2#張 威段君霞譚宗標(biāo)夏嘉祥胡楚暉戴桂明趙飛駿

(1.南華大學(xué)病原生物研究所/特殊病原體防控湖南省重點實驗室，湖南 衡陽 421001；2.邵陽學(xué)院臨床檢驗系，湖南 邵陽 422000；3.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系在讀本科生，湖南 衡陽 421001)

梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum，Tp)感染引起的一種慢性持續(xù)性多階段發(fā)展的疾病，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，且易與其它疾病相混淆，嚴(yán)重危害人類健康[1]。目前國內(nèi)梅毒實驗室診斷主要依賴RPR/TRUST、ELISA、膠體金等方法初篩，TPPA等方法確診的血清學(xué)檢測技術(shù)[2]。

RPR/TRUST成本低，但生物學(xué)假陽性較高；膠體金技術(shù)檢測簡單快速，但靈敏度不高；TPPA是目前國內(nèi)常用的梅毒確診方法之一，但試劑成本高，操作繁雜不可自動化且不能用于梅毒療效和再感染的判定。近年來，以Tp膜脂蛋白[3-4]及鞭毛蛋白[5]為基礎(chǔ)的ELISA和化學(xué)發(fā)光法具有操作簡便、快捷、自動化、數(shù)字化運行等優(yōu)勢，在梅毒篩查中被廣泛應(yīng)用，但這些抗原仍然無法實現(xiàn)對療效的評判。而基于心磷脂抗原的RPR/TRUST所檢測的反應(yīng)素滴度變化一定程度上能反映病原體對機(jī)體損傷程度[6]，可用于梅毒療效評判，但血清固定現(xiàn)象亦很多見。鑒于以上傳統(tǒng)梅毒血清學(xué)方法的不足，仍有必要尋找新型的診斷抗原，以進(jìn)一步提高對梅毒早期診斷及臨床愈后判斷的價值。

Tp在早期感染機(jī)體階段可合成分泌一些蛋白到菌體內(nèi)外，稱其為Tp感染依賴性抗原(體內(nèi)誘生抗原)[7-8]，這些蛋白可能在感染早期誘導(dǎo)產(chǎn)生相應(yīng)抗體，在Tp早期感染中具有潛在診斷價值。本研究在鑒定Tp0470蛋白感染依賴性抗原特性的基礎(chǔ)上，建立基于Tp0470的間接ELISA法，檢測468份各類臨床血清樣本，評價Tp0470在梅毒血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價值，為尋求新的梅毒診斷抗原提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌株

重組質(zhì)粒pET32a(+)/Tp0470、pET43.1a(+)/Tp92及E.coliRostta(DE3)株由南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院病原生物研究所成功構(gòu)建并保存。Tp Nichols標(biāo)準(zhǔn)株由廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬中山醫(yī)院臨床檢測中心楊天賜主任惠贈。

1.2 實驗用動物

新西蘭兔(許可證號SCXK湘2015-0004)由南華大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心實驗動物部供應(yīng)并協(xié)助管理。

1.3 主要實驗試劑

Qiagen基因組提取試劑盒由德國Qiagen公司出品，Toxin EraserTM內(nèi)毒素去除試劑盒由美國GenScript公司生產(chǎn)，二喹啉甲酸(BCA)微量蛋白純化試劑盒購自中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司，96孔 ELISA板購自美國Costar公司，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗人/兔IgG二抗由美國Invitrogen公司生產(chǎn)，TPPA試劑盒產(chǎn)自日本富士瑞必歐株式會社，LZ-ELISA試劑盒(檢測IgG抗體)產(chǎn)自中國珠海麗珠試劑股份有限公司，RPR試劑盒由中國上?？迫A生物工程股份有限公司出品。

1.4 血清標(biāo)本來源

468例臨床血清樣本：梅毒陽性(一期60，二期40，三期60，隱性40，胎傳14)共計214例；梅毒陰性(體檢者40，孕婦46，EB病毒感染20，風(fēng)濕病20，傷寒20，巨細(xì)胞病毒感染12，乙肝26，丙肝10，鉤體病30，萊姆病30)共計254例。其中413份血清樣本來自于南華大學(xué)附屬常德市第一人民醫(yī)院、衡陽市南華大學(xué)附屬第一、第二醫(yī)院2017年3月至2018年3月的部分住院患者；另萊姆病患者血清30份來自中國疾病控制中心，鉤體病血清25份由湖南省疾病預(yù)防控制中心惠贈。以上各期梅毒及其它疾病診斷均按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.5 重組蛋白Tp0470的克隆表達(dá)、純化及鑒定

將重組質(zhì)粒pET32 a(+)-Tp0470轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌E.coliRostta(DE3)，雙酶切及測序鑒定，挑取陽性克隆擴(kuò)增，IPTG(終濃度0.3 mmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，SDS-PAGE電泳分析。去內(nèi)毒素，純化蛋白，Western blot鑒定，測定蛋白濃度，分裝后-80 ℃凍存，用于后續(xù)Tp0470-ELISA的建立和血清樣本檢測。

1.6 Tp0470蛋白的新西蘭兔實驗?zāi)Ｐ图癊LISA建立

3 kg左右新西蘭兔18只，隨機(jī)分為三組：實驗一組兔將背部剃毛處理后進(jìn)行活Tp皮下接種，每只兔背部接種8個皮丘(105IFU/每個位點)，感染期間喂飼無抗生素飼料和飲水。實驗二組用佐劑聯(lián)合高劑量滅活Tp(106IFU/每個位點)同法接種實驗兔，共接種3次(0天，14天，28天)，實驗三組作為未處理對照組。結(jié)合兔背部皮丘部位出現(xiàn)紅腫及血清學(xué)檢測結(jié)果(TPPA及RPR檢測陽性)判定活Tp接種成功。在接種后的8周內(nèi)，三組實驗兔每只每隔一周均耳緣靜脈抽血1mL分離血清備用。

將純化的Tp0470蛋白(2 mg/L)包被到ELISA反應(yīng)板，同時設(shè)非感染依賴性抗原外膜蛋白Tp92(3 mg/L)為對照，加入5%脫脂牛奶，4 ℃孵育過夜，用PBS-T洗板3次，每孔分別加入100 μL各組兔血清(1∶100稀釋)，37 ℃孵育2 h。PBS-T洗板5次，加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000稀釋)，37 ℃反應(yīng)30 min。TMB顯色，20 min后加入終止液。酶標(biāo)儀讀取A450值，每個血清樣本復(fù)測3次。

1.7 臨床樣本的血清學(xué)診斷評價

按上述建立的Tp0470-ELISA方法檢測468份血清樣本(包括梅毒陽性血清、正常人血清、交叉血清)，同時對468份血清分別按照商用檢測試劑盒操作說明進(jìn)行TPPA、珠海麗珠集團(tuán)的ELISA梅毒初篩和RPR檢測。所有血清樣本需復(fù)孔檢測3次。

1.8 梅毒治療前后血清樣本的RPR滴度與Tp0470-ELISA A450值相關(guān)性分析

選取上述200份各期梅毒患者血清樣品(不包括14例胎傳梅毒血清樣本)中的20人份梅毒隨訪患者血清，分析比較Tp0470-ELISA A450值與RPR滴度(分為3個等級：滴度不變，滴度2倍變化，滴度4倍變化)的變化關(guān)系。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS軟件(18.0)對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。感染依賴性抗原的篩選采用重復(fù)測量的方差分析；臨床評價指標(biāo)有靈敏度、特異度、符合率、kappa值及ROC曲線。kappa值≤0.4一致性較差，0.4

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pET32a(+)-Tp0470的鑒定及在E.coli Rostta(DE3)中的表達(dá)

將pET32a(+)-Tp0470重組質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ+XhoⅠ雙酶切分析，目的條帶大小與預(yù)期值一致。pET32a(+)-Tp0470誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白結(jié)果如圖1所示，可見一分子量約57 kDa大小的蛋白條帶。

圖1 重組質(zhì)粒pET-32a(+)-Tp0470轉(zhuǎn)化E.coli Rostta(DE3)表達(dá)結(jié)果BI:誘導(dǎo)前；AI:誘導(dǎo)后；S:上清；FT:穿透；M:Marker；E1,E2,E3,E4,E5,E6：洗脫液

2.2 Tp0470蛋白感染依賴性抗原屬性的鑒定

實驗組在0～8周不同時間點兔血清中特異性Tp0470和Tp92抗體檢測結(jié)果如圖2A、B所示?；頣p接種組兔血清中抗Tp0470水平從感染后第3周起呈急劇上升趨勢，至5周后逐漸趨于平穩(wěn)，而滅活Tp接種組及未接種組抗Tp0470水平一直處于低位且未有升高趨勢。與滅活Tp接種組相比，活Tp接種組血清抗Tp0470水平在3～8周各時間點均有顯著差異(F值分別為114.7、448.5、513.6、528.7、979.4和1688.3，P<0.05)。

圖2 不同兔實驗組不同時間點不同蛋白的抗體水平A450值變化A：不同兔實驗組不同時間點Tp0470的抗體水平A450值變化B：不同兔實驗組不同時間點Tp92的抗體水平A450值變化

活Tp接種組與滅活Tp接種組血清抗Tp92水平從接種后第3周起均呈現(xiàn)上升趨勢，5周后逐漸趨于平穩(wěn)。而在3～8周各時間點兩組間差異并無顯著性(F值分別為0.92、1.48、2.76、2.85、2.97和2.88，P>0.05)。

2.3 Tp0470-ELISA與TPPA、LZ-ELISA及RPR的比較評價

Tp0470-ELISA對214份各期梅毒血清樣本的檢測陽性率如表1所示，其中檢測陰性的有10人份，對應(yīng)患者年齡均大于42歲，且RPR滴度均小于等于1∶4。以TPPA法為金標(biāo)準(zhǔn)，Tp0470-ELISA檢測468份血清的靈敏度、特異度及符合率如表2所示，均較好；ROC曲線下面積達(dá)到0.907(圖3)。

Tp0470-ELISA與LZ-ELISA及上?？迫ARPR試劑盒檢測468份血清結(jié)果比較(表2)，其符合率分別為94.87%，Kappa=0.897；88.67%，Kappa=0.771。均大于0.75，顯示Tp0470-ELISA與這兩種方法結(jié)果一致性好。

表1 基于Tp0470蛋白的ELISA對臨床各期梅毒的診斷陽性率

圖3 Tp0470的ROC曲線圖(以Tp0470-ELISA檢測S/CO為檢測變量，TPPA為陰陽性判斷金標(biāo)準(zhǔn)，做ROC曲線)

表2 Tp0470-ELISA與TPPA、LZ-ELISA及RPR試劑盒的診斷評價比較

2.4 梅毒患者治療前后血清檢測Tp0470-ELISA A450值與RPR滴度變化分析比較

Tp0470-ELISA做20例隨訪病人檢測，記錄其治療前后的ELISA A450值及RPR的滴度變化，通過計算隨訪病人治療前后A450值差值，分析與RPR滴度變化的情況(分為3個等級：滴度不變，滴度2倍變化，滴度4倍變化；圖4)。經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析，Tp0470-ELISA A450值與RPR滴度變化相關(guān)系數(shù)為0.38，P=0.96。

圖4 Tp0470-ELISA A450值與隨訪病人RPR滴度下降的變化圖

3 討 論

如何進(jìn)一步從Tp全菌蛋白中尋找到提高梅毒早期診斷率，或能用于梅毒療效判斷的新靶標(biāo)蛋白一直是當(dāng)前梅毒臨床診斷方法優(yōu)化的突破點之一。體內(nèi)誘生抗原(又稱感染依賴性抗原)篩選技術(shù)的興起[7-8]促進(jìn)了空腸彎曲菌[9]、弓形蟲[10]等病原體的診斷相關(guān)應(yīng)用研究，感染依賴性抗原為這些病原體的診斷提供新靶標(biāo)，這也為梅毒診斷抗原篩選提供了除外膜蛋白外的新思路。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，梅毒螺旋體感染依賴性抗原Tp0971[11]在早期診斷和療效評價具有潛在價值，結(jié)合活Tp接種和滅活Tp接種后兔血清反應(yīng)性的顯著差異，初步證實Tp0470為一種感染依賴性抗原。

本研究基于Tp0470蛋白建立ELISA并檢測了468份臨床各類血清，檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的TPPA確診試驗相比顯示其具有較高的靈敏度(95.32%)和特異度(95.66%)。ROC曲線分析進(jìn)一步提示Tp0470有作為梅毒診斷靶標(biāo)抗原的潛質(zhì)。盡管Tp0470蛋白建立的ELISA在對一期梅毒和隱性梅毒血清樣本的檢測中其陽性檢出率分別只有91.66%和92.50%，表面上看該蛋白似乎不太適用于梅毒早期和潛伏期感染的篩選，但由于本次基于Tp0470蛋白建立的ELISA只檢測了IgG型抗體，且樣本來源地區(qū)相對單一及血清樣本數(shù)少等局限性，尚無法做出Tp0470-ELISA不適用梅毒早期診斷的定論。仔細(xì)分析Tp0470-ELISA檢測結(jié)果為假陰性的10份梅毒陽性血清的基本資料后發(fā)現(xiàn)其對應(yīng)患者年齡均大于42歲，且樣本RPR檢測結(jié)果滴度均小于1∶4，這與前期研究報道的Tp0462蛋白檢測為假陰性梅毒血清樣本(8人份)的特征非常一致。年齡可能是造成這部分患者機(jī)體免疫應(yīng)答損傷進(jìn)而使這類抗原對應(yīng)抗體水平低下的原因之一；也可能是這部分患者本身經(jīng)歷了梅毒感染到治愈的過程，導(dǎo)致了Tp0470蛋白刺激機(jī)體產(chǎn)生的IgG抗體水平逐漸下降，直至轉(zhuǎn)為陰性，但RPR檢測的反應(yīng)素由于血清抵抗而一直保持在低滴度。

對20份隨訪患者治療前后血清的A450值變化與RPR滴度變化分析后，其相關(guān)系數(shù)為0.38，P=0.96，并無顯著統(tǒng)計學(xué)意義，這在某種程度上來說基于Tp0470建立的ELISA似乎尚無法替代RPR或TRUST判斷梅毒治療后的效果。由于抗生素的濫用，梅毒患者不一定在同一醫(yī)院就診等原因，使得隨訪患者的血清相對來說難以收集，導(dǎo)致本研究中隨訪患者的標(biāo)本量偏少，同時由于很多患者并未嚴(yán)格按照醫(yī)囑進(jìn)行規(guī)范化治療和復(fù)查等原因造成收集的血清質(zhì)量參差不齊，因而兩種方法療效判斷是否具有相關(guān)性還有待商榷。后續(xù)研究將收集更多梅毒感染治療后隨訪的各期梅毒患者(從就診到治愈期間)血清標(biāo)本，并采用新西蘭兔模擬感染和治療模型來進(jìn)一步驗證結(jié)果。同時結(jié)合前期篩選評價的Tp膜脂蛋白及感染依賴性抗原的優(yōu)勢表位肽段，合成多聚肽，期望合成的Tp多抗原多聚肽能在梅毒臨床診斷和預(yù)后判斷上發(fā)揮更優(yōu)的作用。

作為菌體抗原研究的新靶標(biāo)，感染依賴性抗原的應(yīng)用并不僅僅局限于診斷，它們特殊的生物學(xué)特性：只在活菌感染宿主以后合成分泌，可能與病原體入侵機(jī)體和其自身新陳代謝密切相關(guān)[10]，研究發(fā)現(xiàn)免疫胸膜炎放線桿菌的感染依賴性抗原后，能有效地抑制該病原體對肺組織的損傷[12-13]。梅毒螺旋體不同于常規(guī)的革蘭氏陰性菌具備典型的毒力因子脂多糖，也無法進(jìn)行長期的體外單獨培養(yǎng)，但其卻能持續(xù)感染機(jī)體并引發(fā)一系列的臨床癥狀。盡管有研究者對梅毒螺旋體進(jìn)行了培養(yǎng)，卻仍需棉尾兔細(xì)胞做載體[14]。多年來，研究者們一直致力于尋找其毒力因子，進(jìn)而突破疫苗[15]和致病機(jī)制研究[16]的困境，但效果并不顯著。感染依賴性抗原或許可以成為疫苗研究的新觸點，同時對感染依賴性抗原進(jìn)行多菌種多表型的同源性比對，篩選出同源和非同源基因，對梅毒螺旋體感染機(jī)體和自身代謝合成的機(jī)制研究都有一定價值。