劉東慧,劉陳霏,宋妤軒,阮鴻嬌,陳志宏△
(1.承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室,河北承德 067000;2.中國藥科大學(xué))
2型糖尿病是一種由胰島素相對或絕對分泌不足導(dǎo)致的以血糖升高為主要臨床表現(xiàn)的代謝性疾病。在胰腺,胰島素由胰島β細(xì)胞分泌后與胰島素受體(insulin receptor,IR)結(jié)合而啟動磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phos-phatidylinositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信號通路,啟動后的PI3K/Akt信號通路通過調(diào)控胰島素分泌,維持β細(xì)胞的生長、增殖等途徑來實現(xiàn)胰島素降低血糖的作用[1-2]。絲膠是從蠶繭中提取的一種天然水溶性蛋白,具有生物相容性,可降解。Akt作為PI3K/Akt信號通路中的關(guān)鍵因子之一,本研究在前期發(fā)現(xiàn)絲膠能有效降低血糖的基礎(chǔ)上[3],進(jìn)一步觀察了絲膠對2型糖尿病大鼠模型胰腺Akt mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,以期揭示絲膠降血糖的作用機制。
1.1 絲膠的提取 蠶繭經(jīng)1%的Na2CO3浸泡30min后沸煮3h(2次),將提取液濃縮、透析凍干至粉末備用。
1.2 動物分組及處理 SPF級雄性SD大鼠,實驗動物許可證號:SCXK(京)2012-0001,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。36只大鼠隨機分為正常組、模型組和實驗組,每組12只。給予造模大鼠高脂高糖飼料+腹腔注射STZ(35mg/kg/d,連續(xù)2d)處理,以空腹血糖≥11.1mmol/L的大鼠為成功2型糖尿病大鼠模型。成模后,實驗組大鼠給予絲膠(2.4g/kg/d)連續(xù)灌胃35d,正常組、模型組大鼠給予等體積生理鹽水連續(xù)灌胃35d。用藥結(jié)束,將各組大鼠麻醉后,取血、處死,迅速取出胰腺加入Trizol放于液氮中研磨,研磨充分后放液氮中儲存?zhèn)溆谩?/p>
1.3 檢測血糖 將取得的各組大鼠血液標(biāo)本離心、分離血清后送承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科檢測血糖。
1.4 檢測胰腺Akt mRNA的表達(dá) 采用Real Time Q-PCR法:取適量胰腺組織提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。利用pGM-T質(zhì)粒載體成功構(gòu)建Akt和GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品后測定其濃度用以后續(xù)定量。擴增各組大鼠的Akt和GAPDH得標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴增曲線、溶解曲線,PCR引物設(shè)計與合成由寶生物工程(大連)有限公司完成,以Akt與相應(yīng)GAPDH拷貝數(shù)的比值作為各組大鼠Akt mRNA的相對表達(dá)水平,PCR引物序列見表1。
表1 引物序列和產(chǎn)物大小
1.5 統(tǒng)計分析 各組大鼠血糖及胰腺Akt mRNA的表達(dá)均以(±s)表示,采用IBM SPSS Statistics 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù),多組間差異的比較采用單因素方差分析,兩兩組間差異采用Tukey’s檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 血糖水平 模型組大鼠血糖明顯高于正常組大鼠(P<0.05),實驗組大鼠血糖明顯低于模型組大鼠(P<0.05)。見表2:
表2 各組大鼠的血糖及胰腺Akt mRNA的表達(dá)水平(±s )
表2 各組大鼠的血糖及胰腺Akt mRNA的表達(dá)水平(±s )
與模型組比較:*P<0.05
組別 n 血糖(mmol/L) Akt mRNA正常組 12 10.83±2.03* 58.14±16.39*模型組 12 29.45±4.82 28.83±8.06實驗組 12 13.20±4.09* 46.37±12.57*
2.2 胰腺Akt mRNA的表達(dá) Akt標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度為1.57×107~1.57×104,以pGM-T-Akt陽性質(zhì)粒DNA和各組大鼠cDNA做為模板,經(jīng)過Real Time Q-PCR法擴增后得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線擴增效率為94.859%,斜率為-3.452,相關(guān)系數(shù)r為-0.998,截距為36.253;擴增曲線均呈S型;溶解曲線呈單峰(附圖)。各組大鼠Akt mRNA表達(dá)的定量分析結(jié)果見表2:模型組大鼠Akt mRNA的表達(dá)量明顯低于正常組大鼠(P<0.05),實驗組大鼠Akt mRNA的表達(dá)量明顯高于模型組大鼠(P<0.05)。
(1.標(biāo)準(zhǔn)曲線,2.擴增曲線,3.溶解曲線)
目前,2型糖尿病的發(fā)病率逐年增高,已經(jīng)成為全球關(guān)注的公共健康問題,臨床用于治療糖尿病的各類藥物雖能有效降低血糖,但長期服用均會產(chǎn)生不良反應(yīng)。因此,探尋一種天然藥物來彌補目前降糖藥的不足十分必要。絲膠來源于蠶繭,課題組前期發(fā)現(xiàn)絲膠能有效降低血糖[3],但機制尚不明了。
胰島素是機體內(nèi)唯一降低血糖的激素,與IR結(jié)合后啟動PI3K/Akt信號通路,從而激活A(yù)kt?;罨腁kt通過調(diào)控與細(xì)胞周期相關(guān)的酶來維持胰島β細(xì)胞的細(xì)胞周期,促進(jìn)β細(xì)胞增殖[4-5];活化的Akt可使凋亡基因失活,抑制β細(xì)胞凋亡[6];活化的Akt還可調(diào)節(jié)β細(xì)胞分泌胰島素,促進(jìn)外周靶組織攝取葡萄糖,減輕胰島素抵抗[7]。有研究發(fā)現(xiàn),Akt激酶失活的轉(zhuǎn)基因小鼠,其胰島β細(xì)胞Akt活性明顯下降,進(jìn)而出現(xiàn)胰島素分泌缺陷[8]。因此,在胰島β細(xì)胞的生長、增殖、再生、凋亡及分泌胰島素中,PI3K/Akt信號通路發(fā)揮著十分重要的作用。
本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠胰腺Akt mRNA的表達(dá)明顯降低。Akt是PI3K/Akt信號通路中的關(guān)鍵因子之一,其表達(dá)降低可通過影響β細(xì)胞的增殖、凋亡及胰島素的分泌而導(dǎo)致胰島素的生理作用減弱,從而引發(fā)模型組大鼠血糖明顯升高。實驗組大鼠給予絲膠灌胃后,Akt mRNA的表達(dá)明顯升高,提示絲膠可通過上調(diào)胰腺Akt mRNA的表達(dá),改善糖尿病時胰島β細(xì)胞中PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常,從而發(fā)揮降低血糖的作用,這可能是絲膠降低血糖的作用機制之一。