趙 騫，吳 瑩，譚 銳

（西南交通大學生命科學與工程學院，四川 成都 610031）

腦缺血致死、致殘的重要原因是腦缺血造成的血管損傷和缺氧。藏藥在治療腦缺血方面的作用近年來逐漸被重視和發(fā)掘。謝彬等[1]報道，藏藥二十五味珍珠丸、如意珍寶丸、十五味沉香丸（簡稱“3個藏藥”）可顯著降低腦缺血模型大鼠腦梗死面積，對腦部組織產生保護作用。但藏藥藥味較多，組方復雜，“3個藏藥”共含有60余種藥材，其中主要含有化合物種類包括三萜酸類、酚酸類、黃酮類、生物堿類，還含有揮發(fā)油、氨基酸及礦物質[2-4]。每味藥材都是1個小復方，如何從眾多主要成分中尋找針對不同藥效的有效成分，成了一個需要解決的問題。血管內皮生長因子（VEGF）是一種特異性的促有絲分裂原，又稱為促血管生成素、血管滲透因子，是影響血管發(fā)育的關鍵因子[5]，作為血管生成的調控者和血管滲透劑，與缺血后腦部循環(huán)系統(tǒng)的重建有關[6]。本研究中首先用含有VEGF啟動子的質粒轉染HEK-293細胞，構建了可用來篩選藥物對這VEGF基因作用效果的細胞模型，并驗證其有效性；然后用該細胞模型檢測“3個藏藥”中的17種主要成分，尋找哪些化合物可有效提高VEGF的轉錄水平，探討了“3個藏藥”治療腦缺血的物質基礎，從經典驗方入手，為藏藥有效成分、藥理作用的研究了提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1．1 材料、試劑和儀器

材料：人胚腎上皮細胞HEK-293株，含有VEGF基因啟動子的重組質粒，均由四川大學生物醫(yī)學材料工程研究中心提供；“3個藏藥”所含有的17個化合物由西南交通大學醫(yī)學院制備。

試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone公司）；胎牛血清（FBS）、雙抗生素（100×penicillin-streptomycin）、Opti-MEM均由Gibco公司提供；磷酸緩沖液（PBS，成都哈里生物公司）；細胞培養(yǎng)板（Corning公司）；細胞培養(yǎng)皿（Thermo公司）；LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；G418（Amresco公司）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司），細胞增殖-毒性檢測試劑盒（東仁化學＜上海＞公司）；熒光素酶檢測試劑盒（Promega公司）；蛋白質濃度測定試劑盒（Thermo公司）。

儀器：MACO-15AC型二氧化碳培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；SW-CJ-2N型超凈工作臺（哈爾濱東聯(lián)公司）；DSX-280A型滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；Centrifuge 5424／5415R型 離 心 機（Eppendorf）；XW-80A型渦旋儀（上海青浦滬西儀器廠）；DMIL型顯微鏡、DMI 4000B型顯微鏡均由Leica公司提供；Varioskan?Flash酶標儀（Thermo Scientific）。

1．2 方法

HEK-293細胞培養(yǎng)條件：使用DMEM高糖培養(yǎng)基，按體積加入10%胎牛血清和1%雙抗生素，37℃，5%CO2，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每36～48 h傳代1次，取對數(shù)生長期的細胞備用。

細胞模型的構建和驗證：將對數(shù)生長期、長勢良好的HEK-293細胞接種到24孔板中，培養(yǎng)至細胞融合度達90%。使用熒光素酶活性分析系統(tǒng)，將含有VEGF啟動子和Luc報告基因的pVEGF promoter-Luc質粒對HEK-293細胞進行轉染。使用陽性藥物脂多糖（存在于革蘭陰性菌細胞壁上，可啟動VEGF轉錄[7]）刺激轉染質粒的HEK-293細胞（簡稱VEGF-293）和未轉染質粒的HEK-293細胞，按Promega公司報告系統(tǒng)的標準操作方案檢測熒光素酶的活性，以驗證細胞模型的有效性。

待測化合物的處理：選取的17個化合物見表1?；衔锞褂肈MSO溶解為50 mmol／L的母液，于-20℃冰箱保存。根據(jù)需要，用DMSO稀釋成不同濃度的待測液，備用。

表1 17種待測化合物信息

細胞毒性檢測：每種化合物設置100，50，25，10μmol／L 4個濃度梯度。取對數(shù)生長期的VEGF-293細胞，以5×104的密度接種到96孔板中進行培養(yǎng)。24 h后，換成含有不同濃度藥物的培養(yǎng)基處理細胞，設立DMSO（終體積0．1%）對照組和空白調零組，每組平行3個。培養(yǎng)24 h后，以CCK-8試劑盒檢測，酶標儀測定吸光度，計算細胞存活率。以細胞存活率90%以上為安全濃度。

相對存活率=（A加藥-A空白）／（A對照-A空白）×100%

熒光素酶分析：根據(jù)不同藥物的安全濃度，采用1．2．4項方法處理細胞24 h。設計DMSO（終體積0．1%）對照組，每組平行3個。分別使用熒光素酶檢測試劑盒檢測總熒光素酶活性，BCA蛋白質測定試劑盒檢測蛋白質總濃度。計算單位熒光素酶活性，并和對照組比較，得相對單位熒光素酶活性。

相對單位熒光素酶活性=（實驗組熒光素酶活性／實驗組蛋白質濃度）／（對照組熒光素酶活性／對照組蛋白質濃度）×100%。

1．3 統(tǒng)計學處理

同組數(shù)據(jù)采用方差分析。

2 結果

2．1 穩(wěn)定細胞株的建立

質粒轉染HEK-293細胞后，經G418培養(yǎng)基篩選25 d，可得穩(wěn)定傳代的細胞株。由圖1可見，單克隆在逐漸增大。經轉染重組后的細胞比普通的HEK-293細胞更脆弱，因此培養(yǎng)期間需要頻繁觀察生長狀況，并及時更換新鮮培養(yǎng)基。第25天，細胞生長狀態(tài)已趨于穩(wěn)定，可用于凍存及擴大培養(yǎng)。

圖1 轉染質粒后不同天數(shù)的HEK-293細胞株（明場，×200）

轉染后的細胞模型和未轉染質粒的HEK-293細胞分別用陽性藥物脂多糖處理，檢測其熒光素酶強度。陽性藥物組的熒光素酶活性為36．71±6．38，是空白組熒光素酶活性0．28±0．03的100倍以上（比值為131±27．73），表明該細胞模型可有效刺激相應具有生理活性的藥物，證明該細胞模型可用于藥物的篩選。

2．2 17個藥物單體對細胞模型的抑制率

細胞毒性試驗結果見圖2。其中1～15號單體在100μmol／L濃度下，VEGF-293細胞的存活率均大于90%，表明在此濃度下安全。而16號和17號單體對VEGF-293細胞的存活率低于90%，說明毒性較大，其安全濃度均低于10μmol／L。故熒光素酶試驗對1～15號單體均采用100μmol／L作為篩選濃度，對于16號和17號單體均采用10μmol／L作為篩選濃度。

圖2 100μmol／L濃度下不同單體對VEGF-293細胞增殖率的影響

2．3 17種單體對于VEGF基因啟動子的激活效果

結果見圖3和表2。由圖3可知，2，4，5，6，9，12號化合物對VEGF啟動子的激活率超過150%，篩選結果呈陽性。其中，2，6，12的激活作用是陰性對照組的20倍以上。提示“3個藏藥”在給藥過程中，發(fā)揮的血管保護和再生作用可能主要和2，6，12號化合物有關。

圖3 17個單體成分對VEGF基因啟動子的作用

表2 各中藥單體對基因轉錄活性的影響

阿魏酸、川芎嗪和芒果苷系“3個藏藥”方中激活VEGF基因啟動子作用有效的單體化合物，是其經典方中抗腦缺血的物質基礎。阿魏酸具有抗氧化、抗血栓和調血脂的作用，臨床應用富含阿魏酸的當歸、升麻等常用于血管性疾??；川芎嗪具有改善微循環(huán)、降低外周阻力、擴張血管等藥理作用，均與VEGF基因的激活相關。芒果苷有潛在開發(fā)為血管類新藥的可能。

3 討論

藏醫(yī)藥學在約2 300年前發(fā)源于干旱、缺氧的青藏高原，在缺血、缺氧疾病方面有獨到的臨床經驗。藏醫(yī)學中，腦缺血被稱為“白脈病”，治療的主要內服方劑有二十五味珍珠丸、如意珍寶丸、十五味沉香丸、十三味鵬鳥丸等[1，8]。現(xiàn)代藥理學的研究已證實，藏藥在治療腦缺血方面有顯著療效，但藏藥處方龐大，成分復雜，如何確定龐雜藥材成分中的微量有效成分，本研究中提出擬借助分子生物學手段建立一種準確、快速的方法，可作為新藥篩選的工具，也為藏藥的物質基礎研究提供了良好的手段。VEGF的調控范圍不僅和腦缺血后的損傷恢復有關，也對應了“3個藏藥”的治療范圍。因此以此作為靶基因來尋找復雜中藥體系中的有效成分，不但可用于藥效和成分的研究，還可為臨床定向治療提供幫助。

本研究中構建了腦缺血相關基因的藥物篩選模型，并通過陽性藥物驗證了其有效性。且用該模型對“3個藏藥”中含有的主要成分進行篩選，找到了其中VEGF基因啟動子激活作用最有效的幾種化學成分。該結果既為藏藥的藥理作用、信號通路等的進一步深入研究提示了方向，又為藏藥質量標準控制提供了參考。此外，現(xiàn)有體外細胞篩選模型多以受體的結合位點或轉錄因子等作為研究對象。這種以單一靶點的模型只能得到針對某一個單獨位點的有效物質。而本研究中采用能否激活基因啟動子的序列作為篩選條件，基因的啟動子序列中往往含有多個不同的轉錄因子結合位點，因此本研究的篩選模型可篩出能作用于目標基因表達的一大類物質，不僅可保證該基因作用的特異性，也能大大地擴展篩選范圍。

本研究關于藏藥藥效的探索只停留在某種化合物可激活啟動子的層面上，尚不夠深入。首先，VEGF受到許多因子的調控[9]，待測藥物通過哪一個結合位點，或是怎樣的途徑來激活啟動子，仍需要對機制做更詳細地研究；其次，VEGF有種類繁多的靶基因，不僅具有促進血管再生的功能，也能通過影響其他因子來控制神經再生、缺氧應答等[10-11]。本研究中僅能得知該化合物可激活該基因的啟動子，其具體的藥效還有待進一步研究。本研究中雖然證明了該化合物能激活啟動子，但無法得知該基因mRNA的量有無上升，以及能否進一步體現(xiàn)在蛋白質表達層面上。因此，本研究中只是為中藥復雜體系的有效物質尋找提供一個初篩的手段，仍有許多改進完善和進一步研究的空間。