文/田素香 方 妍 陳 佳

（光明牧業(yè)有限公司；上海奶牛育種中心有限公司）

冷凍精液作為一種特殊的商品，對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量要求愈來(lái)愈高。當(dāng)前評(píng)定種公牛精液品質(zhì)，主要依據(jù)國(guó)標(biāo)《牛冷凍精液的要求》（GB4143-2008）對(duì)采精量、原精活力、精子密度、精子凍后活力、精子畸形率五項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。種公牛由于個(gè)體間存在差異，使以上各項(xiàng)指標(biāo)，尤其是凍后活力出現(xiàn)較大差異。在實(shí)際操作中，發(fā)現(xiàn)有的生產(chǎn)性能良好和外貌優(yōu)秀的公牛，由于精子抗凍性差等原因被淘汰。為提高牛精液的冷凍效果，提高制作冷凍精液的每頭牛各批冷凍精液之間的穩(wěn)定性，在制作冷凍精液的過(guò)程中，需研究冷凍溫度曲線的變化。

1 材料和方法

1.1 精液

采自本站種公牛鮮精。

1.2 稀釋液配制

按量稱(chēng)取所需藥品，加超純水至100 mL，溶解后過(guò)濾，75 ℃消毒30 min，降溫至40 ℃以下。加入新鮮卵黃、滅菌甘油和青、鏈霉素充分混勻后備用。

1.3 分裝方法

操作需在4 ℃冰柜中進(jìn)行，四針頭分裝機(jī)將漏斗中的精液利用負(fù)壓真空的原理通過(guò)軟管和針頭吸入0.25 mL塑料細(xì)管內(nèi)，繼而封口打印，完成分裝。電腦控制的先進(jìn)打印系統(tǒng)同時(shí)打印牛只信息，確保所有凍精的可追溯性。

1.4 平衡

分裝后放入冰箱，在4 ℃中平衡2.5～4.0 h。

1.5 冷凍

將細(xì)管平置于冷凍箱內(nèi)，每架盛放175 支細(xì)管，液氮熏蒸時(shí)間為7 min，然后浸入液氮中冷凍。

1.6 活力檢查

活力0.40以上為合格，畸形率評(píng)定按國(guó)標(biāo)《牛冷凍精液的要求》（GB4143-2008）進(jìn)行。

2 精液冷凍溫度曲線

精液冷凍溫度曲線包括以下幾個(gè)方面。

2.1 始凍溫度

精液冷凍前、冷凍容器中冷凍面的溫度。

2.2 熱平衡溫度

精液和冷凍面接觸后，精液一邊溫度下降一邊放熱，使冷凍面溫度回升，當(dāng)二者溫度一致并在短暫時(shí)間內(nèi)維持不變的溫度。

表1 冷凍精液降溫速率表

2.3 入氮溫度

冷凍細(xì)管精液和冷凍箱體溫度呈同步速度迅速下降，達(dá)-140 ℃以下時(shí)，將細(xì)管凍精迅速投入-196 ℃液氮中長(zhǎng)期保存。

2.4 降溫控制

公牛精液冷凍過(guò)程降溫控制如表1 所示。

3 適宜的冷凍面曲線

冷凍精液的實(shí)質(zhì)是精液與冷源環(huán)境進(jìn)行能量交換的過(guò)程，精液在冷凍過(guò)程中放出一定的能量后，由液相變化到固相。產(chǎn)生相變的原因是精液與其所處環(huán)境之間存在著極大的溫度差（-196～4 ℃）。冷凍過(guò)程中它們各自向相反的方向擴(kuò)散，進(jìn)行能量交換，直到溫度差等于零，達(dá)到能量平衡為止。其能量交換的極限值是熱擴(kuò)散平衡時(shí)的溫度，此時(shí)，精液溫度擴(kuò)散的速度與精液凍結(jié)相變的速度保持一致。

精液的冷凍過(guò)程中，首先是精液溫度的變化，精液由冷凍前的平衡溫度呈直線下降，是一個(gè)散熱過(guò)程，要求快速通過(guò)-60～0 ℃的危險(xiǎn)溫度區(qū)。當(dāng)下降溫度達(dá)到凝固點(diǎn)時(shí)，精液便隨著降溫梯度由液態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)。其次是冷凍面溫度變化，選用鋁板、氟板、銅網(wǎng)作為凍制精液的冷凍面，當(dāng)精液放入后溫度上升到最高點(diǎn)，即為精液下降溫度與冷凍面上升溫度達(dá)到一致，稱(chēng)為熱平衡，冷凍面溫度由上升轉(zhuǎn)為下降，達(dá)到-140 ℃呈曲線變化。制作冷凍精液要求冷凍面快速達(dá)到-110～-80 ℃適宜的熱平衡溫度區(qū)，然后迅速下降到-140 ℃，方可能獲得解凍后精子活力高的優(yōu)質(zhì)精液。

4 精液冷凍工藝所采用的冷凍面溫度曲線

精液冷凍、解凍后活力與凍結(jié)時(shí)間有關(guān)，上海奶牛育種中心有限公司采用法國(guó)卡蘇先進(jìn)的電腦編制程序的冷凍器來(lái)冷凍精液，其凍后精子活力比用液氮蒸氣法冷凍后的精子活力要高，而且精子存活時(shí)間更長(zhǎng)。這是因?yàn)椴僮髡唠y以控制液氮蒸汽法的初始冷凍溫度和液氮水平，同時(shí)冷凍量和冷凍速度也會(huì)影響冷凍溫度。公牛精液（最終甘油濃度5.0%～5.6%）冷凍過(guò)程降溫控制如表1、圖1。

圖1 牛冷凍精液的冷凍面溫度曲線

5 冷凍方法

目前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的牛冷凍精液劑型主要是微型的（0.25 mL）。細(xì)管精液均勻的放置在冷凍架上，放入冷凍容器內(nèi)，以液氮為冷源，通過(guò)液氮熏蒸降溫、冷凍。

如有遇到細(xì)管數(shù)不多的情況，為提高冷凍效果可在下面冷凍架上放置廢棄細(xì)管，避免液氮直接觸碰細(xì)管精液。

6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

每次冷凍后的細(xì)管隨機(jī)抽樣，2010年和2011年的檢測(cè)結(jié)果分別為：平均活力為0.415和0.409；平均畸形率為13.7%和1 4.5%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析凍精解凍后活力、畸形率差異顯著（P＜0.01）（表2、3、4）。

表2 細(xì)管精液產(chǎn)量、平均活力和畸形率情況

表3 種公牛每月平均畸形率 單位：%

表4 種公牛每月平均解凍活力 單位：%

7 討論

增加細(xì)管生產(chǎn)數(shù)量會(huì)影響凍精品質(zhì)，導(dǎo)致畸形率增加。提高凍精質(zhì)量的關(guān)鍵在于合理使用牛只，精心飼養(yǎng)，細(xì)致管理，具體措施如下。

7.1 種公牛日糧調(diào)配相當(dāng)重要，這對(duì)保證種公牛有旺盛的性欲及優(yōu)質(zhì)的精液是必要的。

7.2 90%以上的牛只跛行是由蹄病或趾病造成的，建議舍飼的公牛每年進(jìn)行1～2 次常規(guī)修蹄。

7.3 種公牛要經(jīng)常運(yùn)動(dòng)，可加強(qiáng)肌肉、韌帶及骨骼的健康，保證公牛行動(dòng)活潑、性欲旺盛、精液品質(zhì)優(yōu)良、同時(shí)防止種公牛過(guò)肥。

7.4 嚴(yán)格控制采精頻率，從而保證公牛的射精量和精子活力。

7.5 夏季高溫高熱應(yīng)做好防暑降溫工作，科學(xué)養(yǎng)牛。C