孫 林 洪明陽(yáng) 曹雅明 朱曉彤 崔立旺

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110122)

瘧疾是經(jīng)蚊媒傳播的寄生原蟲(chóng)感染性疾病。迄今為止，全球仍有1.2億瘧疾患者，3億無(wú)癥狀攜帶者，每年仍有近百萬(wàn)非洲兒童死于瘧疾感染[1]。因此，亟待研發(fā)安全有效的疫苗以在全球范圍內(nèi)防治瘧疾。瘧疾疫苗主要包括紅前期、紅內(nèi)期和傳播阻斷疫苗(Transmission blocking vaccines,TBVs)。其中，TBVs由于其候選抗原表達(dá)于蚊階段原蟲(chóng)，不受人體免疫系統(tǒng)選擇壓力影響，故具有低多態(tài)性和良好的免疫原性[2]，被廣泛認(rèn)為是一種在瘧疾流行地區(qū)降低瘧疾傳播的有效策略?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多個(gè)瘧疾TBVs候選抗原，如配子體和配子表面蛋白P48/45與P230，合子和動(dòng)合子期表面蛋白P25和P28，蚊階段原蟲(chóng)表面蛋白HAP2(Hapless 2 protein)[3-5]。盡管上述TBVs候選抗原具有一定的傳播阻斷效應(yīng)，但仍不能完全阻斷瘧原蟲(chóng)傳播。因此，篩選并研發(fā)新的TBVs候選抗原將為阻斷瘧疾在流行區(qū)的傳播提供必要的理論依據(jù)。

瘧原蟲(chóng)復(fù)雜的生活史包括人體內(nèi)的無(wú)性裂體增殖和按蚊體內(nèi)的有性生殖兩個(gè)階段。其中，有性發(fā)育階段始于雌性按蚊吸食瘧原蟲(chóng)感染患者血液。雄/雌配子體隨同血液進(jìn)入蚊胃。在蚊胃內(nèi)環(huán)境刺激下，雄配子體經(jīng)歷3次有絲分裂，并通過(guò)“出絲”破裂宿主紅細(xì)胞而發(fā)育為8個(gè)雄配子。雄/雌配子結(jié)合成合子，進(jìn)而發(fā)育成動(dòng)合子。動(dòng)合子穿越蚊胃壁發(fā)育成卵囊，隨后發(fā)育為子孢子。子孢子進(jìn)入蚊唾液腺，隨按蚊再度叮咬感染新的宿主[6]。多種蛋白磷酸酶(Protein phosphatases,PPs)和蛋白激酶(Protein kinases，PKs)參與瘧原蟲(chóng)有性階段發(fā)育中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控[7]。因此，PPs和PKs為小分子藥物的有效作用靶位，同時(shí)也是瘧疾TBVs潛在的候選抗原[8]。

蛋白絲/蘇氨酸磷酸酶(Serine/threonine protein phosphatase)參與細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)錄、翻譯、凋亡和RNA剪接等細(xì)胞發(fā)育過(guò)程。蛋白磷酸酶6(PPP6)屬于PP2A家族，在調(diào)控細(xì)胞功能過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9,10]。與 Mg2+依賴(lài)性磷酸酶家族的其他成員一樣，PPP6能夠?qū)o(wú)機(jī)底物以及多肽去磷酸化。此外，PPP6蛋白磷酸酶活性可被岡田酸抑制[11-13]。氨基酸序列預(yù)測(cè)分析顯示，伯氏瘧原蟲(chóng)PPP6的催化結(jié)構(gòu)域與磷酸化絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶(Phosphoserine and phosphothreonine residues phosphatases,PPPs)其他成員高度同源且保守[14]。鑒于PPPs在瘧原蟲(chóng)生活周期中具有不可替代的作用，其可作為瘧疾防治的潛在靶位。本項(xiàng)目采用生物信息學(xué)方法選取伯氏瘧原蟲(chóng)PPP6(PbANKA_041210)蛋白，擴(kuò)增其編碼基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，表達(dá)并純化PPP6重組蛋白。免疫小鼠后，通過(guò)ELISA和Western blot方法評(píng)估PPP6蛋白的免疫原性和免疫反應(yīng)性，并通過(guò)體內(nèi)外傳播阻斷實(shí)驗(yàn)評(píng)估抗PPP6免疫血清的傳播阻斷效果，以期為研制新型高效瘧原蟲(chóng)TBVs提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 6～8周齡雌性BALB/c小鼠購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所；Pb.ANKA 2.34原蟲(chóng)及基因組DNA(gDNA)由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室保存。KOD-Plus-Neo(Toyobo)；Rosetta(DE)competent cell、限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和NotⅠ、T4 DNA連接酶、TaKaRa Agarose Gel DNA Extraction Kit v4.0(TaKaRa)；快速質(zhì)粒小提試劑盒(天根)；LB Broth(Solarbio)；氨芐青霉素(Genview)；IPTG、Tween-20(北京鼎國(guó))；HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads、SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate、Goat anti-Mouse IgG(H+L)Secondary Antibody,HRP、6×His Tag Monoclonal Antibody、ECL試劑盒 (Thermo Fisher Scientific)；anti-tubulin Ⅱ antibody(Abcam)；1640培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(Hyclone)；脫脂奶粉(BD DifcoTMSkim Milk)；弗氏佐劑(Sigma-Aldrich)；Pbs21抗體由教研室自己制備。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1PPP6(PlasmoDB ID:PbANKA_041210)基因合成及原核表達(dá)載體構(gòu)建 以Pb.ANKA原蟲(chóng)gDNA為模板，采用引物:PPP6-BamHⅠF:5′-cgcggatccACTAGGGGAGACGAAAAAAAATGG-3′；PPP6-NotⅠ R:5′-ttttccttttgcggccgcTAAAAAATACGGAAT-GGTCGC-3′，擴(kuò)增PPP6基因功能區(qū)域。將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化后，經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ限制性?xún)?nèi)切酶37℃孵育2 h，純化回收。pET32a(+)原核表達(dá)載體采用BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后回收純化。采用T4連接酶16℃過(guò)夜連接pET32a(+)載體和PPP6-DNA片段酶切產(chǎn)物，構(gòu)建pET32a(+)-PPP6表達(dá)載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至宿主菌Rosetta(DE)Competent Cell，菌落PCR鑒定選取陽(yáng)性克隆后，質(zhì)粒小提，送華大基因公司測(cè)序。采用MEGA7.0軟件，將測(cè)序結(jié)果與PlasmoDB(http://www.plasmodb.org)數(shù)據(jù)庫(kù)中PPP6基因組DNA序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.2重組蛋白的表達(dá)、純化與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫 選取pET32a(+)-PPP6陽(yáng)性克隆菌液加入LB培養(yǎng)基中，經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后20℃過(guò)夜搖菌表達(dá)重組蛋白，采用HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads純化PPP6-his重組蛋白并檢測(cè)蛋白濃度。將純化的重組蛋白用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，使用25 V、30 min 半干法轉(zhuǎn)膜條件，使用5%脫脂奶粉封閉，4℃過(guò)夜。將封閉后的PVDF膜用TBST漂洗3次后，采用6×His Tag Monoclonal Antibody(1∶2 000)孵育PVDF膜，室溫1 h。用TBST洗滌3次，每次10 min，采用HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗孵育PVDF膜，室溫1 h，TBST洗滌6次，每次5 min。采用ECL發(fā)光方法，熒光圖像分析系統(tǒng)中檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫方法為6～8周齡BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為2組，每組5只，組1免疫PPP6重組蛋白(PPP6)；組2為PBS對(duì)照組(PBS)。隔周皮下免疫一次，共免疫3次，初次免疫重組蛋白(50 μg/只)與完全弗氏佐劑充分混合，二免和三免中重組蛋白與不完全弗氏佐劑混合。

1.2.3血清特異性抗體水平檢測(cè) 用溶解在碳酸鹽緩沖液的PPP6重組蛋白(10 μg)包被96孔酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜。采用含1%BSA的PBST封閉，37℃ 1 h，PBST清洗3次。以PBS緩沖液連續(xù)倍比稀釋免疫后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠抗PPP6免疫血清，每孔100 μl，37℃孵育2 h，PBST清洗3次后，加入1∶5 000 倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，孵育1 h，PBST清洗后，加入底物鄰苯二胺和過(guò)氧化氫進(jìn)行顯色，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處OD值。

1.2.4抗PPP6免疫血清對(duì)原蟲(chóng)有性發(fā)育階段抑制效果觀察 采用1×107個(gè)Pb.ANKA感染BALB/c小鼠，待感染后第3天，感染率達(dá)5%時(shí)取10 μl小鼠尾血與40 μl動(dòng)合子培養(yǎng)基(1640培養(yǎng)基+25%胎牛血清)混合，并將抗PPP6免疫血清按1∶5稀釋加入動(dòng)合子培養(yǎng)基中，放置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min 后，取1 μl涂片，并于10 min內(nèi)計(jì)數(shù)40個(gè)視野，計(jì)數(shù)配子體出絲的數(shù)目。取10 μl血液置于90 μl 動(dòng)合子培養(yǎng)液中，加稀釋的重組蛋白/對(duì)照免疫的小鼠血清(1∶5)。瘧原蟲(chóng)在19℃培養(yǎng)24 h。用抗Pbs21抗體固定和標(biāo)記培養(yǎng)物，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)動(dòng)合子數(shù)目并計(jì)算動(dòng)合子形成率。采用1×107個(gè)Pb.ANKA感染BALB/c小鼠，待感染后第3天，感染率達(dá)到3%，放置于饑餓12 h的雌性按蚊蚊籠中吸食血液30 min，去除未吸血的按蚊，吸血后的按蚊于10 d后解剖計(jì)數(shù)蚊胃壁的卵囊數(shù)及蚊感染率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，原蟲(chóng)血癥的組間比較采用Student′st檢驗(yàn)，配子體出絲和動(dòng)合子轉(zhuǎn)化率實(shí)驗(yàn)組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1pET32a (+)-PPP6載體構(gòu)建及其表達(dá)和純化 本研究中成功構(gòu)建了pET32a (+)-PPP6原核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)至大腸桿菌Rosetta(DE)Competent Cell表達(dá)系統(tǒng)，加入1 mmol/L IPTG，經(jīng)16℃誘導(dǎo)20 h 后，SDS-PAGE電泳分析可見(jiàn)大量可溶性PPP6重組蛋白(約38 kD)的表達(dá)。使用HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads柱純化重組蛋白，并對(duì)洗脫及透析后的樣品進(jìn)行Western blot檢測(cè)，可清晰看到目標(biāo)蛋白條帶約38 kD，大小符合目的蛋白分子量。其蛋白純度>85%，濃度可達(dá)到1 mg/ml，見(jiàn)圖1A、B。ELISA結(jié)果顯示，抗PPP6免疫血清抗體滴度為1∶3 200，見(jiàn)圖1C。

2.2抗PPP6免疫血清對(duì)雄配子體出絲的影響 為觀察抗PPP6免疫血清傳播阻斷效果，本研究首先通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察抗PPP6免疫血清對(duì)雄配子體出絲的抑制作用。與PBS免疫血清處理的對(duì)照組相比，1∶5倍稀釋的抗PPP6免疫血清可使配子體出絲數(shù)目減少62.5%(P<0.000 1)，提示抗PPP6免疫血清可影響雄配子出絲功能，見(jiàn)圖2。

2.3抗PPP6免疫血清對(duì)體外動(dòng)合子期原蟲(chóng)發(fā)育的影響 如圖3A所示，1∶5倍稀釋的抗PPP6免疫血清與原蟲(chóng)進(jìn)行體外動(dòng)合子培養(yǎng)24 h后可使動(dòng)合子數(shù)目顯著下降65.3% (P<0.000 1)。動(dòng)合子轉(zhuǎn)化率觀察顯示，1∶5倍稀釋的抗PPP6免疫血清可顯著抑制動(dòng)合子轉(zhuǎn)化率，使動(dòng)合子轉(zhuǎn)化率下降42.07%(P<0.000 1，圖3B)。上述結(jié)果提示抗PPP6免疫血清可體外抑制動(dòng)合子的形成和分化。

2.4抗PPP6免疫血清對(duì)囊合子形成數(shù)量的影響 采用100 μl抗PPP6免疫血清尾靜脈輸入Pb.ANKA原蟲(chóng)感染3 d的BALB/c小鼠體內(nèi)，1 h后對(duì)感染小鼠進(jìn)行蚊飼1 h，10 d后計(jì)數(shù)蚊胃內(nèi)囊合子數(shù)量。本研究發(fā)現(xiàn)，吸食抗PPP6免疫血清過(guò)繼轉(zhuǎn)移組小鼠血液的按蚊胃內(nèi)囊合子形成顯著減少(P<0.000 1，圖4)。與對(duì)照組相比，蚊感染率下降8.39%，而蚊胃內(nèi)囊合子密度減少68.91%，見(jiàn)表1。上述結(jié)果提示抗PPP6免疫血清可抑制蚊體內(nèi)囊合子形成。

圖1 PPP6重組蛋白表達(dá)檢測(cè)Fig.1 Expression of recombinant PPP6 proteinNote: A.The coomassie brilliant blue staining result of recombinant PPP6 protein.B.Western Blot detection of recombinant PPP6 protein by using 6×His Tag Monoclonal Antibody (1∶2 000 dilutions).Arrows indicate recombinant PPP6 proteins.C.ELISA assay for antibody titer detection of anti-PPP6 serum.*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001.

圖2 抗PPP6免疫血清對(duì)雄配子體出絲的影響Fig.2 Effect of anti-PPP6 serum on male gametocyte exflagellationNote: PBS.PBS immunized group;PPP6.Recombinant Plasmodium berghei PPP6 protein immunized group.****.P<0.000 1.tubⅡ.anti-tubulin Ⅱ antibody.Arrows indicate microgamete exflagellation.

圖3 抗PPP6血清對(duì)動(dòng)合子數(shù)目和形成率的影響Fig.3 Effect of anti-PPP6 serum on ookinete number and ookinete conversion rateNote: A.The effect of anti-PPP6 serum on ookinete number.B.The effect of anti-PbPPP6 serum on ookinete conversion rate.PBS.PBS immunized group;PPP6.Recombinant Plasmodium berghei PPP6 protein immunized group.****.P<0.000 1.P21.Anti-Pbs21 mAb.

圖4 抗PPP6血清對(duì)囊合子形成的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of anti-PPP6 serum on oocysts formationNote: PBS.PBS immunized group;PPP6.Recombinant Plasmodium berghei PPP6 protein immunized group.****.P<0.000 1.M1,M2 and M3 represents three times biological replicates.Right panels are representative oocysts′ figures from mosquito midgut of PBS and PPP6 group,respectively.

表1 抗PPP6免疫血清傳播阻斷效果Tab.1 Transmission blocking effect of anti-PPP6 serum

Note：1)P<0.05 for comparisons between the experimental group and the control group.a.The prevalence of infection was calculated by the number of mosquitoes with oocysts/total mosquitoes dissected in each group×100%；b.The percent reduction of prevalence was calculated as % mean prevalencecontrol-% mean prevalencerPb51；c.Mean number of oocysts per mosquito midgut；d Standard error of the mean；e.The percent reduction in oocyst intensity was calculated as (mean oocyst intensityPBS-mean oocyst intensityPPP6)/mean oocyst intensityPBS×100%.

3 討論

蛋白磷酸化與去磷酸化是真核細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路，其動(dòng)態(tài)變化幾乎涉及從胚胎發(fā)育到個(gè)體成熟的所有過(guò)程，包括細(xì)胞的癌變和凋亡[15]。磷酸化與去磷酸化的平衡主要由PKs和PPPs調(diào)控。其中PKs的研究目前已經(jīng)取得一定成果，并被普遍認(rèn)為是抗瘧重要靶位，關(guān)于瘧原蟲(chóng)PPPs的研究近幾年也已成為熱點(diǎn)。根據(jù)氨基酸序列的同源性、結(jié)構(gòu)特征和催化機(jī)制的不同,PPP分為三個(gè)家族:PPPs、磷酸化酪氨酸蛋白磷酸酶(Phosphotyrosine residues phosphatases,PTPs)和 Mg2+依賴(lài)的磷酸化絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶(Mg2+-dependent phosphoserine and phosphothreonine residues phosphatases,PPMs)。PPPs由PP1、PP2A、PP2B、PP5和PP7 等亞家族組成[16]。PPP6屬于PP2A家族，其研究尚處于起步階段。本研究中，我們選取伯氏瘧原蟲(chóng)絲/蘇氨酸磷酸酶PPP6蛋白，探討其免疫血清對(duì)瘧原蟲(chóng)有性階段生長(zhǎng)發(fā)育的影響[12]。

經(jīng)典的TBVs候選抗原，如:配子受精前期靶抗原P45/48、P230，受精后期靶抗原P25、P28和 蚊 蟲(chóng) 中 腸 靶 抗 原HAP2均為原蟲(chóng)有性階段表面蛋白。P25和P28為動(dòng)合子表面蛋白，介導(dǎo)動(dòng)合子侵入胃壁上皮細(xì)胞[17-19]。Pvs25已經(jīng)進(jìn)入了Ⅰ期臨床試驗(yàn)，Pvs25疫苗可減少80%的卵囊形成，并降低20%～30% 的按蚊感染率，但其傳播阻斷效果未達(dá)到100%[20]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PPP6蛋白主要表達(dá)在原蟲(chóng)有性發(fā)育階段(結(jié)果未顯示)。本研究中，采用PPP6重組蛋白免疫后，ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)小鼠血清中抗PPP6特異性抗體水平顯著升高。同時(shí)，Western blot結(jié)果顯示抗PPP6免疫血清可以特異性結(jié)合內(nèi)源性PPP6蛋白。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示伯氏瘧原蟲(chóng)PPP6重組蛋白免疫后的抗血清具有良好的免疫原性和抗原性，為其作為T(mén)BVs候選抗原提供了理論基礎(chǔ)?？筆PP6免疫血清在體外可顯著抑制配子體出絲，與對(duì)照組相比，出絲數(shù)量減少62.5%，提示其可抑制雄配子體發(fā)育，并影響后續(xù)發(fā)育階段中的雄/雌配子體受精過(guò)程。前期研究中發(fā)現(xiàn)，PPP6蛋白在有性發(fā)育階段高表達(dá)，并定位于配子體和動(dòng)合子期原蟲(chóng)胞漿膜內(nèi)側(cè)。由于有性階段原蟲(chóng)胞膜的高通透性可使免疫血清中特異性抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)而與特異性抗原結(jié)合。為明確抗PPP6免疫血清的傳播阻斷效果，我們分別進(jìn)行體外動(dòng)合子培養(yǎng)和蚊體內(nèi)卵囊形成實(shí)驗(yàn)。與預(yù)期研究結(jié)果一致，當(dāng)在動(dòng)合子培養(yǎng)基中加入1∶5的抗PPP6免疫血清時(shí)，其對(duì)動(dòng)合子形成的抑制效果明顯，大于40%的原蟲(chóng)停滯在未成熟動(dòng)合子階段。同時(shí)，蚊體內(nèi)卵囊形成實(shí)驗(yàn)顯示，抗PPP6血清可顯著抑制蚊胃內(nèi)卵囊形成，證實(shí)抗PPP6免疫血清的良好傳播阻斷效果。由于PPP6蛋白在伯氏瘧原蟲(chóng)中的多個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá)，因此抗PPP6的免疫血清可能對(duì)伯氏瘧原蟲(chóng)的其他發(fā)育階段也存在影響，如子孢子的形成及其感染能力等。此假設(shè)尚需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)，抗PPP6免疫血清對(duì)紅內(nèi)期原蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的作用尚需深入研究。

綜上所述，本研究對(duì)伯氏瘧原蟲(chóng)PPP6蛋白免疫小鼠后的免疫原性和免疫反應(yīng)性及抗PPP6免疫血清的傳播阻斷效應(yīng)進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)PPP6具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性。通過(guò)使用鼠瘧模型確定了伯氏瘧原蟲(chóng)PPP6蛋白作為新型TBVs候選抗原的傳播阻斷能力，并為惡性瘧原蟲(chóng)和間日瘧原蟲(chóng)PPP6蛋白作為瘧疾TBVs候選抗原的可行性提供了必要的理論依據(jù)。