包哈申，胡斯楞

（內(nèi)蒙古錫林郭勒盟醫(yī)院，內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000）

細(xì)胞凋亡是指由基因控制的自主的、有序的、主動(dòng)的細(xì)胞死亡過程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控。急性心肌梗死后不僅因缺血壞死而喪失大量的心肌細(xì)胞，細(xì)胞凋亡也同樣造成大量心肌細(xì)胞的丟失[1]。有研究報(bào)道在AMI模型大鼠，心肌細(xì)胞凋亡與缺血壞死比例可高達(dá)30:1，大量功能正常的心肌細(xì)胞凋亡可造成心臟收縮功能減退、心室壁變薄、心室擴(kuò)張等病理性改變而加速心肌梗死后心室重構(gòu)的進(jìn)展[2]。本研究旨在探討G-CSF對(duì)心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

昆明種小鼠150只，雌雄不限，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。鹽酸異丙腎上腺素（東京化成工業(yè)株式會(huì)社），人重組粒細(xì)胞刺激因子注射液（北京四環(huán)生物制藥），兔TGF-β1多克隆抗體（protein tech公司），Kit-9710即用型免疫組化試劑盒（福州邁新），DAB顯色試劑盒（福州邁新生），磷酸鹽緩沖液，MD4000 B LED顯微鏡（Lecia公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模

鹽酸異丙腎上腺素85 mg/kg連續(xù)腹腔注射3天誘導(dǎo)AMI模型。造模后第1天10%水合氯醛4.5 ml/kg腹腔注射麻醉小鼠，采集Ⅱ?qū)?lián)心電圖。以J點(diǎn)顯著上抬作為初步判斷造模成功的標(biāo)準(zhǔn)，以J點(diǎn)上臺(tái)＜0.2 mV作為排除標(biāo)準(zhǔn)。隨機(jī)選取心電圖符合上述標(biāo)準(zhǔn)的模型動(dòng)物10只，行心肌HE染色觀察心肌組織結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)一步判斷造模是否成功。

1.2.2 分組

將模型小鼠隨機(jī)分成A、B、C三組，再取10只正常小鼠作為D組。A組：AMI組，30只；B組：AMI+G-CSF中劑量組，G-CSF 50 ug/kg連續(xù)腹腔注射5天，20只；C組：AMI+G-CSF高劑量組，G-CSF 100 ug/kg連續(xù)腹腔注射5天，20只；D組：對(duì)照組，10只。A組分別于造模后第1、14、28天采血并各處死三分之一，B、C組分別于造模后第14、28天采血并各處死一半。

1.2.3 血清學(xué)檢測(cè)

斷頸法處死小鼠，迅速打開胸腔取出心臟，置于10%福爾馬林液固定24小時(shí)以上，行心肌BCL-XL免疫組化。光學(xué)顯微鏡下觀察BCL-XL的表達(dá)量及分布況，每只小鼠每組免疫組化在相同的顯微鏡參數(shù)下隨機(jī)采集3張圖片，采用Image pro plus 6.0圖像軟件計(jì)算BCL-XL的平均光密度，并進(jìn)行組內(nèi)及組間對(duì)比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以“x±s”表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

與D組相比較，造模后第1天A組BCL-XL平均光密度顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

第14天時(shí)，與A組第1天比較A、B、C三組BCL-XL平均光密度均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A、B、C三組間比較，BCL-XL平均光密度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

第28天時(shí)，與第14天比較A、B兩組BCL-XL平均光密度均顯著地上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而C組BCL-XL平均光密度輕度下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。A、B、C三組間比較，A組BCL-XL平均光密度均顯著大于B組與C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），B組BCL-XL平均光密度均顯著大于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組BCL-XL平均光密度比較（±s，%）

表1 各組BCL-XL平均光密度比較（±s，%）

注：*與D組比較，P＜0.05。**與A組1 d比較，P＜0.05。#與14 d時(shí)比較，P＜0.05。##與A組28 d比較，P＜0.05

組別 數(shù)量（只） BCL-XL平均光密度A組1 d 10 0.027±0.0065*A組14 d 10 0.018±0.0028**A組28 d 9 0.038±0.0084#B組14 d 10 0.015±0.0057**B組28 d 10 0.027±0.0091###C組14 d 10 0.016±0.0034**C組28 d 10 0.015±0.0034##D組 10 0.011±0.0021

3 討 論

李陶等[3]對(duì)心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)行了深入的研究，并報(bào)道大鼠AMI模型誘導(dǎo)后第1天AMI組心肌細(xì)胞凋亡率較假手術(shù)組顯著升高，心肌細(xì)胞凋亡主要分布在梗死區(qū)及梗死周邊區(qū)，而遠(yuǎn)端非梗死區(qū)只占7%。隨著時(shí)間的推移遠(yuǎn)端非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡占主導(dǎo)地位，4周后其分布率達(dá)54%，心肌細(xì)胞凋亡率也由4周前的（0.07±0.03）%上升至（0.09±0.05）%，遠(yuǎn)端非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡率與左心室舒張末徑之間存在正相關(guān)性，認(rèn)為遠(yuǎn)端非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋是心肌梗死后心室重構(gòu)及心功能惡化的重要原因之一。遠(yuǎn)端非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡主要與心肌細(xì)胞牽張力及壓力負(fù)荷增高、炎性細(xì)胞因子的釋放、神經(jīng)體液機(jī)制的激活等有關(guān)，其中AngⅡ也參與了心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡過程。田翠等[4]研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ與心肌細(xì)胞AT1結(jié)合開放電壓依賴性L型鈣通道，促使大量鈣離子內(nèi)流激活鈣依賴性核酸內(nèi)切酶，鈣依賴性核酸內(nèi)切酶切割心肌細(xì)胞DNA雙鏈導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。

本研究未直接觀察心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡情況，而是通過抗凋亡蛋白BCL-XL在心肌中的表達(dá)量來間接反映了心肌細(xì)胞凋亡情況。崔巍等[5]在結(jié)扎犬冠狀動(dòng)脈左前降支30分鐘后觀察到抗凋亡蛋白BCL-XL表達(dá)量較對(duì)照組明顯增高，并認(rèn)為心肌細(xì)胞凋亡是急性心肌缺血的早期病理改變，心肌急性缺血時(shí)抗凋亡蛋白BCL-XL表達(dá)量迅速增高以對(duì)抗心肌細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)同樣也觀察到了造模后第1天AMI組心肌BCL-XL蛋白表達(dá)量較正常對(duì)照組顯著升高，提示AMI后早期就有大量心肌細(xì)胞凋亡。第28天AMI組BCL-XL蛋白表達(dá)量再次升高，可能與AMI晚期非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡增高有關(guān)，表明AMI后心肌細(xì)胞凋亡持續(xù)存在，而過量表達(dá)的抗凋亡蛋白BCL-XL被凋亡蛋白Caspase降解成有促凋亡作用的片段，可能會(huì)進(jìn)一步加重AMI晚期心肌細(xì)胞凋亡。值得注意的是，G-CSF抑制心室重構(gòu)、改善心功能的作用機(jī)制與G-CSF通過激活Jak/Stat3信號(hào)通路調(diào)控抗凋亡蛋白BCL-XL、BCL-2與凋亡蛋白Bad、Bax之間的相互作用，進(jìn)而減少心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。G-CSF干預(yù)后高劑量給藥組BCL-XL表達(dá)量持續(xù)下降，而中劑量給藥組BCL-XL表達(dá)量造模后第28天與造模后第14天比較有所上升，但仍低于AMI組，第28天G-CSF高劑量給藥組BCL-XL表達(dá)量顯著低于G-CSF中劑量給藥組，提示G-CSF高劑量組抑制心肌梗死后晚期心肌細(xì)胞凋亡作用可能優(yōu)于G-CSF中劑量組。綜上所述心肌細(xì)胞凋亡是心肌梗死后心室重構(gòu)的重要組部分，G-CSF干預(yù)可顯著而持久的抑制心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡。