趙婷，姚吉龍，張華坤，劉慶芝

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院,廣東深圳 518000)

生殖醫(yī)學(xué)的發(fā)展給越來越多的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者帶來了福音。系統(tǒng)性檢查夫婦雙方的染色體、感染因素、血栓前狀態(tài)、內(nèi)分泌因素、自身免疫因素等，并針對(duì)性地治療可使部分患者成功妊娠。但仍有部分復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者通過上述檢查并未發(fā)現(xiàn)明顯異常，被稱為原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA),推測(cè)可能與母體對(duì)胚胎父系抗原排斥有關(guān)，其治療非常棘手。有研究表明，在體外將外周血淋巴細(xì)胞加入子宮內(nèi)膜細(xì)胞中培養(yǎng)后，可以增加滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)子宮內(nèi)膜的侵襲力，說明自體淋巴細(xì)胞可能改善了子宮內(nèi)膜的免疫狀態(tài)[1]。目前對(duì)自體淋巴細(xì)胞體內(nèi)宮腔治療的研究甚少。本研究通過對(duì)URSA進(jìn)行絨毛膜促性腺激素(HCG)培養(yǎng)自體淋巴細(xì)胞宮腔內(nèi)灌注治療，探究該方法對(duì)妊娠結(jié)局的影響；并于治療后取少量?jī)?nèi)膜組織，檢測(cè)不同妊娠結(jié)局患者內(nèi)膜組織中白細(xì)胞介素2(IL-2)、IL-8、腫瘤壞死因子α(NF-α)、T細(xì)胞活化后表達(dá)和分泌的調(diào)節(jié)蛋白(RANTES)的水平，探究其相關(guān)機(jī)制，從而為URSA患者提供新的治療方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年9月～2017年9月就診于本院生殖綜合門診的URSA患者46例，年齡(32.15±4.08)歲，連續(xù)流產(chǎn)次數(shù)≥2次。本研究患者子宮無器質(zhì)性病變及生殖道畸形，無感染因素，無內(nèi)分泌檢查異常，無遺傳性疾病且夫婦雙方染色體檢查無異常，排除自身免疫功能紊亂。將46例患者隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組各23例，觀察組年齡(33.09±4.39)歲，BMI(22.33±1.63)kg/m2，子宮內(nèi)膜厚度(8.96±1.02)mm；對(duì)照組年齡(31.22±3.57)歲，BMI(22.39±1.78)kg/m2，子宮內(nèi)膜厚度(9.00±1.23)mm。兩組臨床資料具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 自體淋巴細(xì)胞分離及宮腔灌注治療方法 對(duì)照組常規(guī)進(jìn)行主動(dòng)免疫治療，觀察組進(jìn)行自體淋巴細(xì)胞宮腔灌注治療及內(nèi)膜搔刮并取樣。連續(xù)B超監(jiān)測(cè)觀察組排卵情況，于排卵前4～5 d，抽取患者自體外周血10～20 mL，應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血淋巴細(xì)胞，并使用TCM199 (Gibco, Grand Island, NY, USA)洗滌2次后，將細(xì)胞密度調(diào)至1×106/mL，置于RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Sigma公司)及10%血清白蛋白中與HCG(3～6 U/mL)混合共培養(yǎng)24 h后，離心分離出淋巴細(xì)胞。經(jīng)生理鹽水洗滌、定容，將細(xì)胞密度調(diào)整為(1～5)×108/mL,重懸至300～500 μL于5 mL無菌離心管中備用。排卵前3 d，患者取膀胱截石位，0.1%碘伏常規(guī)消毒外陰及陰道，人工授精管連接1 mL注射器，抽取分離好的淋巴細(xì)胞，緩慢注射入宮腔內(nèi)，停留幾秒鐘后取出人工授精管，患者平躺休息15～20 min。宮腔灌注2個(gè)月經(jīng)周期后指導(dǎo)患者備孕。

1.3 觀察指標(biāo) 半年后比較兩組妊娠結(jié)局(持續(xù)妊娠、再次流產(chǎn)、未妊娠)。比較觀察組不同妊娠結(jié)局者的年齡、流產(chǎn)次數(shù)、BMI、子宮內(nèi)膜厚度及治療后子宮內(nèi)膜組織中IL-2、TNF-α、IL-8、RANTES水平。宮腔灌注1個(gè)周期后于黃體期，常規(guī)消毒外陰及陰道，用一次性內(nèi)膜取樣器抽取少量?jī)?nèi)膜組織，生理鹽水洗滌，離心收集標(biāo)本，后置于凍存管中(Falcon)，迅速放入液氮中，后至-80 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)錂z。IL-2、IL-8、TNF-α、RANTES試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司，按照Bio-plex操作說明書進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 兩組妊娠結(jié)局比較 觀察組持續(xù)妊娠9例、再次流產(chǎn)3例、未妊娠11例，臨床妊娠率為39.13%；對(duì)照組持續(xù)妊娠2例、再次流產(chǎn)6例、未妊娠15例，臨床妊娠率為8.69%；兩組臨床妊娠率比較P<0.05。

2.2 觀察組不同妊娠結(jié)局者一般情況比較 見表1。各組年齡、BMI、子宮內(nèi)膜厚度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

表1 觀察組不同妊娠結(jié)局者一般情況比較

2.3 觀察組不同妊娠結(jié)局者治療前后子宮內(nèi)膜組織中IL-2、TNF-α、IL-8、RANTES水平比較 見表2。

3 討論

URSA是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大難題，其病因不明，復(fù)雜多樣，治療棘手[2]。URSA患者承擔(dān)著巨大的社會(huì)心理壓力，如何解決此類患者的妊娠問題，提高其妊娠率，成為臨床醫(yī)生亟待解決的問題。URSA可能與母胎間免疫調(diào)節(jié)紊亂有關(guān)。胚胎攜帶父系抗原種植于子宮內(nèi)膜，相當(dāng)于一種半同種移植，如果母體對(duì)胚胎父系抗原免疫低反應(yīng)，不能識(shí)別父系抗原，就會(huì)發(fā)生免疫排斥，導(dǎo)致流產(chǎn)。目前對(duì)URSA患者的治療，主要是丈夫或第三方供血的淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療及靜脈注射免疫球蛋白，但其有效性至今尚存在爭(zhēng)議。本研究采用自體淋巴細(xì)胞宮腔灌注，避免了丈夫及第三方供血可能造成的血源性感染、過敏反應(yīng)等。且宮腔灌注直接作用于子宮內(nèi)膜局部，操作簡(jiǎn)便，易于被患者所接受。Nakayama等[3]將外周血單核細(xì)胞(PBMC)加入小鼠胚胎的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)胚胎的侵襲作用增強(qiáng);若HCG與PBMC共同孵育后再加入培養(yǎng)基中，則胚胎的侵襲作用顯著增強(qiáng)。表明HCG增強(qiáng)了PBMC的作用。HCG與外周血淋巴細(xì)胞作為妊娠期間重要的激素及免疫細(xì)胞，兩者作用相輔相成?；诖吮狙芯繉⒆泽w淋巴細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，將其與HCG共培養(yǎng)24 h，從而增強(qiáng)自體淋巴細(xì)胞對(duì)子宮內(nèi)膜局部的免疫調(diào)節(jié)作用。

表2 觀察組不同妊娠結(jié)局者治療前后子宮內(nèi)膜組織中IL-2、TNF-α、IL-8、RANTES水平比較

注：與相同妊娠結(jié)局治療前比較，*P<0.05。

Madkour等[4]對(duì)至少2次種植失敗的患者，在移植胚胎前給予已培養(yǎng)的自體外周血淋巴細(xì)胞宮腔內(nèi)治療后，患者的胚胎種植率(21.54%)及臨床妊娠率(44.44%)均顯著上升。Yu等[5]研究也表明，HCG體外培養(yǎng)自體PBMC宮腔注射后，既往有反復(fù)種植失敗的患者臨床妊娠率也明顯提高，達(dá)46.24%。目前有關(guān)宮腔灌注治療的研究主要針對(duì)反復(fù)種植失敗的患者。本研究首次對(duì)URSA患者給予宮腔灌注HCG孵育的自體淋巴細(xì)胞，同樣取得了較高的妊娠率。提示對(duì)于URSA患者,自體淋巴細(xì)胞宮腔灌注可能為一種較好的治療方法。

輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)，又被稱為CD4+細(xì)胞，其與自然流產(chǎn)密切相關(guān)，其根據(jù)功能的差異及分泌細(xì)胞因子的不同分為Th0、Th1、Th2細(xì)胞亞群。Th0細(xì)胞是前體細(xì)胞，起主要作用的是Th1、Th2細(xì)胞。Th1細(xì)胞可分泌IL-2、IL-12、干擾素γ、TNF-α等，促使巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞增殖分化，通過介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，參與超敏反應(yīng)及器官特異性免疫調(diào)節(jié)，起到免疫殺傷的作用[6]。Th2細(xì)胞則可分泌IL-4、IL-6、IL-5、IL-8等細(xì)胞因子，抑制炎癥因子的生成，促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化及抗體的生成，通過體液免疫發(fā)揮免疫耐受的作用[7]。因此，要維持正常妊娠，母體免疫應(yīng)向Th2偏移，以促使母體與胚胎間免疫容受的形成[8]。IL-8為Th2細(xì)胞因子，可促進(jìn)子宮內(nèi)膜血管的形成，促進(jìn)胚胎著床，趨化激活中性粒細(xì)胞介導(dǎo)免疫平衡[9,10]。RANETS具有類封閉因子作用，能夠阻止母體NK細(xì)胞對(duì)同種異基因胎兒父系抗原的免疫識(shí)別及應(yīng)答，抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng);妊娠過程中如果其產(chǎn)生減少，母體會(huì)將胚胎視為異物對(duì)其進(jìn)行免疫攻擊，從而導(dǎo)致流產(chǎn)[11]。IL-2、TNF-α是Th2細(xì)胞產(chǎn)生的重要細(xì)胞因子，在正常早期妊娠的絨毛及間質(zhì)細(xì)胞中很少表達(dá)，IL-2可與TNF-α產(chǎn)生協(xié)同作用，激活NK細(xì)胞，促使淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性細(xì)胞，產(chǎn)生免疫毒性作用[12,13]。正常情況下，胚胎為避免被母體免疫細(xì)胞排斥，應(yīng)使Th1/Th2免疫反應(yīng)處于平衡狀態(tài)，在胚胎植入及以后的懷孕過程中，母體會(huì)分泌大量Th2細(xì)胞因子，使免疫反應(yīng)向Th2轉(zhuǎn)化，以Th2型反應(yīng)為主，利于妊娠的進(jìn)展[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與治療前相比，觀察組中持續(xù)妊娠者治療后IL-2、TNF-α水平下降，IL-8、RANETS水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而再次流產(chǎn)與未妊娠者相關(guān)細(xì)胞因子水平治療前后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Th1型細(xì)胞因子減少，Th2型細(xì)胞因子增多，促使免疫反應(yīng)Th1/Th2平衡向Th2型偏移，Th2型反應(yīng)占主導(dǎo)地位，促使母胎免疫耐受的形成，從而使妊娠過程繼續(xù)進(jìn)行下去。

綜上所述，HCG培養(yǎng)自體淋巴細(xì)胞宮腔灌注治療可顯著改善URSA患者的妊娠結(jié)局，其機(jī)制可能通過調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜局部細(xì)胞因子的改變，促使免疫反應(yīng)向Th2型偏移，促使母體與胎兒間免疫耐受形成，從而避免流產(chǎn)的發(fā)生。但本研究也有不足，樣本量較小，今后對(duì)其作用機(jī)制還要進(jìn)行深入研究。