趙建峰 李記彬 石剛 喬鋆 張睿

結直腸癌是惡性程度較高的消化道腫瘤，近年來結直腸癌的發(fā)生率和死亡率不斷上升，臨床也對結直腸癌的防治研究加強了重視［1］。如今腫瘤標志物在癌癥患者的早期診斷和療效評估上受到了關注。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是結直腸癌診斷與預后評估的重要實驗室指標，近期研究表明其在結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色［2-4］。黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）作為IFI20X_IFI16蛋白家族成員之一，在黑色素瘤、前列腺癌、結直腸癌、肝癌等均有異常表達。國外學者研究指出，AIM2的表達缺失與結直腸癌病例的預后不良存在密切關系［4］。為此，本研究探討了CEA和AIM2在結直腸癌中的表達及其臨床意義，現(xiàn)報道如下。

資料與方法

一、臨床資料

118例結直腸癌及其50例癌旁正常組織標本（距離腫瘤外緣5 cm）取自我院2010年1月～2013年3月收治的結直腸癌患者。其中男性74例，女性44例，年齡24～85歲，平均（68.3±9.5）歲，依據(jù)AJCC腫瘤分期標準術后TNM分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期53例，Ⅲ期49例。納入標準：①所有患者術后均經(jīng)病理學確診為結直腸癌；②術前未進行化療、放療及免疫治療；③自愿加入試驗者。排除標準：①自身免疫性疾病患者；②感染性疾病患者。

二、實驗方法

采用免疫組織化學法測定組織中AIM2的表達：手術中切除標本立即常規(guī)福爾馬林固定，取材，常規(guī)石蠟包埋，制片。切片經(jīng)脫蠟水化后，滴加3%過氧化氫，在含有煮沸的檸檬酸修復液的修復盒中進行抗原修復，封閉液37 ℃濕盒孵育30 min。滴加一抗，于4 ℃冰箱過夜，次日加入生物素標記的二抗，置于37 ℃保溫箱20 min。PBS緩沖液沖洗，經(jīng)DAB顯色，蘇木精復染、脫水透明和中性樹膠封片。組織染色的結果依據(jù)染色強度以及陽性細胞百分比進行評定：（1）依據(jù)陽性細胞百分比：0級（陽性細胞≤5%）、1級（陽性細胞5%～25%）、2級（陽性細胞25%～50%）、3級（為陽性細胞50%～75%）、4級（陽性細胞＞75%）；（2）依據(jù)染色強度：0級（無褐色染色）、1級（淺棕色）、2級（棕色）和3級（深棕色）。最后由陽性細胞百分比和染色強度分數(shù)共同決定，兩者相乘即為最終染色評分：（陰性0）、＋（1～4）、＋＋（5～8）和＋＋＋（9～12）。-和＋代表低表達，＋＋以及＋＋＋代表高表達。兔抗人多克隆抗體 AIM2（ab93015）購自美國Abcam公司；濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

術前通過電化學發(fā)光法（ECUA）測定的血清CEA水平：所有研究對象均于清晨空腹抽取靜脈血3 mL，置于凝血酶促凝生化管，分離血清后，采用ECUA法，通過羅氏e411電化學發(fā)光分析儀測定血清CEA水平。所有操作均嚴格根據(jù)標準流程進行。血清CEA≥6.50 ng/mL即陽性。

三、觀察指標

回顧性搜集患者臨床病理參數(shù)，包括患者的年齡、性別、腫瘤大小、部位、浸潤深度、TNM分期、分化程度、淋巴結轉移。分析癌組織中AIM2表達水平和血清CEA水平的相關性，并分析兩種指標與臨床病理參數(shù)的關系。

收集患者的總生存時間，即手術治療日期至末次隨訪日（2018年5月30日）或死亡時間。

四、統(tǒng)計學分析

研究所得數(shù)據(jù)均采取SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析。其中，計量資料用（）的形式表示，應用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料組間比較應用χ2檢驗，Spearman等級相關分析對AIM2表達與血清CEA水平進行相關性分析，采用Kaplan-Meier法進行生存分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、結直腸癌組織AIM2和血清CEA表達

本次研究結果中，有42例（35.59%）腫瘤組織AIM2呈高表達，有39例（78.0%）癌旁正常組織AIM2呈高表達，差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=25.295，P＜0.05）。見表1。結直腸癌患者術前血清CEA陽性率為44.07%（52/118）。Spearman等級相關性分析結果顯示，結直腸癌組織AIM2和血清CEA表達呈負相關（r=-0.660，P＜0.001）。

表1 腫瘤組織癌旁正常組織與AIM2表達［例（%）］

二、癌組織AIM2及血清CEA與臨床參數(shù)的關系

癌組織AIM2表達水平在腫瘤的浸潤深度、TNM分期以及淋巴結轉移上有明顯差異（χ2=4.847，7.794，3.961；P＜0.05）。見表2?；颊咝g前血清CEA水平在腫瘤的大小、TNM分期以及分化程度上差異有統(tǒng)計學意義（χ2=17.14，5.779，5.293；P＜0.05）。見表3。

三、結直腸癌AIM2和血清CEA表達水平與預后關系

K-M生存分析顯示，AIM2高表達患者5年總生存率（66.67%）明顯高于低表達患者（48.68%）；平均生存時間分別為（74.00±3.04）和（63.41±3.39）個月，（t=16.841，P＜0.001）（見圖1）。與術前CEA陽性患者總生存率（44.23%）相比，陰性患者的生存率明顯更高，為73.08%。CEA陽性和陰性患者平均生存時間分別為（60.40±3.27）和（74.12±3.46）個月，差異有統(tǒng)計學意義（t=21.906，P＜0.001）（見圖2）。聯(lián)合分析結果顯示，AIM2高表達聯(lián)合CEA陰性總生存率（63.16%）明顯高于AIM2低表達聯(lián)合CEA陽性總生存率（39.58%）；平均生存時間分別為（72.51±3.25）和（57.67±3.29）個月，差異有統(tǒng)計學意義（t=20.885，P＜0.001）。見圖3。

表2 癌組織AIM2與臨床參數(shù)的關系［例（%）］

討 論

結直腸癌起病隱匿，進展快，多數(shù)患者入院就診時已處于中晚期，存在亞臨床腫瘤微轉移，不利于預后［5-6］。早期診斷，采取有效治療或干預措施是取得良好預后非常重要的前提。為此，一直以來探尋療效評估的腫瘤標志物成為了臨床研究的焦點。

表3 患者血清術前CEA水平與臨床參數(shù)的關系［例（%）］

圖1 AIM2高表達和低表達組生存曲線

圖2 術前CEA陽性和陰性組生存曲線

圖3 AIM2高表達聯(lián)合CEA陰性與AIM2低表達聯(lián)合CEA陽性生存曲線

AIM2最早在黑色素瘤細胞中發(fā)現(xiàn)，是模式識別受體，相關研究表明，AIM2炎性小體可釋放IL-1β和IL-18等炎性因子，啟動固有免疫應答［7-8］。早期認為，該指標是腫瘤抑制因子，其過表達能夠抑制纖維原細胞的增殖。相關研究發(fā)現(xiàn)AIM2在口腔鱗狀細胞癌、鼻咽癌等、肺腺癌中呈高表達，在肝癌、乳腺癌和前列腺癌中呈低表達。在子宮內膜癌、結直腸癌中存在AIM2基因的移碼與錯義突變［9］。本研究結果顯示，AIM2在結直腸癌組織中的表達率明顯低于癌旁正常組織，比較差異具有統(tǒng)計學意義。進一步分析AIM2表達水平與腫瘤的浸潤深度、TNM分期以及淋巴結轉移相關，提示結直腸癌組織AIM2表達缺失與結直腸癌進展及腫瘤分期有關。在抗腫瘤免疫應答中，胞內DNA 傳感通路發(fā)揮著重要的作用，AIM2就是其中之一，可視作識別有免疫原性的DNA疫苗，增強抗腫瘤免疫應答［10-11］。

CEA是一種糖蛋白，在促進腫瘤細胞免疫逃避、擴散及轉移中扮演著重要的角色［12-13］。如今，血清CEA在結直腸癌的術前評估和預后預測中得到了廣泛應用，尤其在腫瘤復發(fā)監(jiān)測方面。本研究結果顯示，結直腸癌患者術前血清CEA陽性率為44.07%，術前血清CEA水平與腫瘤大小、TNM分期以及分化程度相關。Spearman等級相關性分析結果顯示，結直腸癌組織AIM2和血清CEA表達呈負相關。提示血清CEA水平與結直腸癌發(fā)生發(fā)展有關。有學者發(fā)現(xiàn)CEA促癌作用與TGF-β信號途徑存在密切關系，CEA能夠抑制TGF-β信號途徑［14］。而且相關研究指出CEA能夠抑制NK對癌細胞的殺傷并促其凋亡［15］。這些研究結果可能會對結直腸癌的治療提供參考，現(xiàn)如今CEA基因瘤苗的研制為結直腸癌免疫治療指明了新方向。本研究中癌組織中AIM2高表達聯(lián)合CEA陰性者的臨床預后明顯優(yōu)于AIM2低表達聯(lián)合CEA陽性，提示聯(lián)合分析兩個指標有助于評估結直腸癌患者預后。

綜上所述，結直腸癌患者AIM2和血清CEA表達可能與結直腸癌的進展有關，并且聯(lián)合兩個指標在評估患者預后具有一定價值。