呂 娟 趙紅梅 孫桂芳 王潤青

(鄭州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，鄭州 450000)

腦卒中是腦部血管破裂或血管柱塞導(dǎo)致腦損傷的一種急性腦血管疾病，具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率[1]。2015年的調(diào)查報(bào)告顯示，全球約有4 000 萬腦卒中患者，造成600萬人死亡，是僅次于冠狀動(dòng)脈的第二大致死疾病[2]。目前治療手段主要有抗血小板、靜脈溶栓、動(dòng)脈溶栓和取栓，血管成形和支架植入[3]。許多實(shí)驗(yàn)證明神經(jīng)保護(hù)劑、抗氧化劑通過對(duì)抗活性氧或抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，減少由缺血引起的組織損傷，然而到臨床期，所有的藥物都宣告失敗[4]。丹參是著名的傳統(tǒng)中藥材，廣泛地應(yīng)用于治療各種心血管疾病[5]。丹參的主要有效水溶性成分是丹酚酸B(Salvianolic acid B，Sal B)和二羥基苯基乳酸[6]。研究顯示，丹酚酸B能減弱白細(xì)胞對(duì)肝竇性的黏附性，抑制嗜中性內(nèi)皮細(xì)胞黏附，抑制內(nèi)皮細(xì)胞中細(xì)胞間黏附分子1(Intercellular adhesion molecular 1，ICAM-1)的表達(dá)[7]。丹酚酸B通過抑制核因子b的激活，減弱了內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1和血管細(xì)胞黏附分子1的表達(dá)[8]。另外許多研究證實(shí)，丹酚酸在氧化應(yīng)激和癌癥治療方面發(fā)揮作用[9,10]。但是丹酚酸B對(duì)腦缺血再灌注的影響還鮮有研究。本文將探究丹酚酸B對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 丹酚酸標(biāo)準(zhǔn)品(115939-25-8)購自源葉生物；SD大鼠購自廣東醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；HE染色試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天；總超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒購自上海紀(jì)寧生物；丙二醛(Malonaldehyde，MDA)和乳酸脫氫酶(Lactate dehyderogenase，LDH)檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物；免疫組化SP試劑盒購自默沙克生物；Ripa裂解液購自索萊寶生物科技公司；ICAM-1、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、VEGFR2、P38、p-P38、p-熱休克蛋白(Heat shock protein，HSP)27兔抗大鼠一抗購自Abcam；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗及DAB顯色液購自上海羽朵生物。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1小鼠分組及模型建立 SD大鼠實(shí)驗(yàn)前，適應(yīng)環(huán)境一周。將40只SD大鼠分成4組：健康組(Ctrl)；加藥組：健康大鼠腹腔注射丹酚酸B 50 mg/kg體重；模型組：參考文獻(xiàn)建立局灶性腦缺血再灌注(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型；模型加藥組：模型大鼠腹腔注射丹酚酸 B 50 mg/kg體重。加藥組和模型加藥組大鼠在建模前3 d 腹腔注射給藥，每天1次，再灌注2 h時(shí)再次給藥；健康組和模型組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水；大鼠在再灌注24 h后處死。根據(jù)Longa提出的可逆性大腦中動(dòng)脈閉塞線栓法制作局灶性腦缺血再灌注大鼠模型。用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，頸正中切口暴露頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和翼腭動(dòng)脈，將單絲尼龍線由頸總動(dòng)脈插入，栓塞左側(cè)大腦中動(dòng)脈，缺血2 h后，取出尼龍線，24 h再灌注。模型成功的標(biāo)志是大鼠右側(cè)肢體癱瘓，站立不穩(wěn)。

1.2.2HE染色 大鼠用4%的多聚甲醛灌注后取腦，10%中性福爾馬林固定，常規(guī)方法石蠟包埋，切片。二甲苯脫蠟，梯度乙醇洗脫，最后加入蒸餾水。蘇木素溶液處理5 min，自來水洗，70%和90%乙醇脫水各10 min，酒精伊紅染色液染色3 min；切片經(jīng)無水乙醇脫水，經(jīng)二甲苯透明后，中性樹膠封固。光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3TUNEL染色 常規(guī)方法石蠟包埋、脫蠟、至水。切片用二甲苯處理后，梯度乙醇洗脫，加蛋白酶K 室溫水解15 min，蒸餾水洗。加含2%過氧化氫的PBS室溫處理5 min，PBS清洗；加TDT酶反應(yīng)液，濕盒中反應(yīng)1 h；加反應(yīng)終止液，PBS清洗，加過氧化物酶標(biāo)記的抗體，DAB顯色，蘇木素復(fù)染；二甲苯脫水，封片，干燥后在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4免疫組化 石蠟切片用3%乙酸滅活內(nèi)源性酶，高溫加熱修復(fù)抗原；加山羊血清封閉，加PBS稀釋好的抗體，37℃孵育2 h,PBS清洗后，加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min；DAB顯色；用含1%的Tween 20的PBS清洗；蘇木素復(fù)染，加堿性緩沖液返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。使用軟件Image J分析ICAM-1陽性細(xì)胞的面積，計(jì)算陽性細(xì)胞的百分比。

1.2.5Western blot 取組織細(xì)胞至含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解緩沖液中，4℃下處理1 h，離心取上清。用BCA法測定蛋白濃度，加上樣緩沖液制作蛋白樣品。同等量的蛋白樣品用12%的變性蛋白凝膠分離，轉(zhuǎn)膜，5%BSA的封閉液常溫封閉1 h，加一抗4℃孵育過夜，TBST洗3次，每次5 min；加二抗室溫下孵育2 h，TBST洗膜后，加顯色液，凝膠成像儀中觀察并拍照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS16.0處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，多組間比較使用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1丹酚酸B緩解局灶性腦缺血再灌注誘導(dǎo)的大鼠腦組織的損傷 加藥組與健康組相比，MCAO大鼠腦組織沒有出現(xiàn)明顯變化，神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和腦血管形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，核仁清晰(圖1)。模型組與對(duì)照組相比，大量神經(jīng)細(xì)胞失去完整結(jié)構(gòu)，細(xì)胞周圍明顯腫脹，部分出現(xiàn)壞死后形成的空泡(圖1)。模型組加藥處理后，細(xì)胞排列明顯規(guī)則，層次清晰，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常(圖1)。

2.2丹酚酸B抑制局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織細(xì)胞凋亡 模型組與對(duì)照組相比較，TUNEL染色呈陽性的細(xì)胞數(shù)量顯著上升(圖2，P<0.01)。模型加藥組與模型組相比較，發(fā)生凋亡的細(xì)胞比例顯著降低(圖2，P<0.01)。

2.3丹酚酸B抑制局灶性腦缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng) 模型組與對(duì)照組相比，腦組織中SOD的活性顯著降低，MDA和LDH的含量顯著上升(圖3，P<0.01)。模型加藥組與模型組相比，SOD活性顯著上升，MDA和LDH的含量顯著降低(圖3，P<0.01)。

圖1 丹酚酸B對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織病理損傷的影響Fig.1 Effect of Salvianolic acid B on pathological damage in focal cerebral ischemia reperfus-ion rats

圖2 丹酚酸B對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of Salvianolic B on cell apoptosis in MCAO ratsNote：*.P<0.01 vs Ctrl group,#.P<0.01 vs MCAO group.

2.4丹酚酸B降低局灶性腦缺血再灌注誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng) 免疫組化結(jié)果顯示，模型組與對(duì)照組相比較，大鼠腦組織中ICAM-1的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(圖4，P<0.01)。模型組大鼠注射丹酚酸B后，大鼠腦組織中ICAM-1的表達(dá)顯著下調(diào)(圖4，P<0.01)。

2.5丹酚酸B誘導(dǎo)MCAO大鼠腦組織損傷部位血管生成 模型組與對(duì)照組相比，大鼠腦組織VEGF及VEGFR2的表達(dá)顯著下調(diào)(圖5，P<0.01)。模型加藥組與模型組相比，大鼠腦組織VEGF和VEGFR2的表達(dá)顯著上調(diào)(圖5，P<0.01)。

2.6丹酚酸B促進(jìn)P38和Hsp27的磷酸化激活 Western blot 結(jié)果顯示，各組之間P38和Hsp27表達(dá)總量差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6，P<0.01)。模型組與對(duì)照組相比較，磷酸化P38和磷酸化Hsp27的表達(dá)顯著下調(diào)(圖6，P<0.01)。模型加藥組與模型組相比較，磷酸化P38和磷酸化Hsp27的表達(dá)顯著上調(diào)。

圖3 丹酚酸B對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of Salvianolic B on oxidative stress response in MCAO ratsNote：*.P<0.05 vs Ctrl group,#.P<0.05 vs MCAO group.

圖4 丹酚酸對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織ICAM-1表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Salvianolic B on expression of ICAM-1 protein in MCAO ratsNote：*.P<0.05 vs Ctrl group,#.P<0.05 vs MCAO group.

圖5 丹酚酸B對(duì)MCAO大鼠腦組織VEGF和VEGFR2表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Salvianolic B on expression of VEGF and VEGFR2 in MCAO ratsNote：*.P<0.01 vs Ctrl group,#.P<0.01 vs MCAO group.

3 討論

缺血性腦卒中占中風(fēng)患者的絕大部分。腦組織缺血后，供氧中斷，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)能量耗竭、乳酸堆積、內(nèi)穩(wěn)態(tài)遭破壞、神經(jīng)遞質(zhì)異常、興奮氨基酸毒性，再灌注產(chǎn)生大量氧自由基，常導(dǎo)致缺血腦組織的進(jìn)一步損傷[11]。大量研究顯示，丹酚酸B對(duì)機(jī)體損傷部位具有保護(hù)作用。如Gu等[12]研究顯示，丹酚酸B通過調(diào)節(jié)ERK/P38/核因子樣蛋白2(Nuclear factor-like 2 protein，Nrf2)信號(hào)通路，減輕大鼠蜘蛛網(wǎng)膜下出血引起的早期腦組織損傷。Ma等[13]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B通過對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)控，抑制氧化反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，降低腎缺血再灌注誘導(dǎo)的損傷。本文研究結(jié)果顯示，丹酚酸B能緩解局灶性腦缺血再灌注誘導(dǎo)的腦組織病變。

當(dāng)機(jī)體遭受慢性損傷或應(yīng)激時(shí)，機(jī)體可以啟動(dòng)一系列的防御機(jī)制從而產(chǎn)生保護(hù)作用。細(xì)胞凋亡是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡。腦缺血再灌注引起的興奮性氨基酸毒性、一氧化氮和乳酸堆積等過程都能加快細(xì)胞正常死亡的進(jìn)程[14]。大量研究表明，丹酚酸B能抑制細(xì)胞凋亡。如Tao等[15]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B通過調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)和線粒體膜電位，抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠胰島素細(xì)胞INS-1自噬。Chen等[16]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B通過轉(zhuǎn)化受體電位陽離子通道亞家族C成員3(Transient receptor potential cation channel,TRPC3)和TRPC6介導(dǎo)的鈣離子過載，抑制阿霉素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和心肌細(xì)胞自噬。本研究結(jié)果顯示，丹酚酸B抑制局灶性腦缺血再灌注誘導(dǎo)的腦組織細(xì)胞凋亡。

當(dāng)機(jī)體受多種內(nèi)外因刺激時(shí)，產(chǎn)生大量自由基，使氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，造成組織損傷。腦缺血再灌注后，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)腦組織具有保護(hù)作用[17]。SOD、MDA和LDH是常見的氧化應(yīng)激水平的檢測指標(biāo)[18]。Chen等[19]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)P53和Caspase-3信號(hào)通路，緩解氧化帶密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。另外一研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B通過調(diào)節(jié)Nrf2抑制多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，使SOD和谷胱甘肽的含量上升[20]。與前人研究一致，本研究結(jié)果表明，丹酚酸B能抑制局灶性腦缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

ICAM-1是一種定位于內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞表面的糖蛋白，在穩(wěn)定細(xì)胞間的相互作用和促進(jìn)白細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞的遷移過程中發(fā)揮重要的作用[21]。正常情況下，ICAM-1低表達(dá)，當(dāng)受到細(xì)胞因子如IL-1、TNF的刺激后表達(dá)量急劇增高。激活的ICAM-1與配體結(jié)合后，通過級(jí)聯(lián)許多激酶，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[22]。研究證實(shí)，ICAM-1與蜘蛛網(wǎng)膜下出血患者二級(jí)癥狀相關(guān)，抑制ICAM-1會(huì)明顯改善這些癥狀[23]。如Xu等[24]研究顯示，丹酚酸B通過降低ICAM的表達(dá)，進(jìn)而抑制血小板活化和神經(jīng)炎癥反應(yīng)，對(duì)腦缺血再灌注大鼠的腦組織神經(jīng)具有保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，丹酚酸B能顯著降低局灶性腦缺血再灌注誘導(dǎo)的大鼠腦組織ICAM-1的高表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

VEGF與其受體分子VEGFR能提高血管通透性，增加細(xì)胞外基質(zhì)變性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移，促進(jìn)血管的生成。在胚胎發(fā)生、骨骼生長、新血管生成、損傷后新生管生長以及繞過阻塞血管的新血管形成等過程都與VEGF相關(guān)[25]。本研究結(jié)果表明，丹酚酸B誘導(dǎo)局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織血管的新生。

P38蛋白激酶參與細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞凋亡的調(diào)控。P38激活后，通過調(diào)節(jié)下游蛋白的激活與表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控[26]。Hsp27是熱休克蛋白家族的成員之一，受P38調(diào)控能抑制Caspase和NF-κB的活化，產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激作用，進(jìn)而減輕組織受到的損害[18,27]。在多種應(yīng)激反應(yīng)下，Hsp27可以高表達(dá)。Zeng等[28]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B通過調(diào)節(jié)p38介導(dǎo)的活性氧生成，抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞自噬。Tang等[29]研究顯示，通過調(diào)節(jié)p38 MAPK/激活轉(zhuǎn)錄因子2(Activating transcription factor 2，ATF-2)信號(hào)通路，丹酚酸B保護(hù)人體內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激功能缺失的影響。

綜上所述，丹酚酸B能誘導(dǎo)局灶性缺血再灌注大鼠腦組織血管的新生，緩解氧化應(yīng)激對(duì)腦組織的損傷。本研究下一步計(jì)劃將探討丹酚酸B對(duì)離體神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制。