孫 潔, 包靜瑤, 陳浩祎, 陳皓南, 崔博翔, 王歡歡

0 引言

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)屬于炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)的一種, 是一種免疫系統(tǒng)攻擊自身消化系統(tǒng)的疾病, 屬于自身免疫性疾病. 臨床上常見的IBD除UC外還包括克羅恩病(Crohn’s disease, CD)[1]. UC由環(huán)境、遺傳、感染和免疫多因素相互作用所致[2-4], 可造成腹痛、嘔吐、腹瀉、直腸出血、肌肉痙攣、體重下降等明顯癥狀. 除此外, 通常還伴隨許多并發(fā)癥, 其中最重要的腸道外并發(fā)癥是貧血. 貧血嚴(yán)重影響UC患者的生活質(zhì)量, 影響情感認(rèn)知功能和工作能力, 顯著提高住院率、治療持續(xù)時(shí)間和醫(yī)療費(fèi)用. UC相關(guān)性貧血的原因是多方面的. UC患者由于腸黏膜受損而引起的吸收障礙, 可致使機(jī)體缺乏多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì). 有研究表明, UC患者血清維生素B12(vitamin b12, VitB12)水平較正常有明顯下降[5]. UC患者通常需要外源補(bǔ)充VitB12、葉酸等以改善貧血癥狀. 近年來研究顯示, UC患者的血漿中VitB12的水平與血漿同型高半胱氨酸水平呈負(fù)相關(guān)[6], 因此, 缺乏VitB12可能導(dǎo)致高半胱氨酸血癥(homocysteine, Hcy)的形成.

VitB12又叫鈷胺素, 在自然界中由微生物合成, 主要存在于肉類、大豆以及部分中草藥中, 在人體中也可以由腸道細(xì)菌合成. VitB12是唯一的一種需要內(nèi)因子幫助才能被吸收的維生素. VitB12可促進(jìn)DNA、蛋白質(zhì)的生物合成, 在紅細(xì)胞的生成和成熟過程中扮演重要角色. 正常情況下, 基于正常飲食, 且人體腸道微生物可合成一部分VitB12, 人體并不缺少VitB12. 但VitB12是消化道疾病患者最容易缺乏的維生素, 慢性UC患者尤為突出. VitB12缺乏時(shí), 人類紅細(xì)胞葉酸水平會(huì)隨之降低, 從而影響紅細(xì)胞的更新, 造成患者貧血.

VitB12分別以腺鈷胺(adenylcobalamin, ADCBL)和甲鈷胺(methylcobalamin, MECBL)兩種形式參與了體內(nèi)各種代謝反應(yīng). 現(xiàn)在人工合成的VitB12主要以較為穩(wěn)定的氰鈷胺(cyanocobalamin, CNCBL)為主, 而進(jìn)入體內(nèi)后可被代謝為可被人體利用的則主要是ADCBL和MECBL. 食物中的VitB12的類型則要豐富得多, 存在許多類型的VitB12衍生物或類似物. 而這些VitB12類似物在體內(nèi)是否能轉(zhuǎn)變?yōu)槿梭w能利用的有效成分, 或者這些類似物本身對(duì)人體或有益或有害的作用則未能闡明. 已有報(bào)道稱一種VitB12類似物c-內(nèi)酰鈷胺素的有害作用[7,8]. 另有研究顯示, 膳食VitB12的缺失對(duì)硫酸化右旋糖苷鈉(dextran sulfate sodium, DSS)引起的小鼠UC[9,10]有緩解作用[11], 提示VitB12本身或某種衍生物可能對(duì)腸道本身、UC癥狀程度及相關(guān)并發(fā)癥的作用并不能確定.

因此, 進(jìn)一步深入研究各種VitB12衍生物對(duì)DSS所致小鼠UC的調(diào)控影響及其作用機(jī)制, 對(duì)UC治療中有針對(duì)性的給予特定VitB12的補(bǔ)充具有十分積極的指導(dǎo)作用. 在此研究中, 我們將UC小鼠喂飼以兩種最常見的VitB12衍生物MECBL和CNCBL, 深入研究不同VitB12對(duì)小鼠腸道炎癥的影響. 本研究結(jié)果可能為UC的臨床治療和預(yù)防提供可靠的理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料 8 wk齡雄性C57BL/6J小鼠32只由杭州師范大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供. 小鼠飼養(yǎng)控制室溫22 ℃、相對(duì)濕度50%以下、鼠籠內(nèi)的空氣已過濾, 12 h黑暗/光明一個(gè)循環(huán), 喂食標(biāo)準(zhǔn)小鼠飲用水和食物, 適應(yīng)1 wk. 其后分組, 分別為對(duì)照(control, CON)組、DSS組、DSS+CNCBL組和DSS+MECBL組4組, 每組8只. 喂飼過程如圖1所示.

1.2 方法

1.2.1 小鼠UC疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index, DAI)

評(píng)分: 在喂飼過程中, 從第2 d開始基于體重丟失、糞便完整性和直腸出血三項(xiàng)指標(biāo), 每日建立對(duì)UC的評(píng)價(jià)體系. 其中DAI評(píng)分包括3個(gè)方面: 大便性狀、大便隱血、體質(zhì)量下降. 各積分0-4分. 0分: 大便性狀正常, 無大便隱血, 無體質(zhì)量下降; 1分: 大便性狀正常, 無大便隱血, 體質(zhì)量下降1%-5%; 2分: 大便松散, 大便隱血陽性, 體質(zhì)量下降>5%-10%; 3分: 大便松散, 大便隱血陽性, 體質(zhì)量下降>10%-15%; 4分: 稀便, 肉眼血便, 體質(zhì)量下降>15%. 正常大便: 成形大便; 松散大便: 不黏附于肛門的糊狀、半成形便; 稀便: 可黏附于肛門的不成形便. DAI評(píng)分細(xì)則列于表1中.

1.2.2 小鼠的結(jié)腸組織提取: 小鼠在DSS和VitB12喂飼7 d后, 于第8 d用頸椎脫臼的方法處死小鼠, 迅速剖取其結(jié)腸, 分離腸系膜, 擠壓出腸腔內(nèi)容物棄去, 并用生理鹽水漂洗. 其后將結(jié)腸平鋪, 肉眼觀察其炎癥和潰瘍情況并記錄.

1.2.3 HE染色和HI評(píng)分(組織病理學(xué)評(píng)分): 將結(jié)腸組織固定在磷酸化甲醛緩沖液中24 h, 之后經(jīng)過梯度乙醇再放入到石蠟中包埋. 切下部分結(jié)腸(5 μm), 行HE染色. 根據(jù)病理常規(guī)石蠟包埋HE染色切片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及評(píng)分表, 對(duì)染色質(zhì)量進(jìn)行HI評(píng)分. 最后對(duì)小鼠結(jié)腸進(jìn)行病理學(xué)評(píng)價(jià).

1.2.4 qPCR反應(yīng): 取一小部分小鼠結(jié)腸組織經(jīng)組織勻漿、細(xì)胞裂解、離心、RNA沉淀、溶解等總RNA抽提步驟后, 配置反應(yīng)液去基因組. 行總RNA純度和完整性檢測(cè)后, mRNA逆轉(zhuǎn)錄并定量PCR檢測(cè), 最后上機(jī)分析結(jié)果. 測(cè)定中使用的引物列于表2中.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 通過t檢驗(yàn)或者單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理. 數(shù)據(jù)結(jié)果在有效值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM), P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 VitB12衍生物喂飼對(duì)UC小鼠DAI評(píng)分的影響 由小鼠體重變化曲線圖可知, CON組小鼠體重在7 d內(nèi)基本穩(wěn)定, 而DSS組、DSS+CNCBL組和DSS+MECBL組三組的小鼠體重均有降低(圖2A), 其中以DSS+CNCBL組體重缺失最多. 由DAI指標(biāo)變化曲線可知, 與CON組小鼠相比, DSS組的小鼠的DAI評(píng)分分?jǐn)?shù)從第4 d開始增加, 并在第7 d的時(shí)候達(dá)到一個(gè)最大的峰值, 證明DSS組小鼠單純給藥5%DSS出現(xiàn)體重減輕、腹瀉、便血(圖2B). DSS+CNCBL組從第5 d開始逐漸接近DSS組的DAI評(píng)分, 在第7 d時(shí)超過DSS組. 而DSS+MECBL組從第5 d開始評(píng)分有所下降, 至第8 d與DSS組相比評(píng)分最低. 由此可見, DSS喂飼可顯著引起小鼠UC癥狀, MECBL喂飼可緩解這一過程, 而CNCBL喂飼則可使UC癥狀更為嚴(yán)重.

2.2 VitB12衍生物喂飼對(duì)UC小鼠結(jié)腸病理學(xué)評(píng)價(jià)的影響 喂飼結(jié)束后處死小鼠, 取結(jié)腸組織, 觀察發(fā)現(xiàn)DSS組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯短于CON組結(jié)腸(圖3A). 同時(shí), DSS組小鼠單位長(zhǎng)度結(jié)腸質(zhì)量略低于CON組, DSS+CNCBL組單位長(zhǎng)度結(jié)腸質(zhì)量則明顯下降, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于DSS組, 而DSS+MECBL組單位長(zhǎng)度結(jié)腸質(zhì)量則相對(duì)DSS組有所增加, 且較接近于CON組(圖3B).

隨后, 我們對(duì)小鼠結(jié)腸組織進(jìn)行了病理組織評(píng)價(jià), 從組織的完整程度、炎癥浸潤(rùn)的程度、是否存在明顯的血紅細(xì)胞三個(gè)方面來觀察組織的炎癥情況(圖4A). DSS組與CON組先對(duì)比組織的炎癥浸潤(rùn), 確定患UC的小鼠組織被炎癥浸潤(rùn)的情況. 與DSS組對(duì)比, DSS+CNCBL組小鼠UC癥狀炎癥情況仍然存在, 且十分明顯, 并有加重; 而DSS+MECBL組的結(jié)腸組織較完整, 炎癥浸潤(rùn)較為輕微, 甚至沒有發(fā)現(xiàn), 遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到破壞組織的程度. 說明CNCBL并無緩解結(jié)腸炎癥的作用, 而MECBL可以緩解結(jié)腸的炎癥.

表1 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分

表2 q-PCR測(cè)試引物

圖1 硫酸化右旋糖苷鈉喂飼致小鼠潰瘍性結(jié)腸炎及VitB12衍生物添加給藥示意圖.

圖2 VitB12衍生物喂飼對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分的影響.

而由結(jié)腸組織mRNA樣本進(jìn)行的PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 可以發(fā)現(xiàn)在對(duì)IL-1β、TNFα和IL-6三種炎癥介質(zhì)的數(shù)據(jù)分析中, 相比CON組, DSS組的炎癥介質(zhì)都有一定程度的提高, 并且DSS+CNCBL組三種炎癥介質(zhì)都比DSS組還要高得多, 說明CNCBL有明顯的炎癥加重作用(圖4B). 而DSS+MECBL組的IL-1β明顯比DSS組低, 與CON組相似; 其TNFα雖然比CON組高, 但明顯也低于DSS組; IL-6則比CON組都低得多, 因此說明MECBL有明顯的改善炎癥作用.

圖3 VitB12衍生物喂飼對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸形態(tài)的影響.

圖4 VitB12衍生物喂飼對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織的影響.

3 討論

UC是一類多種病因引起的、異常免疫介導(dǎo)的腸道慢性及復(fù)發(fā)性炎癥, 有終生復(fù)發(fā)傾向. 現(xiàn)有的治療手段多屬于對(duì)癥治療, 即控制炎癥反應(yīng)、糾正水、電解質(zhì)平衡紊亂, 貧血者輸血, 低蛋白血癥者補(bǔ)充白蛋白, 嚴(yán)重者則手術(shù)治療. 臨床上缺乏有效的根治手段. 且UC患者通常缺乏VitB12等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì). 為探究VitB12類似物質(zhì)等對(duì)UC的調(diào)控機(jī)制, 取其衍生物對(duì)DSS致小鼠UC的調(diào)控機(jī)制研究. 先前的研究已經(jīng)證實(shí)了小鼠UC模型可通過DSS藥物培養(yǎng)成功建立. 在本研究中, DSS組小鼠相比于CON組小鼠有明顯的病理生理改變, 包括體重減輕、糞便性狀松散、便血情況明顯等. 在小鼠處死后, DSS組相比于CON組也有明顯的病理改變, 包括其結(jié)腸質(zhì)量和長(zhǎng)度均較小; HE染色可見其炎癥浸潤(rùn)嚴(yán)重, 細(xì)胞性狀改變.

通過本研究分析VitB12衍生物CNCBL和MECBL對(duì)DSS致小鼠UC的影響. 關(guān)于DAI評(píng)分項(xiàng): MECBL緩解UC臨床效果較好. 與DSS組相比, DSS+MECBL組的小鼠相對(duì)體重變化較小、糞便性狀較完整、便血情況較輕, DAI評(píng)分比DSS+CNCBL組的小鼠評(píng)分較低. 但由于DSS+CNCBL組的小鼠評(píng)分最后甚至略高于DSS組, 因此對(duì)于CNCBL的效果應(yīng)通過其他項(xiàng)目再議. 而對(duì)于VitB12衍生物對(duì)小鼠結(jié)腸的長(zhǎng)度幾乎無影響, 可不予考慮. 對(duì)質(zhì)量影響較輕微, 但MECBL在結(jié)腸質(zhì)量方面有一定的緩解UC效果的作用, 而CNCBL反而有加重?fù)p害效果的相對(duì)影響. 推測(cè)可能與兩者的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同從而具有不同的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)有關(guān). Tanaka研究顯示注射CNCBL和MECBL 3 wk后, 血清VitB12濃度升高, 但CNCBL組增加速度低于MECBL組[12]. 這是由于CNCBL在體內(nèi)只以痕量存在, 且必須排除和中和氰化合物分子, 其還原為+1氧化態(tài), 在酶的催化作用下生成VitB12的兩種活性輔酶形式[13]. 而營(yíng)養(yǎng)不良, 酶缺陷及組織的病理變化都可能使CNCBL轉(zhuǎn)變?yōu)閂itB12活性形式的能力降低[14]. 正如此時(shí)小鼠UC模型便處于營(yíng)養(yǎng)不良以及組織病變狀態(tài), 不僅有效活性降低, 還有可能因?yàn)檗D(zhuǎn)變失敗反而加重DSS致病機(jī)制. 因此在DSS作用下, MECBL具有保護(hù)作用, 而CNCBL卻具有加重?fù)p害的效果.

至于結(jié)腸炎癥因子評(píng)價(jià)項(xiàng): MECBL對(duì)UC治療修復(fù)作用較強(qiáng). 與DSS組對(duì)比, DSS+CNCBL組的結(jié)腸炎癥十分嚴(yán)重, 而DSS+MECBL組的炎癥浸潤(rùn)很少甚至沒有發(fā)現(xiàn), 說明MECBL可以緩解結(jié)腸的炎癥. 文獻(xiàn)調(diào)研后, 我們推測(cè), 造成這種區(qū)別原因可能是MECBL能夠減輕體內(nèi)增強(qiáng)的炎癥反應(yīng)狀態(tài)[15]. MECBL是一種內(nèi)源性輔酶, 參與核酸、蛋白質(zhì)及卵磷脂的合成, 促進(jìn)神經(jīng)髓鞘形成和軸突再生, 有利于修復(fù)受損神經(jīng)纖維, 改善周圍神經(jīng)傳導(dǎo)速度[16]. 外源性補(bǔ)充的MECBL可有效促進(jìn)周圍神經(jīng)髓鞘形成和軸突再生, 使受損神經(jīng)細(xì)胞及髓鞘得到有效修復(fù), 從而改善周圍神經(jīng)傳導(dǎo)速度, 明顯減輕患者周圍神經(jīng)病變所至疼痛、麻木、肌肉抽搐等癥狀, 減輕周圍神經(jīng)病變給患者的痛苦, 有利于改善患者生活質(zhì)量, 糾正患者營(yíng)養(yǎng)不良、鈣磷代謝及脂質(zhì)紊亂, 減少患者機(jī)體氧化應(yīng)激及炎癥介質(zhì)產(chǎn)生, 從而進(jìn)一步降低患者炎癥介質(zhì)水平及減輕代謝毒物及炎癥介質(zhì)對(duì)患者周圍神經(jīng)病變損害[17].

總之, 在VitB12衍生物對(duì)DSS所致的小鼠UC作用的研究中, 我們發(fā)現(xiàn)MECBL對(duì)小鼠UC有一定治療效果, 而CNCBL則可能反而有損害作用, 為UC的治療和食物中VitB12的添加提供一定指導(dǎo)作用.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)屬于炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)的一種, 是一種免疫系統(tǒng)攻擊自身消化系統(tǒng)的臨床常見疾病, UC患者通常需要外源補(bǔ)充維生素B12(vitamin b12, VitB12)以改善其部分并發(fā)癥.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

進(jìn)入人體的VitB12及其衍生物有多種類型, 而這些VitB12類似物在體內(nèi)是否能轉(zhuǎn)變?yōu)槿梭w能利用的有效成分, 或者這些類似物本身對(duì)人體或有益或有害的作用則未能闡明. 因此, 進(jìn)一步深入研究各種VitB12衍生物對(duì)硫酸化右旋糖苷鈉(dextran sulfate sodium, DSS)所致小鼠UC的調(diào)控影響及其作用機(jī)制, 對(duì)UC治療中有針對(duì)性的給予特定VitB12的補(bǔ)充具有十分積極的指導(dǎo)作用.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

探究VitB12衍生物氫鈷胺(cyanocobalamin, CNCBL)和甲鈷胺(methylcobalamin, MECBL)對(duì)DSS致小鼠腸炎的調(diào)控機(jī)制, 以期為UC的臨床治療和預(yù)防提供可靠的理論依據(jù).

實(shí)驗(yàn)方法

制備UC小鼠模型, 分對(duì)照(control, CON)組, DSS組, DSS+CNCBL組和DSS+MECBL組給藥, 觀察各組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index, DAI)評(píng)分、結(jié)腸長(zhǎng)度、質(zhì)量及組織病理學(xué)結(jié)果.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與CON組相比, DSS組小鼠DAI評(píng)分、結(jié)腸質(zhì)量減少程度和組織破壞程度和炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄水平明顯上升, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); CNCBL喂飼可加重小鼠UC癥狀, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 而MECBL喂飼則可改善小鼠結(jié)腸質(zhì)量, 減少組織破壞, 炎癥介質(zhì)生成也有明顯改善, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

MECBL能改善小鼠UC的癥狀, 對(duì)腸黏膜具有保護(hù)作用, 而CNCBL則對(duì)小鼠UC有加重?fù)p害的作用.

展望前景

本研究?jī)H在小鼠體內(nèi)行CNCBL和MECBL兩種VitB12衍生物對(duì)DSS致UC模型的調(diào)控機(jī)制, 并未涉及其他更多VitB12衍生物, 也并未研究人體內(nèi)藥物代謝途徑, 后期將進(jìn)行更深入的理論學(xué)習(xí)和實(shí)驗(yàn)研究, 并更明確VitB12及其衍生物對(duì)UC的作用機(jī)制, 以期為臨床治療和預(yù)防提供依據(jù).