馬丹，周淑芬，張珺，朱穎軍

(1天津醫(yī)科大學(xué)中心婦產(chǎn)科臨床學(xué)院，天津300070；2天津市第三中心醫(yī)院)

人乳頭瘤病毒(HPV)是一種雙鏈環(huán)狀DNA病毒，屬乳多空病毒科，具有較強的宿主特異性，主要感染人黏膜上皮[1]。根據(jù)致癌風(fēng)險，可分為低危型HPV與高危型HPV(HR-HPV)[2]，最常見HR-HPV亞型為HPV16、HPV18[3]。免疫功能異常在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[4]。Th17、Treg均屬CD4+T細胞亞群，介導(dǎo)細胞因子發(fā)揮不同免疫效應(yīng)，二者存在動態(tài)平衡，分別分泌白細胞介素17(IL-17)、白細胞介素23(IL-23)、白細胞介素6(IL-6)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)等細胞因子[5]。有研究表明Th17/Treg失衡在宮頸感染中發(fā)揮重要作用[6]。本研究擬通過檢測陰道微環(huán)境中免疫相關(guān)細胞因子IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平變化，初步探討細胞因子在宮頸HR-HPV感染中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年9月～2017年6月在天津醫(yī)科大學(xué)中心婦產(chǎn)科臨床學(xué)院就診的女性患者92例，均有HR-HPV持續(xù)感染史。納入標準：有性生活史；非月經(jīng)期。排除標準：妊娠期；檢查前1周內(nèi)陰道用藥；合并非宮頸組織的其他惡性腫瘤；半年內(nèi)曾使用糖皮質(zhì)激素、免疫調(diào)節(jié)劑；有盆腔放化療史。根據(jù)組織病理檢查結(jié)果及參考《實用婦科腫瘤學(xué)》[7]將患者分為CIN Ⅰ級30例(A組)、CIN Ⅱ、Ⅲ級32例(B組)、宮頸癌30例(C組)。A組年齡25～50(34.62±8.11)歲，感染HPV16型12例、HPV18型10例、其他型8例。B組年齡26～52(35.16±7.62)歲，感染HPV16型13例、HPV18型12例、其他型7例。C組年齡27～51(34.27±7.38)歲，感染HPV16型10例、HPV18型11例、其他型9例。三組年齡、感染類型具有可比性。另同期選取體檢健康女性31例為對照組，經(jīng)液基薄層細胞檢測宮頸無異常，年齡23～50(32.67±5.17)歲。各組年齡具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者均知情并簽署手術(shù)同意書。

1.2 HR-HPV負荷量檢測 各組自行清洗外陰，宮頸活檢前用5 mL生理鹽水沖洗宮頸及陰道上1/3，停留10 s后于后穹隆吸出灌洗液4～4.5 mL，室溫2 000 r/min離心5 min，吸取上清液于-80 ℃冷凍保存，用宮頸刷收集脫落細胞于-4 ℃保存。取宮頸脫落細胞，采用雜交捕獲2代基因雜交信號放大系統(tǒng)進行檢測，相關(guān)儀器設(shè)備與試劑購自美國Digene公司。

1.3 陰道微環(huán)境中細胞因子水平檢測 取灌洗上清液冰上解凍，恢復(fù)室溫后采用ELISA法檢測IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平。IL-17檢測試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司，IL-23檢測試劑盒購自北京百奧萊博生物科技有限公司，IL-6檢測試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司，TGF-β檢測試劑盒購自上海基免生物科技有限公司。嚴格參照試劑盒說明書進行操作。

2 結(jié)果

2.1 各組HR-HPV感染患者病毒負荷量分布比較 三組HR-HPV負荷量分布比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 三組HR-HPV負荷量比較[例(%)]

2.2 四組陰道微環(huán)境中細胞因子水平比較 四組陰道微環(huán)境中細胞因子水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，B組、C組IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平及IL-17/IL-6值高(P均<0.05)，A組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與A組比較，B組、C組IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平及IL-17/IL-6值高(P均<0.05)；與B組比較，C組IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平及IL-17/IL-6值高(P均<0.05)。見表2。

表2 四組陰道微環(huán)境中細胞因子水平比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與A組比較，bP<0.05；與B組比較，cP<0.05。

2.3 不同亞型感染患者陰道微環(huán)境中細胞因子水平比較 不同HR-HPV亞型感染患者陰道微環(huán)境中細胞因子水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同亞型感染患者陰道微環(huán)境中細胞因子水平比較

2.4 HR-HPV感染患者陰道微環(huán)境中免疫細胞因子水平與HR-HPV負荷量的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平與HR-HPV負荷量均呈正相關(guān)(rs分別為0.612、0.513、0.597、0.519，P均<0.05)。

2.5 宮頸HR-HPV感染的影響因素 將宮頸是否感染HR-HPV作為因變量，以IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β均為宮頸HR-HPV感染的影響因素。見表4。

表4 宮頸HR-HPV感染的影響因素多元回歸分析

2.6 陰道微環(huán)境中IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β聯(lián)合檢測對宮頸HR-HPV感染的預(yù)測價值 繪制ROC曲線，陰道微環(huán)境中IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β聯(lián)合檢測預(yù)測HR-HPV感染的ROC曲線下面積為0.731，特異度為81.2%，敏感度為76.3%。

3 討論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤。原位癌高發(fā)年齡為30～35歲，浸潤癌為45～55歲，近年來有年輕化的趨勢。HR-HPV感染是CIN及宮頸癌的主要致病因素[8]。HPV感染可使上皮細胞獲得較高的增殖活性，也可通過促進上皮細胞的增殖而癌變[9]，是人類癌癥發(fā)病過程中惟一確定的致癌病毒。多數(shù)婦女曾感染過HPV，大部分可經(jīng)免疫系統(tǒng)自行消除，但一旦免疫系統(tǒng)出現(xiàn)問題無法消除，導(dǎo)致宮頸病變甚至發(fā)生宮頸癌[10]。有研究表明，HR-HPV負荷量與宮頸病變程度有關(guān)，HR-HPV負荷量越高，宮頸病變加重的危險越大[11]。因此，避免HR-HPV感染是降低宮頸癌發(fā)病率的關(guān)鍵。

有研究表明，免疫系統(tǒng)在宮頸HR-HPV感染中發(fā)揮重要作用，CD4+T細胞亞群接受抗原刺激后，增殖、分化為各種效應(yīng)細胞，分泌細胞因子，參與各個階段的免疫應(yīng)答[12]。正常機體CD4+T細胞亞群除Th1、Th2外，還包括Th17與Treg。Th17主要分泌IL-17、IL-23。Treg被認為是一種獨立的CD4+T細胞亞群，主要功能是抑制其他T細胞的活化[13]。有研究表明，Treg細胞可通過發(fā)揮免疫抑制作用而參與HPV病毒的免疫逃逸[14]。Treg細胞可分泌細胞因子IL-10和TGF-β。Th17及Treg細胞來源于相同的Th0，在特定細胞因子調(diào)控下相互排斥，向不同的方向分化[15]。但有關(guān)IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β在陰道灌洗液中的水平及其與宮頸HR-HPV感染的關(guān)系研究甚少。

徐靜等[16]研究中HR-HPV負載量隨CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ級別依次增加，認為HPV負荷量可促進宮頸逐步發(fā)生病變。本研究隨著病情加重，HR-HPV負荷量大于1 000 copies/mL的人數(shù)逐漸增多，而小于100 copies/mL的人數(shù)逐漸減少，表明HR-HPV負荷量越大病情越重，與相關(guān)研究一致。何芳等[17]研究表明，Th17細胞、Treg細胞水平與宮頸癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤有關(guān)，表明Th17、Treg細胞均與宮頸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究中，宮頸病變患者陰道微環(huán)境中IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平高于對照組，且隨病情加重，IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平升高，推測IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β可能參與了宮頸病變發(fā)生發(fā)展及惡性轉(zhuǎn)化。與宮頸正常者比較，宮頸癌患者IL-17/IL-6值升高，因此猜測Th17/Treg在升高的同時向Th17偏移，形成Th17優(yōu)勢；而"Th17優(yōu)勢"是造成宮頸HPV感染的重要原因之一。本研究在不同HR-HPV感染亞型中，IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是因為感染亞型種類多，而樣本量小，無法體現(xiàn)差異。Spearman相關(guān)性分析顯示，IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β均與HR-HPV負載量呈正相關(guān)，提示HPV感染會造成細胞免疫因子IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平升高，進一步導(dǎo)致患者免疫功能下降，使機體更易受到病毒襲擊。同時采用Logistic回歸分析結(jié)果顯示IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平升高是宮頸HR-HPV感染的獨立危險因素。ROC曲線分析結(jié)果顯示四者聯(lián)合檢測，曲線下面積為0.731，敏感度、特異度良好，對宮頸HR-HPV感染具有預(yù)測價值，有望成為預(yù)測宮頸HR-HPV感染的重要指標。

綜上所述，頸HR-HPV感染患者陰道微環(huán)境中IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平升高，四者聯(lián)合檢測可預(yù)測宮頸HR-HPV感染。由于本研究樣本數(shù)較少，結(jié)果有可能產(chǎn)生偏倚，將來需擴大樣本對研究結(jié)果加以證實。