馮傳波 邵 華 王鐘林 朱雙九 鄭新聞

(連云港市第二人民醫(yī)院甲乳外科，連云港 222006)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的腫瘤之一，是導(dǎo)致女性癌癥死亡的首要原因[1]。據(jù)報(bào)道，全球每年乳腺癌的新發(fā)病例約有1 400 000人，約有450 000人死于乳腺癌[2]。乳腺癌好發(fā)于發(fā)達(dá)國(guó)家，但由于醫(yī)療資源的限制，約有60%的乳腺癌死亡發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家[3]。近年來(lái)，靶向治療等新型治療方法的發(fā)展使乳腺癌的致死率有所降低，但仍不足以治愈乳腺癌[4]。大多數(shù)乳腺癌患者在確診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)癌癥的系統(tǒng)轉(zhuǎn)移，大大增加了乳腺癌患者的死亡率[5]。因此，尋找抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法可能有利于降低乳腺癌的致死率?，F(xiàn)代研究表明，天然藥物在抑制癌癥復(fù)發(fā)和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，與現(xiàn)代化療藥物比較還具有低毒副作用的特點(diǎn)[6]，因此成為近年來(lái)抗癌藥物研究的熱點(diǎn)?；⒄仁俏覈?guó)傳統(tǒng)中藥，其主要有效成分虎杖甙(Polydatin)對(duì)休克、缺血損傷、充血性休克及子宮內(nèi)膜異位等疾病具有明顯的療效，同時(shí)還能減緩一些癌癥的發(fā)展[7]。Chen等[8]研究表明，虎杖甙也能誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞凋亡，但關(guān)于虎杖甙對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲及遷移的作用還未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用不同濃度虎杖甙處理乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，以探究虎杖甙對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1材料 虎杖甙購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、特級(jí)胎牛血清和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，CCK8試劑盒和BCA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，Matrigel膠及Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，Ki67、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，HRP偶聯(lián)的山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗購(gòu)自北京中杉生物公司，HE染色劑購(gòu)自北京博奧森公司，ECL試劑盒購(gòu)自廣州吉賽生物有限公司。

1.2方法

1.2.1試劑配置 精密稱取適量虎杖甙用微量的二甲基亞砜溶解，溶解后加入無(wú)血清培養(yǎng)液配置為100 μmol/L的虎杖甙儲(chǔ)存液，經(jīng)過(guò)濾除菌后，密封保存于-20℃冰箱，臨用前用完全培養(yǎng)液稀釋到實(shí)驗(yàn)所需濃度后備用。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組 乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，隔天換液，2～3 d傳代一次。

將MDA-MB-231細(xì)胞分為MDA-MB-231組、Polydatin(0.2 μmol/L)組、Polydatin(0.5 μmol/L)組和Polydatin(1 μmol/L)組，并分別用0、0.2、0.5和1 μmol/L的虎杖甙處理MDA-MB-231細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行對(duì)應(yīng)后續(xù)檢測(cè)。

1.2.3CCK8檢測(cè)細(xì)胞活性 將MDA-MB-231細(xì)胞接種于96孔板中，種板密度為5×104個(gè)/ml。用0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20和50 μmol/L的虎杖甙處理細(xì)胞，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔。24 h后根據(jù)CCK8試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞活性。

將細(xì)胞接種于96孔板中，分為MDA-MB-231組、Polydatin(0.2 μmol/L)組、Polydatin(0.5 μmol/L)組和Polydatin(1 μmol/L)組，并用不同濃度的虎杖甙分別處理0、1、2、3和4 d，根據(jù)CCK8試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組細(xì)胞活性。

1.2.4Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 將Matrigel提前放于4℃冰箱中，待Matrigel溶化后取出，迅速加入到Transwell小室內(nèi)，以蓋住小室底部為宜，并保證無(wú)氣泡產(chǎn)生。將加有Matrigel的Transwell小室放入培養(yǎng)箱中，待Matrigel凝固后取出備用。將MDA-MB-231細(xì)胞以1×105個(gè)/ml的密度接種于Transwell小室內(nèi)，上層分別加入含有不同濃度虎杖甙的無(wú)血清培養(yǎng)液，下層則加入正常培養(yǎng)液。24 h后用無(wú)菌棉簽擦去上層未遷移蛋白，用HE將下層遷移細(xì)胞染色并計(jì)數(shù)。

1.2.5劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 用無(wú)菌maker筆于6孔板背面劃平行直線，使每個(gè)培養(yǎng)孔背面至少有5條平行直線。將MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml。待細(xì)胞貼壁后，用10 μl的槍頭垂直于培養(yǎng)板背面直線劃痕，用磷酸鹽緩沖液洗去被劃下的細(xì)胞，將細(xì)胞分為MDA-MB-231組、Polydatin(0.2 μmol/L)組、Polydatin(0.5 μmol/L)組和Polydatin(1 μmol/L)組，并按照1.2.2所描述的方法處理24 h并記錄 0 h 和24 h時(shí)各組細(xì)胞的劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞劃痕閉合率。

1.2.6免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 將細(xì)胞按照1.2.2描述方法處理24 h后，用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞蛋白，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度并調(diào)平蛋白質(zhì)濃度。每組分別取30 μg蛋白用10%的SDS-PAGE分離蛋白并用半干法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%的脫脂奶粉溶液室溫封閉膜2 h，隨后加入適宜濃度一抗，4℃孵育過(guò)夜。第二天用緩沖液洗去多余一抗，加入二抗室溫孵育1 h后，滴加化學(xué)發(fā)光顯色液于暗室曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1虎杖甙對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響 如圖1 所示，當(dāng)虎杖甙濃度為2 μmol/L時(shí)，MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞活性明顯降至80%以下，并隨虎杖甙濃度升高，細(xì)胞活性逐漸降低。因此，選擇0.2、0.5和1 μmol/L三個(gè)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性的濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用虎杖甙處理MDA-MB-231不同時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，虎杖甙處理細(xì)胞4 d后，MDA-MB-231細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著降低，與MDA-MB-231組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,圖2)。此外，與MDA-MB-231組比較，Polydatin(0.2 μmol/L)組、Polydatin(0.5 μmol/L)組和Polydatin(1 μmol/L)組細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki67的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01,圖3)，并體現(xiàn)出量效關(guān)系，表明虎杖甙能抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖。

2.2虎杖甙對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響 與MDA-MB-231組比較，Polydatin(0.2 μmol/L)組、Polydatin(0.5 μmol/L)組和Polydatin(1 μmol/L)組侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.01,圖4)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明虎杖甙能抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲。

圖1 不同濃度虎杖甙對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effect of different concentration of polydatin on cell viability of MDA-MB-231 cells

圖2 虎杖甙對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖倍數(shù)的影響Fig.2 Effect of polydatin on cell growth folds of MDA-MB-231 cellsNote：n=6,**.P<0.01 vs MDA-MB-231 group.

圖3 虎杖甙對(duì)Ki67、VEGF和MMP-9蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of polydatin on expression of Ki67,VEGF and MMP-9Note：n=6,**.P<0.01 vs MDA-MB-231 group.

2.3虎杖甙對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與MDA-MB-231組比較，Polydatin(0.2 μmol/L)組、Polydatin(0.5 μmol/L)組和Polydatin(1 μmol/L)組細(xì)胞劃痕閉合率顯著降低(P<0.01,圖5)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并具有量效關(guān)系。同時(shí),Polydatin(0.2 μmol/L)組、Polydatin(0.5 μmol/L) 組和Polydatin(1 μmol/L)組細(xì)胞侵襲和遷移相關(guān)蛋白VEGF和MMP-9的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01,圖3)，與MDA-MB-231組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明虎杖甙能抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲和遷移。

圖4 虎杖甙對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.4 Effect of polydatin on invasion ability of MDA-MB-231 cellsNote：n=6,**.P<0.01 vs MDA-MB-231 group.

圖5 虎杖甙對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響Fig.5 Effect of polydatin on migration ability of MDA-MB-231 cellsNote：n=6,**.P<0.01 vs MDA-MB-231 group.

3 討論

虎杖是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，在我國(guó)已有上千年的用藥歷史，并已被列入我國(guó)藥典[9]?；⒄冗?，又稱為白藜蘆醇苷，是虎杖的主要有效成分，虎杖甙常被用于慢性支氣管炎、肝炎、休克的治療，具有明顯的心血管系統(tǒng)保護(hù)作用[10]。研究表明，虎杖甙可由白藜蘆醇衍生而來(lái)，因此與白藜蘆醇有著多種相似的藥理學(xué)活性，并且虎杖甙更易被機(jī)體吸收、具有更強(qiáng)的抗氧化活性[10]。白藜蘆醇對(duì)多種癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移具有明顯的抑制作用[11]。近年來(lái)也有研究發(fā)現(xiàn)，虎杖甙也能誘導(dǎo)宮頸癌、結(jié)腸癌及卵巢癌等多種癌細(xì)胞凋亡[12-14]。同時(shí)，虎杖甙還能誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡[11]。但虎杖甙是否能影響MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲和遷移能力還未見(jiàn)報(bào)道。Jiao等[15]研究發(fā)現(xiàn)，虎杖甙還能抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖、侵襲及遷移，還能通過(guò)抑制磷酸戊糖途徑抑制小鼠頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移，提示其也能影響癌細(xì)胞侵襲和遷移的能力[16]。為了探究虎杖甙對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的作用，本研究首先采用多濃度的虎杖甙處理MDA-MB-231細(xì)胞并發(fā)現(xiàn)虎杖甙濃度達(dá)到2 μmol/L時(shí)能使MDA-MB-231細(xì)胞活性降至80%以下，表明虎杖甙濃度達(dá)到2 μmol/L 時(shí)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性，并且隨虎杖甙濃度的升高，細(xì)胞毒性逐漸增強(qiáng)。因此，本研究選擇0.2、0.5和1 μmol/L三個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用虎杖甙處理MDA-MB-231細(xì)胞4 d后，MDA-MB-231細(xì)胞的增殖速度顯著降低，并且具有劑量依賴性。同時(shí)，虎杖甙還能顯著抑制細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki67蛋白表達(dá)，提示虎杖甙能抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖，與之前的研究報(bào)道一致[11]。

癌癥轉(zhuǎn)移涉及多個(gè)病理學(xué)過(guò)程，包括腫瘤細(xì)胞的分離、轉(zhuǎn)移、黏附和侵襲進(jìn)入血液或淋巴管[17]。其中，癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥轉(zhuǎn)移的主要原因[18]。本研究采用Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)虎杖甙對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響發(fā)現(xiàn)，虎杖甙能顯著減少侵襲的乳腺癌細(xì)胞數(shù)量并降低MDA-MB-231細(xì)胞的劃痕閉合率，同時(shí)體現(xiàn)量效關(guān)系，表明虎杖甙可降低MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲和遷移能力。癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是由多個(gè)細(xì)胞因子共同調(diào)控的過(guò)程， MMP家族在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到靶向組織的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，其中以MMP-9最為重要[19]。MMP-9能夠降解Ⅳ膠原酶，在乳腺癌中呈高表達(dá)狀態(tài)，并與乳腺癌患者的預(yù)后有關(guān)[5]。抑制MMP-9的表達(dá)能抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，有利于乳腺癌的治療[20]。本文研究結(jié)果表明，虎杖甙能顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞中MMP-9的表達(dá)，并具有量效關(guān)系，同時(shí)還能顯著抑制VEGF的表達(dá)。研究表明，VEGF在癌癥轉(zhuǎn)移的過(guò)程中也具有重要作用，能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解、增大血管通透性促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和遷移[21]。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，虎杖甙能抑制MDA-MB-231細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，虎杖甙能降低MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)倍數(shù)和增殖相關(guān)蛋白Ki67的表達(dá)，同時(shí)還能減少M(fèi)DA-MB-231細(xì)胞的侵襲，降低細(xì)胞劃痕閉合率，此外還能降低侵襲和遷移相關(guān)蛋白MMP-9和VEGF的表達(dá)，表明虎杖甙能抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。本研究首次探究了虎杖甙對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，但關(guān)于具體作用機(jī)制的探究還比較欠缺，因此實(shí)驗(yàn)室后期將進(jìn)一步探究虎杖甙抑制MDA-MB-231細(xì)胞侵襲和遷移的作用機(jī)制。