蔣婷婷，白金玉，任青蔓，李金原，彭曉莉，韓 彬

成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，成都 610000

乳腺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，位于女性腫瘤發(fā)病率第一位，嚴(yán)重威脅女性的身心健康[1]。目前認(rèn)為蔬菜水果中所含的植物化合物，尤其是多酚類植物化合物可能是其預(yù)防控制腦血管疾病(cerebrovascular disease，CVD)發(fā)生發(fā)展的主要活性成分。花青素，屬黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、防治腫瘤和心血管疾病等多種生物學(xué)活性[2,3]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黑米花青素能夠抑制裸鼠乳腺癌異種移植瘤生長(zhǎng)[4]，飛燕草素是花青素中常見的一種單體，在花青素中豐度較高，生物學(xué)活性也較強(qiáng)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，飛燕草素能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[6,7]，但機(jī)制仍不清楚。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是在生物體進(jìn)化過程中高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用，該信號(hào)通路的異常與細(xì)胞惡性生長(zhǎng)和癌變密切相關(guān)[8]。抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性，可以阻止上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移[9]。本研究通過飛燕草素干預(yù)乳腺癌移植瘤和乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，探討飛燕草素是否通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，發(fā)揮抗乳腺癌的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑

飛燕草素(純度98%)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；飛燕草素(純度25%)購(gòu)自大興安嶺林格貝寒帶生物科技股份有限公司；人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫；細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自德國(guó)Gibco公司；抗體購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.2 主要儀器

主要使用儀器包括美國(guó)Thermo公司的臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)和ND-2000微量紫外可見光分光光度計(jì)；日本Olympus公司的IX71型倒置熒光相差顯微鏡；美國(guó)Bio-Rad公司的ChemiDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像儀。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

MDA-MB-231細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，常規(guī)方法進(jìn)行傳代，選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.4 飛燕草素干預(yù)乳腺癌裸鼠移植瘤

12只6周齡雌性 BALB/c nude 裸鼠購(gòu)于四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所(SYXK(川)2018-058)。重量15～20 g，飼養(yǎng)于相對(duì)濕度40%～60%，溫度23～25 ℃的SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。裸鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，隨機(jī)分為對(duì)照組(灌胃滅菌水)和飛燕草素干預(yù)組，每組6只。裸鼠右側(cè)腋窩處注射細(xì)胞濃度4×106/0.2 mL的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤的最大直徑和最小直徑，按V=0.52×D2×L公式計(jì)算腫瘤體積。飛燕草素干預(yù)組從接種日開始，用飛燕草素(100 mg/kg/天)灌胃，持續(xù)28天。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死動(dòng)物，取下腫瘤，切下約1 cm×1 cm組織塊，多聚甲醛浸泡約1周后，進(jìn)行包埋和切片。

1.5 免疫組化染色

對(duì)組織切片進(jìn)行免疫組化染色，辣根過氧化物酶顯色試劑盒進(jìn)行顯色處理，用PBS緩沖液作為陰性對(duì)照，免疫組化染色后以細(xì)胞核呈中等強(qiáng)度棕黃色判定為陽性細(xì)胞，在低倍鏡下(×10)瀏覽整張切片選擇熱點(diǎn)區(qū)域，用高倍(×40)對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果表示為陽性細(xì)胞在整張切片中同類型細(xì)胞中的百分比。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 飛燕草素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞Wnt/β-catenin通路的影響

通過Western blot檢測(cè)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路β-catenin和GSK-3β蛋白表達(dá)水平。由圖2可見，飛燕草素作用MDA-MB-231細(xì)胞，能明顯降低細(xì)胞β-catenin和p-GSK-3β的蛋白表達(dá)水平。

圖1 飛燕草素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of delphinidin

圖2 飛燕草素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞 Wnt/β-catenin通路的影響Fig.2 The effect of delphinidin on Wnt/β-catenin signaling pathway in breast cancer cells MDA-MB-231

2.2 飛燕草素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游靶基因c-myc、cyclin D1和MMP-7蛋白表達(dá)的影響

通過Western blot檢測(cè)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游靶基因c-myc、cyclin D1和MMP-7蛋白表達(dá)的影響。由圖3可見，飛燕草素作用MDA-MB-231細(xì)胞，能明顯降低細(xì)c-myc、cyclin D1和MMP-7蛋白表達(dá)水平。

圖3 飛燕草素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞 Wnt/β-catenin信號(hào)通路 c-myc、cyclin D1和MMP-7蛋白表達(dá)的影響Fig.3 The effect of delphinidin on c-myc,cyclin D1and MMP-7 in breast cancer cells MDA-MB-231

2.3 飛燕草素對(duì)裸鼠異種移植瘤體積的影響

飛燕草素干預(yù)裸鼠后，與對(duì)照組(灌胃滅菌水)相比，飛燕草素能夠降低裸鼠異種移植瘤體積，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。

圖4 飛燕草素對(duì)裸鼠異種移植瘤體積的影響Fig.4 Effect of delphinidin on growth xenograft tumor of node mice注：與對(duì)照組比較，#P < 0.05。Note:Compare with control,#P < 0.05.

2.4 飛燕草素對(duì)裸鼠異種移植瘤Wnt/β-catenin通路的影響

Western blot檢測(cè)裸鼠MDA-MB-231細(xì)胞異種移植瘤組織Wnt/β-catenin信號(hào)通路β-聯(lián)蛋白(β-catenin)和GSK-3β蛋白表達(dá)水平。由圖5可見，與對(duì)照組(灌胃滅菌水))相比，飛燕草素能降低裸鼠腫瘤組織中β-catenin和p-GSK-3β的蛋白表達(dá)水平。

2.5 飛燕草素對(duì)裸鼠移植瘤和肺轉(zhuǎn)移瘤Ki-67及乳腺腫瘤MMP-7表達(dá)的影響

免疫組化檢測(cè)腫瘤組織MMP-7的表達(dá)水平，由圖6可見，飛燕草素干預(yù)組腫瘤組織MMP-7表達(dá)明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。

圖5 飛燕草素對(duì)裸鼠移植瘤Wnt/β-catenin通路的影響Fig.5 Effect of delphinidin on Wnt/β-catenin signaling pathway in xenografted tumor

Ki-67蛋白是檢測(cè)細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)，與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有關(guān)[10]。我們檢測(cè)了Ki-67在腫瘤組織中的表達(dá)，結(jié)果表明對(duì)照組和飛燕草素干預(yù)組的腫瘤組織中Ki-67有陽性表達(dá)(圖6)，陽性細(xì)胞數(shù)百分比分別為82%和57.8%，飛燕草素干預(yù)組腫瘤組織Ki-67表達(dá)明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)；Ki-67在祼鼠對(duì)照組和飛燕草素干預(yù)組的肺組織轉(zhuǎn)移瘤中有陽性表達(dá)(圖6)，陽性細(xì)胞數(shù)百分比分別為64.4%和36%，飛燕草素干預(yù)組肺組織轉(zhuǎn)移瘤Ki-67表達(dá)明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。

3 討論

Ki-67是增殖細(xì)胞表達(dá)的核抗原，在乳腺癌、肺癌等腫瘤組織中高表達(dá)，是反映腫瘤細(xì)胞增殖活性的可靠指標(biāo)[11]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)飛燕草素能顯著抑制裸鼠乳腺癌腫瘤組織和肺組織轉(zhuǎn)移瘤Ki-67表達(dá)，表明飛燕草素具有抑制腫瘤組織細(xì)胞增殖的作用。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖及分化過程中起到重要作用。該信號(hào)通路中任何一個(gè)信號(hào)分子異常都會(huì)導(dǎo)致β-catenin在胞質(zhì)和胞核內(nèi)聚集，促使通路下游的靶基因轉(zhuǎn)錄活性增高，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖[12]。β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，其異常表達(dá)是乳腺癌發(fā)生過程中的早期分子事件，與乳腺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)[13]。GSK-3是在進(jìn)化中非常保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，其普遍存在于真核細(xì)胞，GSK-3磷酸化后，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖以及凋亡等。 GSK-3β磷酸化后，可避免β-catenin被GSK-3β磷酸化，使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中逐漸堆積，活化Wnt/β-catenin信號(hào)通路。GSK-3β在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖以及凋亡中發(fā)揮重要作用[14]。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化后促進(jìn)β-catenin入核激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞周期、分化、生長(zhǎng)和遷移[15]。Wnt/β-catenin下游靶基因眾多，如細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinD1、原癌基因 c-myc和MMP-7。研究發(fā)現(xiàn)cyclinD1、c-myc和MMP-7在乳腺癌中過表達(dá)[16]。Cyclin D1高表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。c-myc可促進(jìn)細(xì)胞過度增殖，抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[18]。降低MMP-7的表達(dá)水平可減慢腫瘤生長(zhǎng)，降低腫瘤細(xì)胞侵襲能力[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)飛燕草素能明顯降低乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞β-catenin和p-GSK-3β的蛋白表達(dá)水平，能顯著降低Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游靶基因c-myc、cyclin D1和MMP-7蛋白的表達(dá)。飛燕草素還能降低乳腺腫瘤組織中MMP-7的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示飛燕草素具有抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的作用。

圖6 飛燕草素對(duì)裸鼠移植瘤和肺轉(zhuǎn)移瘤Ki-67及乳腺腫瘤MMP-7表達(dá)的影響(×400)Fig.6 Effect of delphinidin on Ki-67 or MMP-7 expression in xenografted tumor and pulmonary metastatictumor (×400)注：與對(duì)照組比較，##P < 0.01。Note:Compare with control,##P < 0.01.

綜上所述，本研究結(jié)果表明飛燕草素通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路，發(fā)揮抑制乳腺癌的作用，其機(jī)制值得進(jìn)一步研究。