陳紅躍 楊萌萌 張小路 段 錚

(河南省中醫(yī)院普外科，鄭州 450000)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是世界第三大致死癌癥，具有極高的發(fā)病率和致死率，據(jù)報(bào)道每年大約有600 000人死于CRC[1,2]。雖然隨著診療技術(shù)以及醫(yī)療水平的提高，CRC的發(fā)病率和死亡率有所改善，但是目前主要采用的治療手段仍為手術(shù)結(jié)合輔助治療，在診療過后仍有過半的CRC患者發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者5年生存率不足10%[3,4]。因此，尋找一種新型、有效的診療手段對(duì)于減輕CRC患者痛苦和提高其生存率具有重大意義。

miRNA長度約為19～25 nt，能夠與下游多個(gè)靶基因mRNA的3′UTR特異性結(jié)合，通過抑制靶基因翻譯或者促進(jìn)其發(fā)生降解從而發(fā)揮特定的生物學(xué)功能[5]。一般情況下，miRNA在生物體內(nèi)的種類以及表達(dá)水平趨于穩(wěn)態(tài)，正常參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等代謝活性[6]。miRNA表達(dá)水平的失調(diào)通常在腫瘤發(fā)生以及癌變進(jìn)程中發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用[7]。研究表明，在CRC組織中有多種miRNA表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下調(diào)，包括miR-466、miR-126、miR-144等[8-10]。其中，miR-144被證實(shí)是一種紅系特異性miRNA，與紅系細(xì)胞存活和成熟息息相關(guān)，并且其表達(dá)下調(diào)能夠激活mTOR通路并導(dǎo)致CRC患者的不良預(yù)后反應(yīng)[11-13]。 然而，關(guān)于miR-144在CRC中的調(diào)控機(jī)制卻鮮有報(bào)道。

磷脂酰肌醇-3激酶催化亞基δ(Phosphoinosit-ide-3 kinase catalytic subunit δ，PIK3CD)是重要的細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子[14，15]，并且在細(xì)胞免疫和體液免疫中發(fā)揮重要作用[16，17]。本研究發(fā)現(xiàn)PIK3CD可能是miR-144的潛在靶標(biāo)，并通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)兩者之間的靶向關(guān)系以及其在CRC中的具體作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 選取2016年3月至2017年2月于本院進(jìn)行治療的CRC患者56例為研究對(duì)象，所有患者均經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為CRC，男30例，女26例，年齡45～72歲，平均(53.67±5.59)歲，所有患者術(shù)前均未接受放療或化療及激素類藥物治療。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬知情且簽署同意書。所有患者均行手術(shù)治療，于術(shù)中切除CRC癌組織及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，迅速放入液氮中，術(shù)后將其轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存。

1.1.2實(shí)驗(yàn)材料 本研究所選用的HCT116細(xì)胞購于北京北納生物(貨號(hào)BNCC337692)，NCM460細(xì)胞購于上海紀(jì)寧生物(貨號(hào)JN-3150)，胎牛血清、DMEM/F-12培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶購于Gibco(貨號(hào)10099158、11320-033、25200056)，MTT、BCA試劑盒購于碧云天生物(貨號(hào)C0009、P0010)，PIK3CD小鼠單抗購于美國Santa Cruz(貨號(hào)sc-136032)，β-action小鼠單抗購于美國Cell Signaling Technology(貨號(hào)#3700)，HRP羊抗鼠二抗購于Abcam公司(貨號(hào)ab205719)，PureLinkTMRNA Mini Kit RNA提取試劑盒、SuperScriptTMⅣ逆轉(zhuǎn)錄酶購于Invitrogen(貨號(hào)12183018A、18091050)，Lipofectamine 3000購于Thermo(貨號(hào)L3000001)，TB GreenTM購于TaKaRa(貨號(hào)RR820A)，雙熒光素酶試劑盒購于北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司(貨號(hào)RG008)，Human TNF-α、sIL-2R ELISA試劑盒(貨號(hào)70-EK11392、85-BMS212-2)，PIK3CD siRNA、miR-144模擬物和抑制劑由上海吉瑪公司合成，引物由Invitrogen合成，TNF-α酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(貨號(hào)ml064303)，人可溶性白介素2受體(sIL-2R) ELISA試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司(貨號(hào)JLC5531)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自上海愛必信生物科技有限公司(貨號(hào)abs920)。

1.2方法

1.2.1結(jié)直腸癌細(xì)胞的培養(yǎng) NCM460、HCT116細(xì)胞使用含有100 mg/L的鏈霉素、100 U的青霉素和10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基復(fù)蘇以及培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為90%相對(duì)濕度、5%CO2的37℃培養(yǎng)箱，2～3 d 換液1次。

1.2.2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 待細(xì)胞融合度為70%左右時(shí)，采用高效率的Lipofectamine 3000方法，對(duì)HCT116細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。其中，設(shè)置PIK3CD siRNA組、對(duì)照siRNA組以及加入等體積轉(zhuǎn)染液的空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染結(jié)束后正常培養(yǎng)；以miR-144模擬物、miR-144抑制劑、對(duì)照miRNA分別轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，空白對(duì)照組加入等體積轉(zhuǎn)染液，轉(zhuǎn)染結(jié)束后正常培養(yǎng)。

1.2.3MTT實(shí)驗(yàn) 分別取處于對(duì)數(shù)生長期的各組HCT116細(xì)胞，置于96孔板中，細(xì)胞密度為5×104個(gè)/孔，加入20 μl的0.5%MTT溶液于37℃條件下孵育4 h，離心棄上清，加入150 μl DMSO溶解結(jié)晶后，使用酶標(biāo)儀讀取OD490處的數(shù)值并繪制HCT116細(xì)胞的增殖曲線。

1.2.4RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 使用PureLinkTMRNA Mini Kit提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，并使用SuperScriptTMⅣ合成cDNA，具體操作參照說明書。反應(yīng)體系體積為20 μl，包含10 μl TB GreenTM、0.4 μl 上游引物、0.4 μl下游引物、1 ng模板，ddH2O補(bǔ)足至20 μl。反應(yīng)程序采用兩步法，具體為98℃ 15 s、60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。其中，PIK3CD上游引物為5′-TGCCAAACCACCTCCCATTCC-3′，下游引物為5′-CATCTCGTTGCCGTGGAAAAGC-3′；β-actin上游引物為5′-CAATGTGGCCGAGGACTTTG-3′，下游引物為5′-CATTCTCCTTAGAGAGAAGTGG-3′。以β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算PIK3CD mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5Western blot實(shí)驗(yàn) 使用RIPA細(xì)胞裂解液處理HCT116細(xì)胞，離心收集可溶性蛋白并使用BCA法測定蛋白含量，具體操作參考說明書。取70 μg 蛋白在95℃條件下加熱10 min后，利用濃度為12%的SDS-PAGE膠分離蛋白。使用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白從膠上轉(zhuǎn)移至大小適宜的PVDF膜上，使用5%的脫脂奶粉于4℃條件下低溫封閉過夜。第2天，使用PIK3CD一抗溶液(稀釋比例為1∶1 000)室溫孵育3 h，TBST洗膜3次，每次10 min，之后加入HRP標(biāo)記的二抗溶液(稀釋比例為1∶500)反應(yīng)1 h，TBST洗膜4次，每次10 min。于黑暗條件下進(jìn)行顯色反應(yīng)，并對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，實(shí)驗(yàn)以β-actin為內(nèi)參。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)含有miR-144結(jié)合位點(diǎn)的PIK3CD WT-3′-UTR和MUT-3′-UTR片段，將其插入到檢測質(zhì)粒的報(bào)告基因下游，獲得含有PIK3CD WT-3′-UTR以及MUT-3′-UTR片段的重組質(zhì)粒。使用Lipofectamine 3000將miR-144模擬物與PIK3CD WT-3′-UTR和MUT-3′-UTR的報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48 h后使用試劑盒檢測熒光活性。

1.2.7ELISA實(shí)驗(yàn) 收集各組HCT116細(xì)胞的上清培養(yǎng)液，使用PBS稀釋至適宜濃度后，添加至96孔板內(nèi)，40℃孵育至液體全部揮發(fā)，再次使用PBS洗滌3～5次，之后添加2%的牛血清蛋白室溫反應(yīng)1 h，結(jié)束后使用PBS洗滌3次。使用0.05%的TBST溶液對(duì)TNF-α、sIL-2R 抗體進(jìn)行稀釋，并添加至96孔板內(nèi)，37℃反應(yīng)1 h。結(jié)束后，使用PBS洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的二抗溶液反應(yīng)3 h。之后，再次使用PBS洗滌3次，加入反應(yīng)底物，酶標(biāo)儀讀取450 nm吸光值。

2 結(jié)果

2.1miR-144和PIK3CD在CRC和正常結(jié)腸組織及細(xì)胞中表達(dá)情況 本研究檢測了CRC組織以及正常結(jié)腸組織中miR-144和PIK3CD表達(dá)水平，結(jié)果顯示CRC組織中的miR-144表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，PIK3CD的mRNA以及蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖1A～C。為進(jìn)一步探究miR-144和PIK3CD在結(jié)直腸癌細(xì)胞以及正常結(jié)腸細(xì)胞中的表達(dá)變化，RT-qPCR和Western blot技術(shù)檢測了NCM460和HCT116細(xì)胞中兩者的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與正常結(jié)腸細(xì)胞NCM460相比，HCT116細(xì)胞中的miR-144表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，PIK3CD顯著上調(diào)(P<0.05)，與CRC組織結(jié)果一致，見圖1D～F。

2.2miR-144對(duì)HCT116細(xì)胞增殖以及TNF-α和sIL-2R的表達(dá)具有抑制作用 RT-qPCR結(jié)果顯示，miR-144模擬物能夠顯著提升HCT116細(xì)胞中miR-144的表達(dá)水平(P<0.05)，見圖2A。使用MTT法檢測miR-144對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-144模擬物組細(xì)胞生長受到抑制，顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，見圖2B。ELISA結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-144能夠顯著抑制TNF-α和sIL-2R的蛋白表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2C。以上結(jié)果提示miR-144模擬物對(duì)HCT116細(xì)胞的生長增殖具有抑制作用，并且抑制TNF-α和sIL-2R蛋白的表達(dá)。

2.3敲低PIK3CD抑制細(xì)胞增殖以及TNF-α和sIL-2R的表達(dá) 為了探究PIK3CD與細(xì)胞增殖以及TNF-α和sIL-2R表達(dá)的關(guān)系，轉(zhuǎn)染PIK3CD siRNA至HCT116細(xì)胞中，MTT法檢測細(xì)胞增殖能力，ELISA檢測TNF-α和sIL-2R的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，si-PIK3CD組的PIK3CD mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，見圖3A、B。MTT結(jié)果顯示，PIK3CD siRNA對(duì)HCT116細(xì)胞生長具有明顯的抑制作用(P<0.05)，見圖3C。ELISA結(jié)果表明，PIK3CD siRNA可抑制TNF-α和sIL-2R的表達(dá)(P<0.05)，見圖3D。

圖3 PIK3CD siRNA對(duì)HCT116細(xì)胞增殖及TNF-α、sIL-2R表達(dá)的影響Fig.3 Effects of PIK3CD siRNA on HCT116 cell proliferation and TNF-α，sIL-2R expressionNote: A and B.Expression of PIK3CD in HCT116 cells was detected by RT-qPCR and Western blot;C.Proliferation of HCT116 cell was detected by MTT;*.P<0.05;D.Expression of TNF-α and sIL-2 was detected by ELISA；compared with the si-Control group，*.P<0.05，#.P<0.01.

圖4 miR-144對(duì)PIK3CD的靶向調(diào)控作用Fig.4 Regulation of miR-144 targeting on PIK3CDNote: A.Target prediction of miR-144 and PIK3CD;B.Identification of target regulation by double Luciferase assay;C and D.Expression of PIK3CD mRNA and protein were detected by RT-qPCR and Western blot;compared with the miR-control,*.P<0.05；Compared with the anti-miR-control，#.P<0.05.

2.4miR-144靶向負(fù)調(diào)控PIK3CD 通過在線軟件miRcode分析發(fā)現(xiàn)，miR-144能夠與PIK3CD的3′UTR區(qū)特異性結(jié)合(圖4A)，為驗(yàn)證兩者之間的靶向關(guān)系，本研究構(gòu)建了含有PIK3CD 3′UTR片段的熒光素酶野生型和突變型報(bào)告質(zhì)粒(PIK3CD-3′UTR-WT和PIK3CD-3′UTR-MUT)，并與miR-144模擬物共轉(zhuǎn)染至HCT116細(xì)胞以驗(yàn)證其作用關(guān)系。結(jié)果顯示，與PIK3CD-3′UTR-MUT相比，PIK3CD-3′UTR-WT與miR-144共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著下降(P<0.05)，表明miR-144與PIK3CD基因存在靶向調(diào)控關(guān)系，見圖4B。將miR-144模擬物與抑制劑轉(zhuǎn)入HCT116細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，miR-144模擬物使PIK3CD mRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)，而miR-144抑制物對(duì)PIK3CD的mRNA以及蛋白表達(dá)具有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)，以上說明miR-144對(duì)PIK3CD具有負(fù)調(diào)控作用，見圖4C、D。

圖5 miR-144靶向PIK3CD調(diào)控TNF-α、sIL-2R的表達(dá)和細(xì)胞增殖Fig.5 miR-144 regulates TNF-α,sIL-2R expression and cell proliferation by targeting PIK3CDNote: A.Proliferation of HCT116 cells was detected by MTT;B.Expression of TNF-α and sIL-2 was detected by ELISA;compared with the control,*.P<0.05.

2.5miR-144通過靶向PIK3CD調(diào)控細(xì)胞增殖和免疫功能 為探究miR-144和PIK3CD參與調(diào)控細(xì)胞增殖的具體機(jī)制，本研究將miR-144抑制劑與PIK3CD siRNA共轉(zhuǎn)染至HCT116細(xì)胞，檢測細(xì)胞的生長情況以及對(duì)TNF-α和sIL-2R表達(dá)水平的影響。MTT結(jié)果顯示，miR-144抑制劑能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，而miR-144抑制劑與PIK3CD siRNA共轉(zhuǎn)染則會(huì)抑制HCT116細(xì)胞增殖(P<0.05)，見圖5A。ELISA結(jié)果顯示，miR-144抑制劑能夠促進(jìn)TNF-α和sIL-2R的表達(dá)，而miR-144抑制劑與PIK3CD siRNA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，TNF-α和sIL-2R表達(dá)水平與對(duì)照組相比增加，與miR-144抑制劑組相比表達(dá)水平下降(P<0.05)，見圖5B。以上結(jié)果提示，miR-144通過靶向負(fù)調(diào)控PIK3CD，進(jìn)而參與調(diào)控HCT116細(xì)胞的增殖和免疫功能。

3 討論

miRNA表達(dá)水平的異常與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[7]，因此闡明miR-144在CRC發(fā)展過程中的分子作用機(jī)制可以增加對(duì)CRC的認(rèn)識(shí)，并為新的診療手段提供見解和依據(jù),具有重要意義。miR-144的基因序列位于11號(hào)染色體，在多種癌癥中均出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)[10]。除此之外，Wang等[18]通過對(duì)28篇已發(fā)表的包括1 843例癌癥樣本以及1 097例正常樣本的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在16種不同的癌癥中有29種miRNA均出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)，其中包括miR-144。研究表明，miR-144可通過靶向多種基因?qū)Π┘?xì)胞的生物學(xué)功能產(chǎn)生影響，其中Han等[19]指出miR-144可靶向RUNX1抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖遷移，Ren等[20]和Ying等[21]提出miR-144作用于Pim-1原癌基因(PIM1)和環(huán)氧合酶-2基因可分別對(duì)胃癌以及食管鱗癌細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-144在CRC組織以及HCT116細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)，與上述結(jié)果一致。miRcode軟件分析結(jié)果顯示，細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)因子PIK3CD的3′UTR含有與miR-144互補(bǔ)的種子序列，是miR-144的潛在靶標(biāo)。當(dāng)過表達(dá)miR-144時(shí)，HCT116細(xì)胞中PIK3CD的mRNA和蛋白表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著下調(diào)，并且雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這種靶向關(guān)系。

PIK3CD是一個(gè)大小約為110 kD的催化亞基，與85 kD的調(diào)節(jié)亞基共同組成具有脂質(zhì)激酶和蛋白激酶活性的PI3K分子，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞免疫功能中發(fā)揮重要作用[14]。Fransson等[22]發(fā)現(xiàn)PIK3CD在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中表達(dá)量增高；Christiane等[23]和Shi等[24]發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中PIK3CD表達(dá)水平出現(xiàn)顯著上調(diào)；并且Sawyer等[25]指出PIK3CD對(duì)乳腺癌細(xì)胞表皮生長因子具有一定趨化性。本研究率先發(fā)現(xiàn)了miR-144與PIK3CD之間的靶向調(diào)控關(guān)系，并且也證實(shí)了PIK3CD在CRC中高表達(dá)的現(xiàn)象，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[26]。當(dāng)降低PIK3CD基因表達(dá)水平后，HCT116細(xì)胞的增殖能力減弱，TNF-α和sIL-2R的表達(dá)水平均出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象，與過表達(dá)miR-144結(jié)果一致。而TNF-α和sIL-2R表達(dá)水平的高低通常代表細(xì)胞免疫功能的強(qiáng)弱[27]，以上結(jié)果提示PIK3CD基因可能直接參與了HCT116細(xì)胞的生長調(diào)節(jié)以及免疫調(diào)控。當(dāng)敲低miR-144的表達(dá)水平時(shí)，PIK3CD的mRNA和蛋白表達(dá)水平均出現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象，并且促進(jìn)HCT116細(xì)胞的增殖和TNF-α和sIL-2R的表達(dá)，結(jié)果表明miR-144通過靶向PIK3CD參與調(diào)控HCT116細(xì)胞的增殖以及免疫功能。

本研究主要探討了miR-144在CRC患者中的表達(dá)水平以及miR-144與PIK3CD之間的作用關(guān)系和具體的分子機(jī)制，并且證實(shí)了miR-144通過靶向PIK3CD抑制HCT116細(xì)胞的免疫功能及其增殖能力，為CRC的治療手段提供了新的靶點(diǎn)以及理論依據(jù)。然而，PIK3CD作為PI3K分子的主要亞基組成部分，在PI3K信號(hào)通路中具有重要作用，關(guān)于miR-144對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能產(chǎn)生的影響及其與PIK3CD以及信號(hào)通路之間的調(diào)控模式仍不是很清晰。除此之外，同一種miRNA通常同時(shí)參與多個(gè)下游靶基因的表達(dá)調(diào)控，細(xì)胞內(nèi)部調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中miRNA對(duì)全局調(diào)控分配機(jī)制研究較少，在疾病、腫瘤等發(fā)生進(jìn)程中不同靶基因調(diào)控模式的變化水平以及具體的分配機(jī)制仍需大量的科學(xué)研究。