蘭玉菲+唐麗娜+李秀梅+王慶武

摘 要：采用組織分離的方法從野生側(cè)耳屬菌株（Pleurotu ssp.）子實(shí)體上分離得到菌株XZG-ts，以其基因組為模板擴(kuò)增獲得該菌株的ITS序列，序列分析結(jié)果表明，菌株XZG-ts與GenBank中來(lái)自于澳大利亞、印度和中國(guó)云南的3個(gè)肺形側(cè)耳菌株聚為一簇，組內(nèi)核苷酸一致率為100%，而與側(cè)耳屬其他4個(gè)種的10個(gè)菌株核苷酸一致率為98.10%～99.06%，依此結(jié)果將XZG-ts菌株鑒定為P. pulmonarius。進(jìn)一步研究了不同碳源、氮源、碳氮組合、溫度及pH值對(duì)菌株XZG-ts菌絲生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，最適碳源為果糖，氮源為酵母膏，最佳碳氮源組合為果糖1%、麥芽糖1.0%、酵母膏0.2%、蛋白胨0.3%，最適生長(zhǎng)溫度為25℃，最適pH值為6。

關(guān)鍵詞：側(cè)耳屬菌株；ITS序列分析；生物學(xué)特性；肺形側(cè)耳

中圖分類號(hào)：S646.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）12-0091-04

Abstract A fungi strain， XZG-ts， collected from the Mountain Tai， was isolated by tissue isolation and the internal transcribed spacers （ITS） was amplified by PCR. In the phylogenetic tree constructed with ITS， XZG-ts formed a branch with 3 isolates belonging to Pleurotus pulmonarius from Australian， India and China with the consistent rate of 100% in intra-group nucleotide. While it was only 98.10%～99.06% with other 10 isolates of Pleurotus. Therefore XZG-ts was identified as P. pulmonarius. The effects of carbon source， nitrogen source， carbon-nitrogen combination and pH value on the growth of mycelium were further studied. The results showed the optimum carbon source， nitrogen source， temperature and pH value was fructose， yeast extract， 25℃ and 6， respectively. And the optimum carbon-nitrogen combination was 1% fructose， 1.0% maltose， 0.2% yeast extract， 0.3% peptone.

Keywords Pleurotus sp.； ITS sequence analysis； Biological characteristic； Pleurotus pulmonarius

側(cè)耳屬[Pleurotus （Fr.） P. Kumm.]是與人類關(guān)系密切的重要經(jīng)濟(jì)真菌，世界廣泛存在20 種[1]，對(duì)木質(zhì)纖維素的轉(zhuǎn)化以及環(huán)境修復(fù)作用倍受關(guān)注[2]。近200年來(lái)，側(cè)耳屬描述的分類單元超過(guò)1 000 個(gè)[3]，主要原因是子實(shí)體形態(tài)受環(huán)境條件影響大，按照形態(tài)特征分類導(dǎo)致較多的同物異名或同名異物。我國(guó)側(cè)耳屬真菌野生資源豐富，分布范圍也極其廣泛。本研究從泰山分離獲得一株野生側(cè)耳屬菌株，對(duì)其進(jìn)行鑒定，并研究明確了該菌株菌絲體最適培養(yǎng)條件，為產(chǎn)業(yè)發(fā)展和教學(xué)科研提供了新的種質(zhì)資源，同時(shí)為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

將采自泰山的野生側(cè)耳屬菌株參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行組織分離、純化，標(biāo)為XZG-ts。

1.2 主要試劑

真菌總DNA提取試劑盒（E.Z.N.A. Fungal DNA Kit），購(gòu)自北京全式金公司；PCR所用試劑，均為大連寶生物公司產(chǎn)品；常規(guī)試劑，為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 菌株的分子鑒定

1.3.1 菌絲體制備及DNA提取 將保存的母種切取5 mm2小塊，接種于PDA加富平板培養(yǎng)基中央，25℃黑暗培養(yǎng)5～7 d，待菌絲生長(zhǎng)到接近平板邊緣，刮取菌落邊緣的新鮮菌絲，利用真菌總DNA提取試劑盒提取基因組總DNA。

1.3.2 ITS擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[5]所報(bào)道的用于真菌ITS區(qū)域擴(kuò)增的通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系和程序參照文獻(xiàn)[4]。

1.3.3 序列分析 PCR結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物4 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，將有目的條帶的PCR產(chǎn)物送北京博尚生物公司測(cè)序；將所得DNA序列輸入GenBank進(jìn)行Blast檢索，采用Clustalx1.81、DNASTAR、DNAMAN和MEGA 5軟件對(duì)所得核苷酸序列與GenBank中收錄分離物的相應(yīng)序列進(jìn)行比較和分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.4 培養(yǎng)特性研究

1.4.1 碳源篩選試驗(yàn) 供試碳源分別為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖，試驗(yàn)方法詳見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。

1.4.2 氮源篩選試驗(yàn) 供試氮源分別為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硫酸銨、硝酸銨，試驗(yàn)方法詳見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。

1.4.3 最佳碳氮源濃度組合 選定適宜碳氮源后，采用L9（34）正交表進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)[7]，組合成供試培養(yǎng)基，接入菌齡一致的5 mm2母種塊，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理重復(fù)5次。

1.4.4 溫度試驗(yàn) 于平板邊緣取直徑5 mm的菌塊接種于PDA培養(yǎng)基平板中央，分別置于15、20、25、30、35、40℃條件下倒置暗培養(yǎng)，pH自然，重復(fù)設(shè)置和分析方法詳見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。

1.4.5 pH值試驗(yàn) 用0.1 mol/L HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH值分別為4、5、6、7、8、9，制成平板后接入直徑為5 mm的菌塊，置于25℃恒溫暗培養(yǎng)。重復(fù)設(shè)置和分析方法同文獻(xiàn)[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分子鑒定

2.1.1 ITS序列擴(kuò)增結(jié)果 以提取的真菌總DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度約為600 bp的目的片段。

2.1.2 ITS序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析 PCR產(chǎn)物直接測(cè)序獲得了XZG-ts的序列（GenBank登錄號(hào)為KT725858），其中包括部分18S rDNA、ITS和部分28S rDNA基因序列。進(jìn)行同源性比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明菌株XZG-ts與GenBank中來(lái)自于澳大利亞（CBS100130，EU424311）、印度（ACCC50082，EU424308）和中國(guó)云南（CCMSSC00649，EU424313）的3個(gè)肺形側(cè)耳菌株聚為一簇，組內(nèi)核苷酸一致率為100%，而與側(cè)耳屬其他4個(gè)種的10個(gè)菌株核苷酸一致率為98.10%～99.06%，依此結(jié)果將XZG-ts菌株鑒定為P. pulmonarius。

2.2 培養(yǎng)特性

2.2.1 不同碳源對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 菌株在供試碳源中均能生長(zhǎng)且菌絲長(zhǎng)勢(shì)均濃密健壯，果糖中生長(zhǎng)速度最快，達(dá)0.49 cm/d，其次是麥芽糖，在乳糖中菌絲生長(zhǎng)最慢，僅為0.18 cm/d。在供試碳源中，菌絲生長(zhǎng)的最適碳源為果糖，其次是麥芽糖。

2.2.2 不同氮源對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 在不同供試氮源中菌絲生長(zhǎng)速度差異顯著，在酵母膏中菌絲生長(zhǎng)速度最快，為0.45 cm/d，且菌絲長(zhǎng)勢(shì)濃密健壯；其次是蛋白胨；在硝酸銨中菌絲生長(zhǎng)最慢，僅為0.14 cm/d，菌絲長(zhǎng)勢(shì)稀疏。在供試氮源中，菌絲生長(zhǎng)的最適氮源為酵母膏，其次是蛋白胨。

2.2.3 菌株菌絲生長(zhǎng)適宜碳氮源濃度組合 選用L9（34）正交表進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)（表3），確定碳氮源的最佳濃度組合。表4結(jié)果表明，果糖、麥芽糖、酵母膏、蛋白胨4個(gè)單因子組合的培養(yǎng)基試驗(yàn)中，菌絲生長(zhǎng)速度差異顯著。從直觀上看，組合2培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度最快，為0.57 cm/d，其次是組合4，組合9培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度最慢；各組合培養(yǎng)基上菌絲均長(zhǎng)勢(shì)壯、濃密。極差分析結(jié)果表明，4個(gè)單因子對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響順序?yàn)锳>C>B>D，說(shuō)明果糖對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度影響最大，其次是酵母膏、麥芽糖，酵母膏對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度影響最小。綜合評(píng)價(jià)，菌絲生長(zhǎng)最佳碳氮源組合為A1B2C2D2，即：果糖1%、麥芽糖1.0%、酵母膏0.2%、蛋白胨0.3%。

2.2.4 溫度對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 菌絲生長(zhǎng)受溫度影響明顯，最適溫度為25～30℃，在25℃條件下菌絲日生長(zhǎng)速度最快，為0.35 cm/d，其次是30℃，菌絲在15℃和40℃條件下生長(zhǎng)緩慢，菌絲日生長(zhǎng)速度均低于0.05 cm/d（圖2）。

2.2.5 pH對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 菌絲在pH 4～10的培養(yǎng)基中均可生長(zhǎng)，當(dāng)pH 6時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，菌絲日生長(zhǎng)速度為0.24 cm/d，pH 7次之，菌絲日生長(zhǎng)速度為0.22 cm/d，在pH 6～7范圍內(nèi)菌絲均濃密粗壯。當(dāng)pH>8時(shí)，菌絲生長(zhǎng)緩慢，日生長(zhǎng)速度均低于0.18 cm/d。由此可見(jiàn)，菌株XZG-ts適宜在中性偏酸環(huán)境下生長(zhǎng)，最適pH為6。

3 結(jié)論

肺形側(cè)耳（Pleurotus pulmonarius）隸屬于真菌門(mén)（Eumycota）擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）傘菌目（Agaricals）側(cè)耳科（Pleurotaceae）側(cè)耳屬（Pleurotus）[8]，中文異名秀珍菇、環(huán)柄香菇、袖珍菇、環(huán)柄斗菇、姬平菇和小平菇等，是一種高蛋白、低脂肪的營(yíng)養(yǎng)食品，味道鮮美，具有降低膽固醇、提高免疫力、延年益壽之功效。其適宜生長(zhǎng)的基質(zhì)廣泛[9]，但子實(shí)體形態(tài)受環(huán)境影響較大，因而其分類學(xué)地位難以確定，定名較為頻繁[10]。2009年，黃龍花等對(duì)我國(guó)栽培鳳尾菇及其近緣種10個(gè)菌株的ITS序列應(yīng)用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，目前我國(guó)廣泛栽培的鳳尾菇與肺形側(cè)耳可能是同物異名種，建議訂正其名稱，將其拉丁名統(tǒng)一定為P. pulmonarius[11]。秀珍菇國(guó)內(nèi)最早2000年文獻(xiàn)上使用的學(xué)名為Pleurotus geesteranus[12]。張金霞等根據(jù)栽培生理結(jié)合ITS、RAPD分析表明現(xiàn)在市場(chǎng)上的秀珍菇為P. pulmonarius[13]。謝寶貴等根據(jù)ITS-RFLP及ITS序列，交配親和性研究結(jié)果認(rèn)為秀珍菇定名為P. geesteranus不妥，應(yīng)該是P. pulmonarius[14]。

本研究通過(guò)同源性比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，從分子水平上證明菌株XZG-ts為P.pulmonarius。菌株XZG-ts的最適碳源為果糖，最適氮源為酵母膏，最佳碳氮源組合果糖1%、麥芽糖1.0%、酵母膏0.2%、蛋白胨0.3%，最適生長(zhǎng)溫度為25℃，最適pH為6。

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