常圣鑫 黃素榮 徐世松 楊光穗

摘? 要? 三角梅是一種重要的熱帶和亞熱帶觀賞植物。由于三角梅有性繁殖困難，誘變育種是目前比較可行的育種方式。本研究采用甲基磺酸乙酯（EMS）、疊氮化鈉（NaN3）和平陽霉素（PYM）3種不同類型誘變劑對‘伊娃夫人和‘馬尼拉小姐2個三角梅品種扦插枝進行了化學(xué)誘變。研究發(fā)現(xiàn)‘伊娃夫人和‘馬尼拉小姐20 h EMS半致死劑量分別為0.22%和0.62%。隨EMS濃度增加，2個品種扦插枝發(fā)芽數(shù)和最長分枝長呈下降趨勢，葉綠素和類胡蘿卜素含量逐漸增加;‘伊娃夫人葉片逐漸向暗色調(diào)變化，‘馬尼拉小姐葉片向紅色色調(diào)變化。20 h酸性NaN3處理下，‘伊娃夫人無法存活，‘馬尼拉小姐成活率為82%～92%;隨NaN3濃度升高，‘馬尼拉小姐發(fā)芽數(shù)呈顯著下降趨勢。相比對照，20 h PYM顯著提高了2個三角梅品種扦插枝最大分枝長度，但對扦插枝存活率無顯著影響。中高濃度EMS和PYM處理‘馬尼拉小姐三角梅出現(xiàn)了葉緣缺刻、葉表褶皺和雙葉尖等變異株。

關(guān)鍵詞? 三角梅;甲基磺酸乙酯;疊氮化鈉;平陽霉素中圖分類號? S722.3+5? ? ? 文獻標識碼? A

三角梅別名葉子花、寶巾花、勒杜鵑，為紫茉莉科（Nyctaginacea）三角梅屬（Bougainvillea）植物的統(tǒng)稱，原產(chǎn)南美洲的巴西和秘魯?shù)鹊兀韵碴柲透邷?。三角梅觀賞性狀突出，深受人們的喜愛，已被選為我國海南省省花，深圳市、廈門市、三亞市和屏東市等20多個城市的市花[1]。三角梅具有自交不親和、雜交結(jié)實率低和雜交種雌雄不育或半不育的特點，因此，三角梅的遺傳育種進展緩慢。誘變育種不依賴于有性繁殖，是目前較為理想的三角梅育種方式。輻射誘變在三角梅種質(zhì)創(chuàng)新中應(yīng)用最為廣泛，印度國家植物研究所利用此方法已相繼獲得了‘阿朱那（B. ‘Arjun， 1974）、‘帕德米（B. ‘Pallavi，1987）、‘斑葉洛斯巴諾斯（B. ‘Los Banos Variegata，1987）、‘延瑟（B. ‘Jayanthi，2006）、‘斑葉花仙子（B. ‘Pixie Variegata，2009）和‘阿比希曼尤（B. ‘Abhimanyu，2010）等三角梅品種（印度國家植物研究所Banerji教授提供）。

化學(xué)誘變也是一種常用植物誘變育種方式，此方法利用化學(xué)誘變劑誘發(fā)基因突變或染色體重組，進而引起植株形態(tài)改變。常見化學(xué)誘變劑包括甲基磺酸乙酯（EMS）、疊氮化鈉（NaN3）、平陽霉素（PYM）和秋水仙素等[2]。EMS是烷化劑類誘變劑，主要作用于DNA鳥嘌呤，可直接誘發(fā)DNA結(jié)構(gòu)改變，誘變頻率高、范圍廣[3];NaN3是點突變劑類誘變劑，主要作用于復(fù)制中的DNA，以堿基替換方式影響DNA合成，在酸性條件下誘變效率較高[4];PYM是抗生素類誘變劑，主要抑制細胞DNA合成，誘發(fā)染色體畸變，對人體毒性較低[5]。相比輻射誘變，化學(xué)誘變操作簡便，適用性強。到目前為止，化學(xué)誘變在三角梅育種中的應(yīng)用僅有2篇報道：一個是以疊氮化鈉對一種三角梅品種扦插枝進行的誘變探索[6]，一個是以秋水仙素、氨磺樂靈和疊氮化鈉對三角梅組培苗進行的誘變探索[7]。常見植物誘變劑，如甲基磺酸乙酯和平陽霉素等對三角梅的誘變效果尚不清楚，相同誘變劑對不同品種誘變效果是否一致也有待明確。本研究選用EMS、NaN3和PYM三種不同類型的誘變劑對2種三角梅品種扦插枝進行了化學(xué)誘變，評測不同誘變劑對2種三角梅品種的誘變效果及有效誘變計量，為三角梅化學(xué)誘變育種提供理論支持。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試三角梅品種為‘伊娃夫人（B. glabra ‘Mrs. Eva）和‘馬尼拉小姐（B.? buttiana ‘Miss Manila），采集地點為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所三角梅種質(zhì)圃。取一年生木質(zhì)化枝條，修剪成10 cm左右扦插枝，每個扦插枝留2～4個營養(yǎng)芽。扦插枝生物學(xué)頂端削平面，下端削斜面待用。

1.2? 方法

1.2.1? 化學(xué)誘變劑配制? 用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）和液態(tài)EMS（Nobleryder，北京）配制成濃度分別為0、0.2%、0.4%、0.6%和0.8%（V/V）的EMS處理液，誘變濃度梯度范圍參考文獻[8-10];用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 3.0）和1 mol/L NaN3（Solarbio，北京）配制濃度分別為0、2、4、6、8、10 mmol/L的NaN3處理液，誘變濃度梯度范圍參考文獻[6];用蒸餾水溶解82.4% PYM（太河制藥，天津）配制成濃度為0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%（w/V）的PYM處理液，誘變濃度梯度范圍參考文獻[11-12]。

1.2.2? 扦插枝誘變? 將準備好的扦插枝浸入上述不同濃度誘變劑處理液中，每個處理50個扦插枝，置于黑暗條件浸泡20 h，處理溫度為25～30 ℃。浸泡后的材料用流水沖洗30 min，隨機扦插入拱棚苗床中。苗床基質(zhì)為珍珠巖∶椰糠（1∶1），溫度范圍為22～26 ℃，濕度在70%以上。31 d后，統(tǒng)計存活率（發(fā)芽且生根）;測定形態(tài)指標，每個處理測定3～6株重復(fù)（處理最低發(fā)芽3株）。

1.2.3? 色差測定? 使用ND110色差儀（Nippon Denshoku， Japan）測定不同處理植株倒數(shù)第四片葉（倒四葉）色差。先在黑色色板上調(diào)零，再在白色色板上進行白校準，將葉片置于白色擋板，避開葉脈區(qū)域，測定Lab值。L表示顏色亮度，取值0（黑色）～100（白色）;a表示紅綠色素，取值-100（偏綠）～+100（偏紅色），變化趨勢為綠→灰→紅;b表示黃藍色度，取值范圍-100（偏藍色）～+100（偏黃色），變化趨勢為藍→灰→黃。每個處理4次重復(fù)。

1.2.4? 光合色素含量測定? 采集處理植株倒四葉（對于芽尖未伸展的處理，直接采集芽點）。剪取0.2～1.0 g鮮樣，液氮固化，以3rd TGrinder磨樣器（TIANGEN Biotech CO. LTD，Beijing）磨碎，加入8 mL 96%乙醇，斡旋混勻，室溫暗處靜置2 h。斡旋后，1 2000×g，離心10 min。使用U-2910 UV/VIS分光光度計（Hitachi，Japan）測定上清液在470.0、648.6、664.2 nm的吸光度。以96%乙醇稀釋上清液，確保吸光值在0.2～0.8。每個處理3次重復(fù)。

葉綠素和類胡蘿卜素含量測定參照公式[

式中，單位都為mg/g （FW）。A表示吸光度，L表示終體積，DF表示稀釋系數(shù)，F(xiàn)W表示鮮重。

甜菜素測定參照公式[14]：

式中，BC單位mg/g。A表示吸光度，MW表示摩爾質(zhì)量，DF表示稀釋系數(shù)，表示摩爾消光系數(shù)，L表示比色皿光路長度（1 cm），F(xiàn)W表示鮮重。甜菜紅素MW和分別為550 gmol/L和60 000 L/（mol×cm），測定波長為538 nm。

扦插枝半致死量（LD50）的計算：以不同誘變劑濃度x為自變量，不同濃度下的成活率y為因變量，在Excel 2016軟件中進行線性方程（y= ax +b）擬合;依據(jù)方程LD50=（0.5-b）/a計算半致死計量。使用R 3.4.3軟件進行測量值重復(fù)的單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan多重比較檢驗（p<0.05）。

2.1? 三角梅扦插枝EMS誘變效應(yīng)

在‘伊娃夫人扦插枝中，除0.4% EMS處理，其他EMS處理發(fā)芽率均顯著低于對照，0.8% EMS處理發(fā)芽率最低;EMS處理最長分枝長均顯著低于對照，0.6%和0.8% EMS處理最長分枝長最低。在‘馬尼拉小姐扦插枝中，隨著EMS濃度的增加，發(fā)芽率和最長分枝長均呈顯著下降趨勢（圖3）。空白對照條件下，‘伊娃夫人發(fā)芽數(shù)大于‘馬尼拉小姐，隨著EMS濃度增加，‘伊娃夫人發(fā)芽數(shù)逐漸低于‘馬尼拉小姐，說明‘伊娃夫人發(fā)芽數(shù)對EMS的耐受性較弱。空白對照條件下，‘伊娃夫人最長分枝長小于‘馬尼拉小姐，在EMS的作用下，其最長分枝長依舊小于‘馬尼拉小姐。

2.1.2? EMS劑量對三角梅葉片色差和色素含量的影響? 隨著EMS濃度增加，‘伊娃夫人葉片明度參數(shù)L值和色相參數(shù)b值逐漸降低，色相參數(shù)a值逐漸升高;0.6% EMS濃度處理下，L值相較對照降低34.8%，b值降低63.5%，a值升高45.5%（圖5A）。這表明EMS處理使‘伊娃夫人葉片逐漸向暗色調(diào)、灰綠色調(diào)和灰黃色調(diào)變化。隨著EMS濃度增加，葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著增加，葉綠素a/葉綠素b沒有顯著變化，0.6% EMS濃度處理下，葉綠素含量相較對照增加57.6%，類胡蘿卜素含量提高32.9%（圖5B）。空白對照及EMS處理‘伊娃夫人葉片McIlvaine提取液在甜菜紅素和甜菜黃素最高吸光波長附近（538 nm和478 nm）都無顯著吸收峰（圖6），表明‘伊娃夫人葉片不含或只含微量甜菜堿類色素。因此，葉綠素和類胡蘿卜素含量變化是誘發(fā)EMS處理‘伊娃夫人葉片色調(diào)變化的主要因素。

隨EMS濃度增加，‘馬尼拉小姐葉片明度參數(shù)L值和色相參數(shù)b值呈先升后降趨勢，色相參數(shù)a值逐漸升高，從-24.6（對照）增加到15.2（0.8% EMS），升高1.62倍，這表明‘馬尼拉小姐葉片色調(diào)向紅色、先深黃后灰黃、以及先明后暗的色調(diào)變化（圖5C）?！R尼拉小姐葉片光合色素變化趨勢和‘伊娃夫人相似（圖5D），不過，0.4%、0.6%和0.8%濃度EMS處理葉片McIlvaine提取液在甜菜紅素吸光值538 nm處檢測到吸收峰（圖6），其經(jīng)公式計算濃度分別達到（0.037±0.04）、（0.065±0.11）、（0.083±0.12） mg/g。因此，‘馬尼拉小姐葉片色調(diào)的變化受到了光合色素和甜菜紅素含量變化的共同影響。

A：EMS處理‘伊娃夫人葉片形態(tài)變異，左側(cè)為未經(jīng)EMS處理的扦插枝，右側(cè)為EMS處理扦插枝;B：EMS處理‘馬尼拉小姐開花變異，左側(cè)為未經(jīng)EMS處理的扦插枝，右側(cè)表示EMS處理的扦插枝;C，D：EMS處理‘馬尼拉小姐葉形變異;E，F(xiàn)：PYM處理‘馬尼拉小姐葉形變異。

2.2? 三角梅扦插枝NaN3誘變效應(yīng)

在NaN3濃度梯度下，‘伊娃夫人扦插枝僅在2 mmol/L處理有3株發(fā)芽，且芽點很小。有趣的是，pH 3磷酸氫鉀緩沖液空白對照也僅有3株發(fā)芽枝，這表明‘伊娃夫人對酸性條件敏感，扦插無法成活。在pH 3磷酸氫鉀緩沖液空白對照條件下，‘馬尼拉小姐三角梅成活率為80%，表明‘馬尼拉小姐對酸性環(huán)境耐受性較高。在不同NaN3濃度下，‘馬尼拉小姐成活率達到82%～92%，且變化不呈線性規(guī)律（圖7A），表明2～10 mmol/L濃度范圍內(nèi)，NaN3對‘馬尼拉小姐成活率沒有顯著影響。隨NaN3濃度升高，‘馬尼拉小姐發(fā)芽數(shù)呈顯著下降趨勢（圖7B，圖7C），但最長分枝數(shù)沒有顯著變化（數(shù)據(jù)不再展示）。此外，pH 3磷酸氫鉀緩沖液空白對照條件下，‘馬尼拉小姐三角梅葉綠素含量達到（2.31± 0.40） mg/g，類胡蘿卜素含量達到（0.45±0.30） mg/g，甜菜素含量達到（0.028±0.006） mg/g，相較EMS空白都有顯著提升;NaN3濃度梯度處理下，這些參數(shù)變化相較對照差異不顯著（數(shù)據(jù)不再展示）。同時，NaN3處理下未發(fā)現(xiàn)葉形變異植株。

曲線最大吸光值均一化處理為1。甜菜紅素標樣（CAS number： 7659-95-2， TCI， Japan）McIlvaine溶液用于甜菜紅素曲線測定，最大吸收峰為530 nm;‘加州黃金McIlvaine提取液用于甜菜黃素曲線測定，最大吸收峰在478 nm附近[14]?！R尼拉小姐花苞片和紅色葉片都為單峰，在538 nm附近，且在478 nm附近沒有顯著吸收峰，因此，認定為含有甜菜紅素?！R尼拉小姐綠色葉片及‘伊娃夫人葉片無顯著吸收峰，不進行甜菜素計算。

2.3? 三角梅扦插枝PYM誘變效應(yīng)

不同濃度PYM對‘伊娃夫人和‘馬尼拉小姐扦插枝存活率均無顯著影響。隨PYM濃度增加，2個品種發(fā)芽數(shù)也無顯著變化，但是PYM處理扦插枝的最大分枝長均顯著高于對照（圖8C）。PYM處理‘伊娃夫人和‘馬尼拉小姐扦插枝其他生理參數(shù)相較對照也無顯著變化（數(shù)據(jù)不再展示）。不過，在0.6%～1.0%濃度PYM下，‘馬尼拉小姐扦插枝均出現(xiàn)了10%左右的葉形變異株，主要表現(xiàn)為葉表褶皺和雙葉尖變異（圖4E，圖4F）。

3? 討論

3.1? 不同化學(xué)誘變劑誘變效果差異顯著

EMS導(dǎo)致三角梅植株存活率下降，葉色變深，枝長變短，光合色素和甜菜素類色素含量增加，開花提前。張蒙蒙[8]對枇杷潛伏芽的EMS誘變研究發(fā)現(xiàn)隨EMS濃度增加，枇杷潛伏芽萌發(fā)數(shù)逐漸降低，羅麗[9]對大紅甜橙組培苗EMS誘變研究發(fā)現(xiàn)隨EMS濃度增加，大紅甜橙再生率逐漸降低，祁偉[10]對紅掌組培苗EMS誘變研究發(fā)現(xiàn)紅掌愈傷組織的褐化率隨EMS濃度增加和處理時間延長呈上升趨勢。這些研究表明EMS對植物生長都有較強的抑制作用。在紅掌EMS誘變研究中，24 h EMS半致死計量為0.35%[10];在菊花EMS誘變中，8～10 h的0.8%～1.0% EMS處理為最佳誘變處理[15];甜橙研究中，2 h EMS半致死計量為1.8%[9];本研究中，20 h EMS處理2種三角梅半致死計量為0.22%和0.62%。這表明EMS最適誘變濃度范圍在植物物種間一般在2%以下。

酸性NaN3使‘伊娃夫人扦插枝衰亡，但對‘馬尼拉小姐三角梅扦插枝存活率沒有顯著影響，只是導(dǎo)致分枝數(shù)減少，光合色素和甜菜素類色素含量增加。陳庭等[6]利用NaN3對一種光葉三角梅扦插枝進行了化學(xué)誘變，發(fā)現(xiàn)誘變劑計量與成活率呈顯著負相關(guān)，半致死計量為5.03 mmol/L。這表明酸性NaN3對不同品種三角梅的誘變效果不穩(wěn)定。pH 3是NaN3最適誘變pH，但這樣的酸度不適于多數(shù)植物生長，因此，NaN3誘變需以植株耐酸檢測為前提。

通常認為PYM能抑制動植物細胞生長。王紅等[11]發(fā)現(xiàn)PYM對葉片和莖段愈傷組織的誘導(dǎo)和分化有顯著抑制作用，最適誘變濃度為2～4 mg/L，陳宇[12]發(fā)現(xiàn)PYM能抑制尾巨桉組培叢生苗生長，半致死濃度為23.7 mg/L。本研究發(fā)現(xiàn)PYM具有促進三角梅扦插枝生長的作用（至少在一定濃度范圍內(nèi)），同時也能誘發(fā)植株葉片變異。張瑞成等[2]也認為PYM不會對突變?nèi)后w產(chǎn)生損傷。在本研究中，PYM葉形誘變效率與EMS相近，更高濃度是否能增強誘變效果，需要進一步測試。

3.2? 遺傳變異性狀與生理性狀的判定

強誘變劑EMS和NaN3都能使三角梅扦插枝發(fā)生劇烈的表型和生理變化，比如葉色變深，光合色素、甜菜素類色素含量增加，分枝數(shù)變化，開花提前等，這些變化多隨誘變劑濃度增大而愈

A： 不同NaN3劑量下扦插枝的成活率;B：不同NaN3劑量下‘馬尼拉小姐扦插枝的發(fā)芽數(shù);C：不同NaN3劑量下‘馬尼拉小姐扦插枝的生長。不同小寫字母表示處理間差異顯著（p<0.05）。

A：不同PYM劑量下‘伊娃夫人扦插枝的生長;B：不同PYM劑量下‘馬尼拉小姐扦插枝的生長;C：不同PYM劑量下扦插枝的最大分枝長。不同小寫字母表示處理間差異顯著（p<0.05）。

發(fā)顯著。這些表現(xiàn)與植物逆境脅迫應(yīng)答的早期表現(xiàn)類似，比如在干旱脅迫初期，菊花葉色變深、葉綠素含量增加[16];紫外光脅迫下，植物葉片生長受抑制[17];鹽脅迫下，鹽地堿蓬葉片甜菜紅素和類胡蘿卜素顯著升高[18];干旱脅迫下，柚子、檸檬等提前開花[19]。

實際上，EMS和NaN3除了會對植物遺傳物質(zhì)造成傷害，也會影響植物細胞的正?；盍ΑMS會與植物解毒物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生一種有毒化合物，從而對植物產(chǎn)生損傷[2];NaN3需要在較高的酸性條件下才能發(fā)揮正常的誘變效應(yīng)，而中強酸對大多數(shù)植物都是脅迫條件。因此，這2種誘變劑誘發(fā)的植物形態(tài)變化，不能排除生理性反應(yīng)的可能。那么如何確定哪些形態(tài)變化屬于生理性反應(yīng)，哪些是可以穩(wěn)定遺傳的呢？一般而言，葉片構(gòu)型的變化源于遺傳物質(zhì)的改變，比如Jaw-D、Strip-D或Mir164a-4基因?qū)е聰M南芥葉緣缺刻[20]，clf-18/clf-18基因?qū)е聰M南芥葉片內(nèi)曲[21]，as1基因?qū)е聰M南芥不對稱葉變異[22]，cu基因?qū)е旅藁ū瓲钊~葉變異，rlrl基因?qū)е旅藁ㄈ~片圓形變異[23]。目前，尚未見生理因素直接誘發(fā)葉形變異的報道。植株生長、開花及色素合成過程等不僅受環(huán)境因素影響，也受植物遺傳物質(zhì)作用。比如IAA16基因突變導(dǎo)致擬南芥植株生長及開花遲緩[24]，OsCESA9基因突變導(dǎo)致細胞壁缺陷，抑制植株生長[25]，YGL2基因變異導(dǎo)致水稻葉綠合成通路受阻，葉片黃化[26]，CYP76AD3：dTmj1基因?qū)е伦宪岳蚧ò晏鸩思t素和甜菜黃素空間分布變異[27]。為了判定哪些變異是由于遺傳物質(zhì)變化引起的，可通過當(dāng)代長期觀察，子代觀察等方法檢測。在本研究中，通過對誘變處理半年期觀察，發(fā)現(xiàn)葉形變異在葉片整個生長發(fā)育階段都能穩(wěn)定維持，小葉片和深綠葉發(fā)生早衰凋落，早花扦插枝在一季花期后轉(zhuǎn)入營養(yǎng)生長階段。由于化學(xué)誘變通常是點突變，形成的突變體多為嵌合體，為了避免變異部分脫落造成的材料缺失，也為了對變異特性的子代檢測，還需利用組織培養(yǎng)方式對變異組織進行分離擴繁和土壤轉(zhuǎn)植種植，通過長年觀察進一步檢測葉片變異及早花特性的穩(wěn)定性。

3.3? 化學(xué)誘變適于三角梅誘變育種

物理誘變是三角梅誘變育種領(lǐng)域長期采用的誘變方式。Gupta等[28]首次采用γ射線對三角梅扦插枝進行輻射誘變，發(fā)現(xiàn)γ射線顯著降低了三角梅成活率，并誘發(fā)三角梅葉形變異，但不同計量射線對三角梅影響的差異不顯著。陳庭等[29]發(fā)現(xiàn)在一定劑量范圍內(nèi)，輻射劑量與植株存活率呈負相關(guān)，與變異率呈正相關(guān)，進而計算了不同品種的半致死劑量，同時獲得了葉卷曲、葉殘缺、黃化葉等變異植株。孫麗娜等[30]發(fā)現(xiàn)低輻射劑量能促進三角梅枝條生長，中高輻射劑量對三角梅的抑制作用顯著，同時發(fā)現(xiàn)少量芽變和葉變植株。Kishan等[31]研究發(fā)現(xiàn)隨著輻射劑量的增加，植株成活率、成活株株高等生長指標逐步降低，同時發(fā)現(xiàn)了葉形變異植株。印度還通過物理誘變獲得了大量的三角梅花型花色突變體[32]。

化學(xué)誘變在三角梅領(lǐng)域采用較少，本研究發(fā)現(xiàn)EMS和NaN3會產(chǎn)生與輻射誘變相似的生長抑制劑量效應(yīng)，也出現(xiàn)了葉片變異等現(xiàn)象，而PYM可以在不對扦插枝產(chǎn)生生理性傷害的同時誘導(dǎo)突變。范芳綺[7]利用秋水仙素、氨磺樂靈、NaN3對5個三角梅品種組培苗進行了化學(xué)誘變，發(fā)現(xiàn)不同三角梅品種對化學(xué)誘變劑的反應(yīng)差異顯著，組培苗的成活率和發(fā)芽率隨誘變劑處理時間和濃度的增加而降低，研究還獲得了多株三角梅嵌合體，既包括花變異株，也包括葉變異株。陳庭等[6]利用NaN3對三角梅扦插枝進行了化學(xué)誘變，發(fā)現(xiàn)誘變劑劑量與成活率呈顯著負相關(guān)，并分析了變異群體過氧化物同功酶的多態(tài)性。這些研究都表明化學(xué)誘變效果與輻射誘變效果相近，適用于三角梅誘變育種。在誘變實施過程中，為提高后代變異發(fā)生率，豐富變異類型，還可采用物理射線和化學(xué)誘變劑疊加施用，不同類型化學(xué)誘變劑疊加施用的策略[33]。

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