吳如慧 李增平 陳禮浪

摘? 要? 通過對海南種植的木麻黃上發(fā)生的莖腐病病原菌進行致病性測定、形態(tài)學特征鑒定和ITS序列分析，確認引起海南木麻黃莖腐病的病原菌為二孢假芝[Amauroderma subresinosum （Murrill） Corner]。生物學特性測定結果顯示，黑暗可以促進菌絲生長，菌絲最適生長溫度為32 ℃，最適pH為6.0，蔗糖和大豆蛋白胨為最佳碳源和氮源。

關鍵詞? 海南;木麻黃;莖腐病;二孢假芝;生物學特性

中圖分類號? S792.93? ? ? 文獻標識碼? A

木麻黃（Casuarina equisetifolia Forst.）具有速生、喜炎熱氣候，耐干旱、貧瘠，抗鹽漬等功能，因此是海岸前緣的砂質地帶無可替代的防風林樹種[1-2]， 而臺風是海南島最主要的自然災害，因此種植木麻黃對減輕臺風帶來的災害和保護人們生命財產安全十分重要。

作為沿海防護林主要樹種的木麻黃，在生長過程中易遭病原木腐菌的侵害而發(fā)生根腐或莖腐病。特別是常因臺風造成斷桿、斷枝后，更易被病原木腐菌侵染，大量病株整株枯死，造成防護林林相被破壞，削弱其生態(tài)功能。因此保持海岸帶木麻黃防護林的生態(tài)功能，有效防治木麻黃上發(fā)生的病原木腐菌危害，進一步提升木麻黃林的經濟效益，為生產防控提供理論依據，有必要對海南能侵染木麻黃活立木的病原木腐菌進行研究。

筆者在對海南省的?？凇⑽牟?、澄邁、臨高、儋州、東方等地的木麻黃林地進行病害調查時，發(fā)現假芝屬（Amauroderma）的一種木腐菌易侵染木麻黃活立木的莖干引起莖腐病，株發(fā)病率為2%～3%，最終導致發(fā)病植株整株枯死，而關于此病尚未見有報道。假芝屬（Amauroderma）由美國真菌學家William Alphonso Mur rill于1905年建立， 指定模式種為Amauroderma schomburgkii （=Fomes regulicolor）[3]。假芝屬真菌主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國華南和西南的部分地區(qū)分布較多。我國假芝屬的分類學研究始于鄧叔群。1980年以來，前人對我國的假芝屬作了大量的研究工作，報道了產于我國的二孢假芝（A. subresinosum）、廈門假芝（A. amoiense）、耳匙假芝（A. auriscalpium）、華南假芝（A. austrosinense）等22個種[4-6]。但未見有二孢假芝（A. subresinosum）引起活立木莖腐病的報道。因此，本研究從海南省不同市縣的發(fā)病木麻黃林地取樣，明確其病原菌種類及生物學特性，旨在為進一步研究該病害的發(fā)生、流行規(guī)律及綜合防治提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試樣本及接種苗木? 于2015年11月從海南省的?？凇⑽牟?、澄邁、臨高、儋州、東方等地發(fā)病的木麻黃根莖部采集新鮮擔子果樣本分別編號HNCM001～HNCM010，樣品均用保鮮袋包裝后帶回實驗室備用。木麻黃苗由海南大學熱帶農林學院提供。

1.1.2? 培養(yǎng)基? 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基和查彼（Czapek）培養(yǎng)基，具體配制方法參閱方中達《植病研究方法》[7]配制，木屑培養(yǎng)基參考高秀兵等[8]方法配制。

1.1.3? 試劑及儀器? E.Z.N.A.?Fungal DNA Kit，OMEGA Extraction Kit，2×Taq-Mixture，DNA Marker。Olympus BX 51 顯微鏡。

1.2? 方法

1.2.1? 菌株分離純化培養(yǎng)? 采用常規(guī)組織分離法從采集的新鮮擔子果上分離菌株，先用70%酒精對擔子果表面消毒，再用滅菌的手術刀將擔子果邊緣表皮削除，用滅菌的鑷子夾取帶菌管處的菌肉接種到PDA上，28 ℃恒溫培養(yǎng)，從分離純化后獲得的相同菌株中選擇HNCM004，轉入PDA培養(yǎng)基擴繁保存?zhèn)溆肹7]。

1.2.2? 接種體的制備? 從純化后的菌株菌落上挑取邊長約1 cm的正方形菌絲塊放置于已滅菌的袋裝木屑培養(yǎng)基中制備接種體，放置到28 ℃培養(yǎng)箱進行恒溫黑暗培養(yǎng)20 d左右，直至菌絲布滿整個培養(yǎng)基。用接入空白瓊脂塊的木屑培養(yǎng)基作為空白對照。

1.2.3? 菌株的致病性測定及擔子果誘導? 先在待接種植株桉樹、木麻黃、橡膠樹3種苗木的莖干表面噴70%酒精進行表面消毒，再用滅菌手術刀對待接種植株進行輕微創(chuàng)傷，將布滿菌絲的接種體緊緊貼在切口處，并用棉花進行保濕，最后用保鮮膜纏繞固定。每個處理設置3個重復，對照株用同樣的方法接空白木屑培養(yǎng)基。接種后每隔10 d對苗木長勢和侵染情況進行觀察，并進行拍照記錄。接種方法參照高秀兵等[8]方法，略作改動。

挑取純化后的邊長1 cm的含菌株HNCM004菌絲體的正方形培養(yǎng)基塊放置于已滅菌的瓶裝木屑培養(yǎng)基中進行擔子果誘導，放置到室內對其進行保濕，定時觀察。

1.2.4? 病原菌的鑒定? 形態(tài)鑒定：參考《中國真菌志： 第十八卷 靈芝科》[6]和《中國大型真菌》[10]等資料對樣本的子實體進行宏觀特征與顯微結構的描述與鑒定。并在光學顯微鏡下對病原菌的顯微結構觀察、測量并拍照。

分子鑒定：將菌株培養(yǎng)5 d后收集100 mg菌絲體，使用OMEGA Fungal DNA Kit來提取DNA。以通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACC TGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3′）[10]擴增rDNA基因內部轉錄間隔區(qū)序列，引物合成委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。擴增產物在恒壓 150 V下用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用OMEGA Extraction Kit試劑盒對產物進行切膠回收目的片段，純化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序結果在 NCBI 上進行 BLAST 比對分析，并提交序列。利用MEGA 6.0軟件以鄰接法（neighbor- joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹[11]。

1.2.5? 生物學特性測定? 菌株培養(yǎng)4 d后用直徑5 mm 的打孔器對其菌落邊緣打取菌餅，并將菌餅接種各供試培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，4 d后十字交叉法測量菌落直徑。各培養(yǎng)基設置3個重復。除碳、氮源生物學測定外，其他條件所使用的培養(yǎng)基均為PDA培養(yǎng)基。

（1）溫度：將菌餅接種PDA培養(yǎng)基后置于15、20、25、28、30、32、34、36、38、40 ℃共10個不同溫度條件下恒溫黑暗培養(yǎng)。

（2）光照：測定條件設置為完全黑暗、日光燈連續(xù)照射、12 h光暗交替3種條件，28 ℃恒溫培養(yǎng)。

（3）pH：在已滅菌的PDA培養(yǎng)基凝固之前，用 1 mol/L 的HCl 和 1 mol/L 的 NaOH 將pH分別調至2、3、4、5、6、7、8、9共8個梯度，28 ℃恒溫培養(yǎng)。

（4）碳、氮源：將不加蔗糖、硝酸鈉的Czapek培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，分別稱取等質量的葡萄糖、可溶性淀粉、麥芽糖、甘露醇、D-木糖、D-果糖、D-半乳糖、蔗糖、α-乳糖、肌醇、D-山梨醇、甘油作為碳源;酵母浸膏、牛肉膏、大豆蛋白胨、L-天冬酰胺、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈣、草酸銨、硝酸鈉、硝酸鉀作為氮源，以不添加碳、氮源的Czapek培養(yǎng)基作對照，設3組重復接菌餅進行測定。

1.3? 數據處理

利用Excel 2010軟件和SAS 9.1軟件進行數據統(tǒng)計分析，采用Duncans multiple range test進行差異顯著性分析。

2? 結果與分析

2.1? 病害癥狀描述

發(fā)生莖腐病的木麻黃樹冠稀疏，生長不良、枯枝多、無光澤，后期整株枯死，病株易被強風

連根吹倒。在病樹的莖干、近地面的莖基部上長出初期呈紅褐色、后期呈黑褐色檐狀擔子果，病樹莖干木質部組織白腐（圖1）。

2.2? 致病性測定

5個月后檢查接種菌株HNCM004的木麻黃、桉樹和橡膠樹莖基部受侵染情況，結果發(fā)現接種后的木麻黃等樹冠稀疏，生長不良、枯枝多、葉片無光澤，重病株整株枯死（圖2A），在木麻黃等莖干接種處發(fā)現接種部位已經長滿白色菌絲，接種菌已從接種部位侵染入木麻黃莖干木質部并擴展，接種部位周圍莖干組織呈褐色，莖干組織呈現白色腐朽（圖2B，圖2C），與田間發(fā)病癥狀相同，對照組無明顯變化（圖2D，圖2E）。采集發(fā)病組織進行分離獲得相同的菌株，表明分離菌HNCM004為致病菌。用菌株HNCM004在瓶裝木屑培養(yǎng)基上接種一個月后，白色致密菌絲布滿整個培養(yǎng)基，5個月后長出與樹上相同的擔子果（圖2F）。

2.3? 病原菌的鑒定

2.3.1? 形態(tài)觀察? （1）菌落生長特性：該病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落呈白色，菌絲中間較濃密邊緣稀薄，平伏生長，邊緣近圓形（圖3A）。菌絲老化后變?yōu)槿榘咨翜\黃色。

（2）擔子果：擔子果通常一年生，無柄，菌蓋近扇形、半圓形或近圓形，大小（8～22） cm×（13～ 29） cm，厚2.3～4.2 cm，單生或多個連生于近地面1～3 m左右的莖干上或莖基部;新生擔子果上表面紅褐色，長大后上表面變黑褐色，稍有光澤，多數同心環(huán)帶明顯，有顯著放射狀縱紋，近邊緣處紅褐色，邊緣呈黃白色波浪狀;下表面的菌肉淺黃白色或污白色;菌管長0.3～0.9 cm，呈黃色?？酌嫖郯咨?，管口近圓形，每毫米4～6個。干燥的擔子果邊緣向下向內彎曲，中央上凸，呈貝殼狀，質量變輕（圖3B～圖3G）。

（3）顯微結構：皮殼構造似柵欄狀組織，淡黃褐色（圖3 H）。菌絲系統(tǒng)三體型：生殖菌絲透明、薄壁，直徑為2.9～4.1 μm;骨架菌絲近無色或稍帶淡褐色，厚壁到實心，骨架干直徑為3.6～5.1 μm，呈樹狀分支，分支末端形成鞭毛狀無色纏繞菌絲;纏繞菌絲厚壁，有分枝，直徑1.3～2.6 μm（圖3I，圖3J）。擔孢子有大小兩種，大孢子卵圓形或寬橢圓形，雙層壁，外壁透明，平滑，內壁無色到淡黃色，有小刺或小刺不清楚，大小為（11.0～13.8）μm×（8.8～10.2）μm，小孢子橢圓形，單壁，無色，（3.9～5.4）μm×（2.1～3.9）μm（圖3K）。

2.3.2? rDNA-ITS序列比對和發(fā)育樹構建? 測序后獲得HNCM004菌株的rDNA-ITS序列為611 bp，NCBI在線Blastn比對所得ITS序列（NCBI登錄號為MH537850）與NCBI登錄號為LC176784.1、LC176756.1、FJ154778.1等的二孢假芝菌（Amauroderma subresinosum）序列的相似度最高，達100%。將HNCM004菌株ITS序列與GenBank中已有的ITS基因序列進行同源性比較，利用MEGA 6.0軟件構建系統(tǒng)進化樹，分析同源關系。結果顯示，菌株HNCM004與二孢假芝遺傳距離最小，聚為一類，其rDNA-ITS序列與二孢假芝的同源性達100%（圖4）。結合形態(tài)學特征觀察及分子生物學技術鑒定結果，確定HNCM004菌株為二孢假芝菌[Amauroderma subresinosum （Murrill） Corner]。

2.4? 生物學特性

2.4.1? 溫度對二孢假芝菌絲生長的影響? 不同溫度對菌株菌落生長的影響差異顯著。當溫度在20～38 ℃之間，二孢假芝菌株HNCM004菌絲均能生長，適宜生長溫度為25～34 ℃，最適生長溫度為32 ℃，到40 ℃時停止生長（圖5）。

2.4.2? 光照對二孢假芝菌絲生長的影響? 不同光照條件對菌株菌落生長的影響差異顯著。在完全黑暗條件下菌株菌落生長速度最快，菌落邊緣整齊，菌絲呈透明白色毛絮狀，生長均勻，在連續(xù)光照條件下生長最慢，菌絲中部呈乳白色，邊緣透明稀薄（圖6）。

2.4.3? pH對二孢假芝菌絲生長的影響? 不同pH條件對菌株HNCM004菌落生長的影響差異顯著。菌株HNCM004在pH 3～8之間均可生長，pH 6時菌落直徑極顯著高于其他處理，表明最適宜生長pH值為6，pH 3～7與pH 8處理間菌落直徑差異顯著（圖7），表明二孢假芝相較于堿性環(huán)境，更適合在弱酸性至中性環(huán)境中生長。

2.4.4? 碳、氮源對二孢假芝菌絲生長的影響? 供試的13種碳源培養(yǎng)基均能夠顯著促進二孢假芝菌株HNCM004菌絲生長，其中在以甘露醇為碳源的菌落直徑最大，但其菌絲稀薄近透明，長勢較差;其次為蔗糖、葡萄糖、D-木糖和D-半乳不同大寫字母表示0.01水平上差異極顯著，不同小寫字母表示0.05水平上差異顯著。

糖上菌落較大且菌絲較厚，長勢優(yōu)良;在α-乳糖和甘油中菌落直徑最小，且菌落稀薄。表明不同的碳源或者不同種類的同類型碳源對二孢假芝菌絲生長的影響存在一定的差異（表1）。

供試的 12 種氮源培養(yǎng)基對二孢假芝菌株HNCM004菌絲生長的影響存在一定的差異，單一氮源以氯化銨為氮源的菌落長勢最好，草酸銨為氮源的菌落直徑最小。在缺氮元素的培養(yǎng)基中，菌絲稀薄。復合氮源中大豆蛋白胨菌落直徑最大，菌落圓形，致密（表2）。

3? 討論

本課題組目前已在木麻黃活立木根部或莖干上發(fā)現有多種病原木腐菌寄生引起根腐或莖腐病，包括南方靈芝 [Ganoderma austral （Fr.） Pat.]、 褐靈芝[G. brownie （Murrill） Gilb.]、 黎母山靈芝[G. limushanense J.D. Zhao et X.Q. Zhang]、熱帶靈芝[G. tropicum （Jungh.） Bres.]、 上思靈芝（G. shangsiense J. D. Zhao）、 薄蓋靈芝[G. capense （Lloyd） D. A. Reid]、有 害 木 層 孔 菌 [Phellinus noxius （Co rner） Cunningham]，二孢假芝 [A. subresinosum （Murrill） Corner] 也是其中發(fā)現的一種重要的病原木腐菌[12]。該菌在海南的三亞、保亭、儋州等地生長的桉樹、檳榔和非洲楝上也有發(fā)現，初步研究結果顯示也是這幾種植物的致病菌。

筆者在海南的海口、文昌、澄邁、臨高、儋州、東方等地的木麻黃上發(fā)現的引起木麻黃莖腐病的假芝屬木腐菌，經形態(tài)學特征比較并結合分子生物學鑒定分析，確定引起此種莖腐病的病菌為二孢假芝[A. subresinosum （Murrill） Corner]。該病原菌在黑暗條件下易于生長，光照對其生長存在抑制作用;最適pH為6;25～34 ℃為適宜生長的溫度范圍，最適生長溫度為32 ℃;在測定的幾種碳源中，以蔗糖為碳源的菌落長勢最好;在氮源方面，單一氮源以氯化銨為氮源的菌落長勢最好。在復合氮源中，大豆蛋白胨為氮源長勢最好。田間調查中發(fā)現，發(fā)病區(qū)的環(huán)境濕度和光照強弱，會改變木麻黃病株莖基生長出的二孢假芝擔子果的顏色及厚度，濕度高、光照弱，擔子果上表面呈紅褐色，較厚實;濕度低、光照強，擔子果上表面呈黑褐色，較薄。

雖然許多真菌學家都曾從不同角度對假芝屬成員進行過研究[13-14]，但總得說來，目前國內外關于假芝屬的研究資料集中于分類學特性部分[3-6]。目前尚未見對二孢假芝[A. subresinosum （Murrill） Corner]生物學特性以及致病性等內容的研究。本研究填補了這項空白，也為有效防治木麻黃上發(fā)生的病原木腐菌害，進一步提升木麻黃林的經濟效益，為生產防控提供理論依據。

參考文獻

黃桂華， 仲崇祿， 張? 勇. 我國木麻黃科植物遺傳改良研究進展[J]. 廣東林業(yè)科技， 2005， 21（4）： 65-69.

伍恩華， 劉? 強， 王敏英. 海南島北部木麻黃防護林凋落物量及養(yǎng)分歸還動態(tài)[J]. 華南師范大學學報（自然科學版）， 2012， 44（2）： 123-128.

張一帆， 謝意珍， 楊小兵. 假芝功效研究進展[J]. 食用菌， 2018， 40（2）： 1-4.

范? 藜， 劉? 波. 假芝屬一新種[J]. 真菌學報， 1990， 9（3）： 202-205.

趙繼鼎， 張小青. 中國靈芝科真菌資源與分布[J] . 真菌學報， 1992， 11（l）： 55-62.

趙繼鼎， 張小青. 中國真菌志： 第十八卷 靈芝科[M]. 北京： 科學出版社， 2000： 67， 144-183.

方中達. 植病研究方法[M]. 北京： 中國農業(yè)出版社， 1998： 122-127.

高秀兵， 李增平， 李曉娜， 等. 橡膠樹幾種根病的人工接種方法[J]. 熱帶作物學報， 2010， 31（4）： 626-630.

卯曉嵐. 中國大型真菌[M]. 鄭州： 河南科學技術出版社， 2000： 450.

White T J， Bruns T， Lee S， et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]// Innis M A， Gelfand D H， Sninsky J J， et al. PCR protocols： A guide to methods and applications. New York： Academic Press， 1990： 315-322.

Tamura K， Stecher G， Peterson D， et al. MEGA6： molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution， 2013， 30（12）： 2725.

陳禮浪， 李增平， 蘇惠君. 海南木麻黃木腐菌物種多樣性研究[J]. 熱帶作物學報， 2016， 37（10）： 2000-2006.

Jiao C W， Xie Y Z， Yang X L， et al. Anticancer? activity of Amauroderma rude[J]. PLoS One， 2013， 8（6）： 1-13.

吳興亮， 戴玉成， 林尤河. 靈芝科資源及其孢子掃描電鏡觀察研究[J]. 貴州科學， 2005， 23（2）： 33-39.