楊 剛 張永紅 鄭茂華

(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科，蘭州 730000)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，可分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)，級(jí)別越高，預(yù)后越差[1]。蟲(chóng)草素(Cordycepin，Cor)是腺苷類(lèi)似物，屬核苷類(lèi)新藥。近些年來(lái)，蟲(chóng)草素的藥用價(jià)值逐漸被人們所發(fā)現(xiàn)，已成為當(dāng)前科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[2]。蟲(chóng)草素具有抗腫瘤、抗菌消炎和清除自由基等多種藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)，蟲(chóng)草素不僅可抑制腎癌和肺癌等多種腫瘤細(xì)胞RNA和DNA合成，還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抑制腫瘤的作用，但尚未明確抗腫瘤的具體機(jī)制[3，4]。因此，本研究使用蟲(chóng)草素作用神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞，探討其對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲的作用。

1 材料與方法

1.1材料 神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所，由本實(shí)驗(yàn)室凍存；蟲(chóng)草素購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；CCK8試劑盒購(gòu)自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司；Corning Transwell小室購(gòu)自上海子起生物科技有限公司；Trizol試劑購(gòu)自上海名勁生物科技有限公司；EZBioscience逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海海方生物技術(shù)有限公司；SYBR Green熒光定量染料法試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；鼠抗人Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin和β-actin單克隆抗體均購(gòu)自Abcam公司；引物合成上海英濰捷基有限公司；美國(guó)ABI梯度PCR儀購(gòu)自上海奧陸生物科技有限公司；Berthold LB943多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自上海伯托同位素技術(shù)服務(wù)中心；Bio-Rad CFX96 Real-time PCR儀購(gòu)自上海易匯生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 使用Gibco高糖DMEM(10%胎牛血清)培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞消化后制備細(xì)胞懸液，接種至6孔或96孔Corning細(xì)胞培養(yǎng)板，藥物處理組加入不同濃度(100、200和400 μg/ml)蟲(chóng)草素，并設(shè)立對(duì)照組(不加蟲(chóng)草素，即藥物濃度為0 μg/ml)，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)時(shí)間設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.2細(xì)胞存活率測(cè)定 使用CCK8法測(cè)定細(xì)胞存活率。接種6×103個(gè)細(xì)胞到96孔Corning細(xì)胞培養(yǎng)板中，配制使用不同濃度蟲(chóng)草素(100、200和400 μg/ml)，并設(shè)立對(duì)照組(不加蟲(chóng)草素)，在培養(yǎng)箱中孵育1、2和3 d，加入100 μl配制好的CCK8(20 μl CCK8液+180 μl高糖DMEM培養(yǎng)基)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定OD450值。按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率=(對(duì)照組OD450-處理組OD450)/對(duì)照組OD450×100%。

1.2.3蟲(chóng)草素對(duì)細(xì)胞侵襲的影響 將Transwell小室放入細(xì)胞培養(yǎng)板中，上室加入300 μl高糖DMEM培養(yǎng)基，靜置30 min，水化基質(zhì)膠后，棄去培養(yǎng)基。接種100 μl，濃度為 3×105個(gè)/ml U87細(xì)胞液接種到上室中，下室中加入600 μl 20%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，將其放置于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出Transwell培養(yǎng)板，棄掉上層液體，小心擦拭小室后倒扣于超凈臺(tái)中，室溫放置5 min。棄去培養(yǎng)板孔內(nèi)液體，使用磷酸緩沖液洗滌2遍后，用濕棉簽擦凈上室面的Matrigel基質(zhì)膠和細(xì)胞。使用甲醛固定30 min，最后使用1%結(jié)晶紫染色18 min，磷酸緩沖液洗滌3遍。將培養(yǎng)板置于光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)選取4個(gè)視野進(jìn)行拍照并計(jì)數(shù)。

1.2.4蟲(chóng)草素對(duì)Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin蛋白水平的影響 使用Western blot法測(cè)定Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin 蛋白水平。胰酶將細(xì)胞消化下來(lái)，PBS洗滌1遍后，離心取細(xì)胞沉淀，使用蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白。測(cè)定蛋白濃度并將蛋白濃度調(diào)整為1 mg/ml，進(jìn)行蛋白電泳。電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，封閉后孵育Cyclin D1或其他單克隆抗體，4℃過(guò)夜。使用配制的含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌3遍后孵育辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗人IgG，室溫孵育2 h后，PBST洗滌3遍，進(jìn)行ECL顯色，曝光。使用Image J軟件分析，以β-actin蛋白水平作為參照，計(jì)算Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5蟲(chóng)草素對(duì)Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin mRNA水平的影響 使用q-PCR法測(cè)定Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin mRNA水平。Trizol試劑提取細(xì)胞RNA，使用Nanodrop測(cè)定細(xì)胞RNA濃度并調(diào)整為1 μg/ml，依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將總RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA。依據(jù)SYBR Green 熒光定量染料法試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。Cyclin D1 F:5′-GTGCATCTACACCGACAACT-CCA-3′；R:5′-TGAGCTTGTTCACCAGGAGCA-3′；Bcl-2 F:5′-TTCTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3′；R:5′-TGCATATTTGTTTGGGGCAGG-3′；MMP-2 F:5′-TC-TAACGGTCGGGAAACA-3′；R:CCAACAGTGGACA-TAGCC；MMP-9 F:GAGATGCGTGGAGAGTCGA；R:CGAGTTGGAACCACGACGC；Ezrin F:5′-CCCTCCAGTTCAAGTTCC-3′，R:5′-AAGCCAAAGGTCTGT-TCC-3′；β-actin F:5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，R:5′-GCTGTCACCTTCACCGGTCC-3′。反應(yīng)程序:95℃ 5 min；94℃ 50 s，59℃ 50 s，72℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。用ΔΔCt法，以β-actin mRNA水平作為參照，計(jì)算Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1蟲(chóng)草素對(duì)U87細(xì)胞增殖的影響 100 μg/ml蟲(chóng)草素作用不同時(shí)間后對(duì)U87細(xì)胞增殖均無(wú)明顯影響(P>0.05)。200、400 μg/ml蟲(chóng)草素作用后可明顯抑制U87細(xì)胞的增殖，且隨著藥物濃度和作用時(shí)間上升，細(xì)胞存活率降低(P<0.05)，呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴(lài)性，見(jiàn)圖1。

圖1 蟲(chóng)草素對(duì)U87細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of cordycepin on proliferation of U87 cellsNote: *.P<0.05 compared with 0 μg/ml drug;#.P<0.05 compared with 24 h.

圖2 蟲(chóng)草素對(duì)U87細(xì)胞侵襲的影響Fig.2 Effect of cordycepin on invasion of U87 cellsNote: *.P<0.05 compared with 0 μg/ml drug.

2.2蟲(chóng)草素對(duì)U87細(xì)胞侵襲的影響 100 μg/ml蟲(chóng)草素對(duì)U87細(xì)胞侵襲無(wú)明顯影響，發(fā)現(xiàn)200、400 μg/ml 蟲(chóng)草素可明顯抑制U87細(xì)胞侵襲(P<0.05)，且呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)圖2。

2.3蟲(chóng)草素對(duì)Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin蛋白水平的影響 結(jié)果顯示，U87細(xì)胞經(jīng)不同濃度蟲(chóng)草素(0、100、200、400 μg/m)處理24 h后，發(fā)現(xiàn)200和400 μg/ml處理后Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin蛋白水平明顯降低(P<0.05)，100 μg/ml處理后對(duì)Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin蛋白的抑制作用不明顯(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

2.4蟲(chóng)草素對(duì)Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin mRNA水平的影響 結(jié)果顯示，U87細(xì)胞經(jīng)不同濃度蟲(chóng)草素(0、100、200、400 μg/ml)處理24 h后，在200和400 μg/ml濃度時(shí)Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin mRNA水平明顯降低(P<0.05)，100 μg/ml處理后對(duì)Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin mRNA的抑制作用不明顯(P>0.05),見(jiàn)圖4。

圖3 蟲(chóng)草素對(duì)Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin蛋白水平的影響Fig.3 Effect of cordycepin on Cyclin D1，Bcl-2，MMP-2，MMP-9 and Ezrin protein levelsNote: *.P<0.05 compared with 0 μg/ml drug.

圖4 蟲(chóng)草素對(duì)Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin mRNA水平的影響Fig.4 Effect of cordycepin on Cyclin D1，Bcl-2，MMP-2，MMP-9 and Ezrin mRNA levelsNote: *.P<0.05 compared with 0 μg/ml drug.

3 討論

蟲(chóng)草素是第一個(gè)從真菌中分離出來(lái)的脫氧核苷類(lèi)抗生素，在抗腫瘤方面具有較高的地位[5]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，以蟲(chóng)草素為主要活性成分的新藥已試用于白血病的臨床治療[6]。近些年來(lái)，對(duì)蟲(chóng)草素的藥理作用及生物活性研究較深入，已明確發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抑制微生物生長(zhǎng)、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等功能。蟲(chóng)草素可明顯抑制舌癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，并且發(fā)現(xiàn)其機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)[7，8]。本研究擬觀察蟲(chóng)草素對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖和侵襲的作用并檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討蟲(chóng)草素對(duì)U87細(xì)胞的可能機(jī)制。

研究發(fā)現(xiàn)，蟲(chóng)草素可有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，可延緩腫瘤進(jìn)展[9，10]。蟲(chóng)草素與腺苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)似，可替代腺苷參與細(xì)胞代謝過(guò)程，抑制mRNA加尾，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖。另外，蟲(chóng)草素可促進(jìn)細(xì)胞分化和T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提高單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力，直接殺傷腫瘤細(xì)胞。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，100 μg/ml蟲(chóng)草素作用不同時(shí)間后對(duì)U87細(xì)胞增殖均無(wú)明顯影響(P>0.05)；200和400 μg/ml 濃度范圍內(nèi)作用后可明顯抑制U87細(xì)胞的增殖，且隨著藥物濃度和作用時(shí)間上升，細(xì)胞存活率降低(P<0.05)，呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴(lài)性，表明蟲(chóng)草素抑制U87的增殖，這與蟲(chóng)草素抗乳腺癌、肺癌和白血病等研究結(jié)果一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，100 μg/ml 蟲(chóng)草素對(duì)U87細(xì)胞侵襲無(wú)明顯影響，200和400 μg/ml蟲(chóng)草素均可明顯抑制U87細(xì)胞侵襲(P<0.05)，且呈劑量依賴(lài)性。結(jié)果表明，蟲(chóng)草素干預(yù)后，腫瘤細(xì)胞侵襲能力降低，進(jìn)而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制可能是調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)。最近研究證明Ezrin、Bcl蛋白在乳腺癌等實(shí)體瘤進(jìn)展中的增殖與轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11，12]。Ezrin蛋白為膜-細(xì)胞骨架連接蛋白，其編碼基因?yàn)槲⒔q毛蛋白2，具有改變細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的作用。Ezrin蛋白也與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，Lou等[13]發(fā)現(xiàn)沉默Ezrin基因表達(dá)可顯著抑制U87細(xì)胞浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，上調(diào)Ezrin表達(dá)可明顯促進(jìn)U87細(xì)胞遷移，下調(diào)其表達(dá)可抑制遷移。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2、MMP-9蛋白在乳腺癌、肝癌腫瘤細(xì)胞表達(dá)異常，其可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等[14-16]。劉正端等發(fā)現(xiàn)通幽湯通過(guò)下調(diào) MMP-2、MMP-9等蛋白的表達(dá)，可抑制食管癌細(xì)胞的侵襲[15]。Cyclin D1在細(xì)胞周期的正常更替過(guò)程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用，而細(xì)胞周期與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有密切聯(lián)系。目前研究發(fā)現(xiàn)Cyclin D1在多種惡性腫瘤中異常高表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[17]。Bcl-2是細(xì)胞抑制凋亡因子，與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，其可通過(guò)抑制鈣離子跨膜流動(dòng)和抗氧化等發(fā)揮抗凋亡作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，蟲(chóng)草素可抑制舌癌細(xì)胞的增殖，其可能的原因是抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，U87細(xì)胞經(jīng)不同濃度蟲(chóng)草素(100、200、400 μg/ml)處理24 h后，在200和400 μg/ml濃度時(shí)Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin蛋白和mRNA水平明顯降低，100 μg/ml處理后對(duì)Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin蛋白和mRNA水平的抑制作用不明顯，組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與曾志青等[19]研究是一致的。推測(cè)其原因可能是:①蟲(chóng)草素能抑制EGF信號(hào)通路活化,下調(diào) Ezrin的表達(dá),同時(shí)抑制 MMP-2、MMP-9 的表達(dá),進(jìn)而抑制其向周?chē)M織浸潤(rùn)和侵襲;②蟲(chóng)草素可延長(zhǎng)G1/S期轉(zhuǎn)換時(shí)間,降低細(xì)胞周期更替的速率,抑制細(xì)胞增殖;③抑制線粒體凋亡途徑,下調(diào)Bcl-2表達(dá),改變線粒體通透性,釋放細(xì)胞色素C。

綜上所述，蟲(chóng)草素能抑制U87細(xì)胞的增殖和侵襲，其機(jī)制可能與下調(diào)Ezrin、Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。因此，深入開(kāi)展蟲(chóng)草素抗腫瘤作用的研究，可為治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤帶來(lái)新的理論依據(jù)。