(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院胸心外科，北京 100037；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 國(guó)家心血管病中心 心血管疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 心臟外科，北京100037)

主動(dòng)脈夾層指主動(dòng)脈腔內(nèi)的血液從主動(dòng)脈內(nèi)膜撕裂處進(jìn)入主動(dòng)脈中膜，形成的真假兩腔分離狀態(tài)[1]，是一種起病迅速、死亡率高的大血管疾病[2]；若未得到及時(shí)有效治療，死亡率至發(fā)病起以每小時(shí)2%～5%遞增[3]。雖然近年來臨床對(duì)主動(dòng)脈夾層的診治水平有了明顯提升，但圍手術(shù)期患者死亡率仍超過20%[4]。目前對(duì)主動(dòng)脈夾層的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，闡明發(fā)病機(jī)制對(duì)改良治療方案，提升患者預(yù)后水平具有重要意義。研究者發(fā)現(xiàn)，主動(dòng)脈中膜在維持主動(dòng)脈生理結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮決定作用，血管平滑肌細(xì)胞是主動(dòng)脈中膜最主要的組成成分[5]。亦有研究顯示，主動(dòng)脈夾層發(fā)生、發(fā)展中存在明顯的主動(dòng)脈中膜血管平滑肌細(xì)胞丟失，被認(rèn)為與血管平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡功能異常有關(guān)[6]，但分子機(jī)制仍未闡明。有絲分裂阻滯缺陷蛋白(Mitotic arrest deficient protein，MAD)和MAX作用蛋白(Max interacting protein，MAX)，均屬于原癌基因Myc family oncogene(MYC家族)[7]；相關(guān)研究顯示，MAX高表達(dá)可明顯抑制主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)凋亡，參與主動(dòng)脈夾層的發(fā)生、發(fā)展[8]。但關(guān)于MAD表達(dá)與主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的關(guān)系及在主動(dòng)脈夾層發(fā)病中的作用仍未見研究報(bào)道。MAD各亞型中以MAD1研究最為廣泛，已有報(bào)道證實(shí)，MAD1基因在白血病、乳腺癌、鼻咽癌等多種惡性腫瘤中發(fā)揮調(diào)控作用[9-10]。本研究收集了Stanford A型主動(dòng)脈夾層患者的升主動(dòng)脈病變組織中膜標(biāo)本，檢測(cè)MAD1基因表達(dá)水平；并通過腺病毒載體轉(zhuǎn)染技術(shù)在體外建立MAD1基因高表達(dá)人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞模型，檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡情況以及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年3月至2018年6月間在本院行手術(shù)治療的主動(dòng)脈夾層患者30例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)CT、MRI、超聲檢查并結(jié)合臨床癥狀確診為Stanford A型主動(dòng)脈夾層患者；②發(fā)病到住院時(shí)間≤14天。排除標(biāo)準(zhǔn)：①Stanford B型或慢性主動(dòng)脈夾層患者；②馬凡氏綜合征、主動(dòng)脈瓣二葉瓣化畸形的患者。其中男性22例，女性8例；年齡28～68歲，平均年齡(46.30±12.75)歲。收集術(shù)中切除的升主動(dòng)脈病變組織，保留富含血管平滑肌的中膜組織標(biāo)本為主動(dòng)脈夾層組。收集同期在本院行尸檢，且無手術(shù)史、無大血管病變史的升主動(dòng)脈壁內(nèi)組織標(biāo)本18份為對(duì)照組，其中男性10例，女性8例；年齡30～65歲，平均年齡(46.15±6.90)歲。兩組性別、年齡之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過，受試者家屬簽署知情同意書。

1.2 材料與主要試劑

人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(HA-VSMC)購(gòu)于上海滬震生物科技有限公司；腺病毒載體AdEasy系統(tǒng)由北京安必奇生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成；CCK8試劑盒、Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海鈺博生物科技有限公司；兔抗人MAD1多克隆抗體，鼠抗人含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(csyteine aspartic acic specific protease，Caspase)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9單克隆抗體均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HA-VSMC細(xì)胞放入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃ 5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代，傳至5～6代時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用腺病毒載體AdEasy系統(tǒng)過表達(dá)MAD1，分為空白對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染組、MAD1過表達(dá)組；轉(zhuǎn)染48h后通過RT-PCR和Western blot驗(yàn)證各組細(xì)胞中MAD1 mRNA和蛋白表達(dá)情況。

1.3.2 細(xì)胞增殖和凋亡實(shí)驗(yàn) 使用CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，按5 000個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)12 h后分別以重組腺病毒AdEasy-MAD1和空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，分別于轉(zhuǎn)染前，轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h，每孔滴加10 μL CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1h后，酶標(biāo)儀讀取490 nm處吸光度值。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，使用Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，操作按試劑盒說明進(jìn)行。

1.3.3 RT-PCR檢測(cè) Trizol法提取主動(dòng)脈組織和HA-VSMC細(xì)胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成，MAD1引物序列：上游5′-CCAACGAGAAGCAGCGAGAG-3′，下游5′-GTGAGGTTCCTCTCTTCCGT-3′；Caspase-3引物序列：上游5′-CAGTTAGGACAGGCACAGGC-3′，下游5′-GCTTGCTCTGAGACCGTACG-3′；Caspase-8引物序列：上游5′-GGACAGCCGAAGACGATA-3′，下游5′-GTAACGACCAGAGTGACC-3′。Caspase-9引物序列：上游5′-CCACTAT CTAACCAGGTTAAC-3′，下游5′-TGTTCAGTAATAATGGGAGTG-3′。反應(yīng)體系30 μL，反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，延伸72 ℃ 1 min。行2%瓊脂糖凝膠電泳，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算MAD1、Caspase-3、Caspase-8 、Caspase-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 Western blot檢測(cè) 對(duì)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 從前提轉(zhuǎn)變?yōu)閏leaved Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，RIPA提取主動(dòng)脈組織和HA-VSMC細(xì)胞中總蛋白，BCA法蛋白定量。蛋白樣品行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，滴加兔抗人MAD1多克隆抗體(1∶200)，鼠抗人Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9單克隆抗體(1∶500)，4 ℃過夜，滴加HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG(1∶1 000)，室溫反應(yīng)2 h，ECL顯色，避光顯影，以GAPDH為內(nèi)參對(duì)照計(jì)算各條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS18.0軟件分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間進(jìn)行F檢驗(yàn)，兩組間進(jìn)行t檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 主動(dòng)脈夾層中MAD1 mRNA和蛋白表達(dá)分析

RT-PCR檢測(cè)顯示，主動(dòng)脈夾層組患者主動(dòng)脈夾層中MAD1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；Western blot檢測(cè)顯示，主動(dòng)脈夾層組患者主動(dòng)脈夾層中MAD1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組。見圖1，表1。

圖1 主動(dòng)脈夾層中MAD1蛋白表達(dá)的Western blot電泳圖注：1～2為對(duì)照組；3～4為主動(dòng)脈夾層組

表1 兩組主動(dòng)脈夾層中MAD1 mRNA和蛋白表達(dá)分析

2.2 過表達(dá)MAD1的細(xì)胞系構(gòu)建與驗(yàn)證

轉(zhuǎn)染48 h后，空白對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染組、MAD1過表達(dá)組MAD1mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.42±0.11、1.50±0.18、8.05±0.73；MAD1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.07±0.09、1.12±0.14、7.63±0.59。MAD1過表達(dá)組MAD1mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于空白對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；證明已成功構(gòu)建過表達(dá)MAD1的HA-VSMC。

圖2 各組MAD1蛋白的Western blot電泳圖1：空白對(duì)照組；2：空載體轉(zhuǎn)染組；3：MAD1過表達(dá)組

2.3 各組細(xì)胞增殖情況

轉(zhuǎn)染前各組細(xì)胞增殖情況之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)，各組細(xì)胞增殖水平均逐漸增加，轉(zhuǎn)染48 h、72 h后MAD1過表達(dá)組細(xì)胞增殖明顯低于空白對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染組(P<0.01)；空白對(duì)照組與空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞增殖情況分析(OD值)

組別轉(zhuǎn)染前轉(zhuǎn)染24 h轉(zhuǎn)染48 h轉(zhuǎn)染72 h空白對(duì)照組0.17±0.060.45±0.080.97±0.191.40±0.26空載體轉(zhuǎn)染組0.18±0.060.43±0.110.99±0.251.37±0.24MAD1過表達(dá)組0.18±0.090.39±0.150.51±0.17ab0.64±0.19ab

與空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與空載體轉(zhuǎn)染組比較，bP<0.05

2.4 各組細(xì)胞凋亡情況分析

轉(zhuǎn)染48 h后，空白對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染組、MAD1過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率分別為：(5.31±0.86)%、(5.40±0.93)%、(17.65±2.50)%。MAD1過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；空白對(duì)照組與空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)(400×)

2.5 各組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平比較

MAD1過表達(dá)組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對(duì)照組與空載體轉(zhuǎn)染組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

與空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與空載體轉(zhuǎn)染組比較，bP<0.05

2.6 各組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表達(dá)水平比較

MAD1過表達(dá)組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染組(P<0.05)；空白對(duì)照組與空載體轉(zhuǎn)染組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4、圖4。

圖4 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的Western blot電泳圖1：空白對(duì)照組；2：空載體轉(zhuǎn)染組；3：MAD1過表達(dá)組

表4 各組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

與空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與空載體轉(zhuǎn)染組比較，bP<0.05

3 討 論

隨著近年來我國(guó)人口老齡化和高血壓患者的增加，主動(dòng)脈夾層的發(fā)病率明顯提升，而且已成為嚴(yán)重威脅居民生命安全的危重癥之一[11]。主動(dòng)脈夾層可累及體內(nèi)多個(gè)系統(tǒng)，表現(xiàn)復(fù)雜多樣，常表現(xiàn)為高血壓、胸痛、主動(dòng)脈瓣關(guān)閉不全等[12]。主動(dòng)脈夾層發(fā)病機(jī)制目前仍未完全明確，研究者認(rèn)為，主動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜和外膜結(jié)構(gòu)和功能的改變可能在主動(dòng)脈夾層發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其中主動(dòng)脈中膜在維持主動(dòng)脈壁生理結(jié)構(gòu)和功能的首要因素，平滑肌細(xì)胞丟失、凋亡、數(shù)量下降等導(dǎo)致的主動(dòng)脈中膜重構(gòu)是主動(dòng)脈夾層發(fā)生的病理基礎(chǔ)[13]。MAD和MAX可通過與自身或MYC家族其他成員形成同源二聚體或異源二聚體，在細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡中發(fā)揮調(diào)控作用[14]。已有研究證實(shí)，MAX表達(dá)上調(diào)可抑制主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。目前研究發(fā)現(xiàn)，MAD1基因在白血病、乳腺癌、鼻咽癌等多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮調(diào)控作用；但在主動(dòng)脈夾層發(fā)病過程中的作用仍未見相關(guān)研究報(bào)道。

Stanford A型主動(dòng)脈夾層是一種急需手術(shù)治療的致命性疾病，是主動(dòng)脈夾層中致死率最高的類型[15]。本研究以在本院行手術(shù)治療的Stanford A型主動(dòng)脈夾層患者為研究對(duì)象，收集術(shù)中切除的升主動(dòng)脈病變組織中膜部分為研究標(biāo)本。研究結(jié)果顯示，Stanford A型主動(dòng)脈夾層患者升主動(dòng)脈病變組織中膜部分組織中MAD1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于正常升主動(dòng)脈壁內(nèi)組織。提示MAD1高表達(dá)可能在主動(dòng)脈夾層發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮調(diào)控作用。進(jìn)一步在體外建立MAD1基因過表達(dá)人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞模型，檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡情況發(fā)現(xiàn)，MAD1基因過表達(dá)可明顯抑制HA-VSMC細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，加重主動(dòng)脈夾層病情。

Caspase家族是一組存在于細(xì)胞質(zhì)溶膠中的半胱氨酸蛋白酶，目前已確定至少11種亞型，在細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者[16]。研究者發(fā)現(xiàn)，Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡的主要原因，其中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9作用最明顯[17]；Caspase-3位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游，直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。細(xì)胞凋亡的胞外途徑中，凋亡信號(hào)傳導(dǎo)分子與Caspase-8特異性結(jié)合，活化后的Caspase-8與Caspase-3相互作用，激活Caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]；細(xì)胞內(nèi)途徑中，凋亡信號(hào)因子與相關(guān)蛋白酶形成復(fù)合物，之后與細(xì)胞質(zhì)中Caspase-9前體結(jié)合，激活Caspase-9，進(jìn)而活化下游Caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。本研究中，MAD1過表達(dá)組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表達(dá)水平較空白對(duì)照組與空載體轉(zhuǎn)染組明顯增加，提示MAD1過表達(dá)促進(jìn)HA-VSMC細(xì)胞凋亡可能通過激活細(xì)胞外凋亡途徑和細(xì)胞內(nèi)凋亡途徑來實(shí)現(xiàn)的。