shí)間為40 min和50 min時(shí)提取得率差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮到節(jié)約成本等因素，選40 min作為超聲浸提時(shí)間為宜。

2.1.4 提取功率對(duì)多糖提取得率的影響

在超聲浸提時(shí)間30 min、浸提次數(shù)3次、液料比30∶1(mL/g)的條件下，考察比較不同超聲功率對(duì)蕨菜多糖提取得率的影響如圖4所示。

圖4 提取功率對(duì)多糖提取得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of polysaccharide

由圖4可得，超聲功率在180～240 W時(shí)，多糖提取得率逐漸增大，當(dāng)超聲功率大于240 W時(shí)，多糖提取得率下降，說明超聲功率對(duì)多糖提取得率的影響，既有正效應(yīng)又有負(fù)效應(yīng)，實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)避免超聲功率過大而引起得率下降，故選取超聲功率240 W為宜。

2.2 四因素響應(yīng)面試驗(yàn)分析結(jié)果

2.2.1 工藝參數(shù)優(yōu)化

結(jié)合“2.1單因素試驗(yàn)”結(jié)果，以液料比(X1)：30∶1(mL/g)、浸提次數(shù)(X2)：3次、超聲浸提時(shí)間(X3)：40 min(X3)、超聲功率(X4)：240 W為中心點(diǎn)，用響應(yīng)面分析方法進(jìn)行四因素優(yōu)化。中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Design and results of central composite experiment

續(xù)表1(Continued Tab.1)

試驗(yàn)序號(hào)No.液料比(X1)Liquid /solid ratio(mL/g)浸提次數(shù)(X2)Extraction times(n)超聲浸提時(shí)間(X3)Extraction time(min)超聲功率(X4)Ultrasonic power(W)多糖提取得率(Y)Yield of polysaccharide(%)實(shí)測(cè)值Test value預(yù)測(cè)值Predictive value23010-15.7005.5252401-106.9706.905251-1005.2605.2502601106.6107.1952700-1-15.4255.4252811008.4858.4502900008.2008.260

表2 回歸模型的方差分析 Table 2 Variance analysis of regression model

續(xù)表2(Continued Tab.2)

方差來源Source平方和SSSquare sum of deviations自由度DFdf均方MSMean quareF值F valueP值P value顯著性Significant失擬 Lack of fit2.472 10 0.247 23.361 0.004 ??誤差Error0.042 4 0.011 總變異 Cor total60.848 28 模型的決定系數(shù)Model determination coefficientR2=0.958 7模型的調(diào)整決定系數(shù)Adjust of model determination coefficientR2adj=0.917 4

注：*在a=0.05水平上顯著，**表示在a=0.01水平上極顯著。

Note:*Indicates significant at a=0.05 level,**Indicates extremely significant at a=0.01 level.

2.2.2 多糖提取條件的響應(yīng)面優(yōu)化分析

為了更直觀地表現(xiàn)二個(gè)因素對(duì)多糖提取得率的影響，繪制四因素交互作用的響應(yīng)面圖(圖5)，由圖5可知，響應(yīng)面開口向下，隨著每兩個(gè)因素的值增加，響應(yīng)值增大，當(dāng)響應(yīng)值增到極值后，又隨著每兩個(gè)因素的增加而逐漸減小。該模型有穩(wěn)定點(diǎn)，且等高線圖中的曲線都隨著響應(yīng)面的增加而形成一個(gè)頂點(diǎn)，即較佳的蕨菜多糖提取得率。

圖5 四因素交互作用對(duì)多糖提取得率的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots showing the cross interaction among four factors on extraction rate of polysaccharide

經(jīng)Design Expert 10.0 軟件分析該模型得到的多糖優(yōu)化提取條件為液料比：36.2∶1 mL/g、 超聲浸提時(shí)間 ：43.1 min、浸提次數(shù)：4.28次、超聲功率：239.17 W。 在此條件下，蕨菜多糖理論提取得率達(dá) 8.72%。 根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整后的優(yōu)化提取條件為：液料比：36.2∶1 mL/g、 超聲浸提時(shí)間：43.1 min、浸提次數(shù)：4次、提取功率：240 W。在此條件下，重復(fù) 3 次試驗(yàn)得多糖提取得率如表3所示，其提取得率為 8.60%，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值接近，因此該工藝參數(shù)可用來指導(dǎo)蕨菜多糖提取。

表3 預(yù)測(cè)值與優(yōu)化工藝試驗(yàn)值的比較Table 3 Comparison of simulation and optimized experimental results

2.3 蕨菜多糖藥理活性研究

2.3.1 蕨菜多糖對(duì)脾細(xì)胞增值的影響

蕨菜多糖對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖的影響如由圖6所示，空白對(duì)照組與陽性對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.05)，說明ConA誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞增殖，提示造模成功，藥物組與空白對(duì)照組相比，(1～50 μg/mL)各組吸光度均有顯著差異(P<0.05)，提示該濃度范圍內(nèi)蕨菜多糖對(duì)誘導(dǎo)脾細(xì)胞增殖具有明顯的促進(jìn)作用，且當(dāng)蕨菜多糖的濃度達(dá)到1 000 μg/mL時(shí)，吸光度與空白對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.05)，其對(duì)脾細(xì)胞增殖具有抑制作用，因此表明蕨菜精制多糖在一定濃度范圍內(nèi)具有免疫增強(qiáng)活性。

圖6 蕨菜多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.6 Effects of polysaccharide from P.aquilinum on proliferation of mice spleen lymphocyte

2.3.2 蕨菜多糖對(duì)腸癌細(xì)胞(HCT-8)的抑制效果

蕨菜多糖對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8的抑制情況，使用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制情況，由圖7可得，細(xì)胞增殖抑制率與劑量(5～50 μg/mL)蕨菜多糖下呈依賴性抑制。且在該濃度范圍內(nèi)反應(yīng)時(shí)間相同時(shí)，蕨菜多糖的濃度越大，細(xì)胞增殖抑制率越高，與對(duì)照組比較具有顯著性差異(P<0.01)；當(dāng)蕨菜多糖劑量增加到500 μg/mL時(shí)，細(xì)胞生長抑制率超過常用抗癌藥物(100 nmol/L)紫杉醇對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8的抑制率，結(jié)果為蕨菜多糖開發(fā)成抗癌藥物提供一定參考。

圖7 蕨菜多糖對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制的影響Fig.7 Effects of polysaccharide from P.aquilinum on inhibits the proliferation of HCT-8 cells

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化蕨菜多糖提取工藝，得到優(yōu)化工藝條件為：液料比：36.2∶1 mL/g、超聲浸提時(shí)間：43.1 min、浸提次數(shù)：4次、超聲功率：240 W。在此條件下，蕨菜多糖中多糖的提取得率達(dá)8.60%，且各因素對(duì)多糖提取得率的影響依次為：浸提次數(shù)>液料比>超聲浸提時(shí)間>超聲功率，此提取工藝條件合理可行。

通過比較不同濃度的蕨菜精制多糖對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖能力和抑制結(jié)腸癌細(xì)胞(HTC-8)增殖能力的影響，結(jié)果表明：在一定濃度范圍內(nèi)蕨菜精制多糖能提高小鼠脾細(xì)胞增殖率和抑制結(jié)腸癌細(xì)胞(HTC-8)的增殖，提示蕨菜多糖在深度開發(fā)成提高免疫力和天然抗癌藥物等領(lǐng)域具有較好的潛力。