張 博，努日比婭姆·麥麥提托合提，宋玉坤，郜 宇，王旭光，阿布力孜·吾斯曼

（新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，新疆烏魯木齊 830052）

體外成熟的卵母細胞存在細胞質(zhì)成熟差或者細胞核質(zhì)成熟不同步等問題，導致體外生產(chǎn)的胚胎卵裂率、囊胚率和妊娠率低。卵巢卵泡作為卵母細胞的生長和成熟發(fā)生的場所，卵泡液的生化成分決定著卵母細胞生長和成熟的微環(huán)境。多不飽和脂肪酸（PUFA）在卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育過程中除了能量供應，還是合成前列腺素（PG）的直接前體。作為ω-3 PUFA，α-亞麻酸（ALA）是哺乳動物2 種必需脂肪酸之一，也是生物體組織生物膜的結構材料。ALA 可以增加牛卵母細胞內(nèi)環(huán)腺苷酸（cAMP）水平、提高絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化水平[1]，增加成熟培養(yǎng)基PGE2合成[1-2]，從而在恢復卵母細胞減數(shù)分裂和生發(fā)泡破裂（GVBD）中起重要作用。ALA 具有一定的抗氧化能力，可以降低牛卵母細胞質(zhì)中活性氧（ROS）水平[3]，降低人卵母細胞體外成熟培養(yǎng)基脂質(zhì)過氧化[4]，增加豬卵母細胞質(zhì)中谷胱甘肽（GSH）水平[5]。ALA 的抗凋亡能力在綿羊[6]、山羊[7]上也有報道。國內(nèi)關于ALA 對卵母細胞體外成熟影響的研究有少量報道[4,8-9]，但在綿羊上尚未有研究報道。因此，本實驗采用ALA 作為綿羊卵母細胞成熟培養(yǎng)基的添加劑，研究ALA 對綿羊卵母細胞體外成熟的影響及其可能的抗氧化作用途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 促卵泡素（FSH）、促黃體素（LH）、表皮生長因子（EGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、肝素鈉、透明質(zhì)酸酶、無脂肪酸牛血清白蛋白（FA-BSA）購自Solarbio 公司；其余藥品均購自美國Sigma 公司。綿羊卵巢采自烏魯木齊草綠天藍畜牧公司華凌屠宰場。

1.2 試劑配制 卵巢保存液：0.9%生理鹽水+8 mmol/L葡萄糖+0.2 g/L MgCl2+0.2 g/L CaCl2+100 mg/L 青霉素+100 mg/L 鏈霉素。

采卵液：9.5 g/L TCM199 +5 mmol/L NaHCO3+10 mmol/L HEPES+10 mmol/L HEPES-Na+ 2500 U/L 肝素鈉+4 g/L BSA +0.01 g/L 酚紅+100 mg/L 青霉素+100 mg/L 鏈霉素。

卵母細胞基礎成熟液：9.5 g/L TCM199+6 g/L BSA+25 mmol/L NaHCO3+500 U/L FSH+500 U/L LH+1 mg/L E2+25 μg/L EGF+5 μg/L VEGF+1.5 mmol/L 葡 萄 糖+5.5 mmol/L乳酸鈉+2 mmol/L 丙酮酸鈉+1 mmol/L 谷氨酰胺+ 0.1 mmol/L半胱氨酸+100 mg/L 青霉素+100 mg/L 鏈霉素。

卵母細胞基礎成熟液（0 μmol/L）中分別添加10、50、100、200 μmol/L ALA 配置成不同ALA 濃度的卵母細胞成熟液。

0.1%透明質(zhì)酸酶：1 g/L 透明質(zhì)酸酶+9.5 g/L TCM199 +2.1 g/LNaHCO3。

1.3 實驗方法

1.3.1 離體卵巢收集 綿羊被屠宰后30 min 內(nèi)將卵巢無菌采集，放置于20～25℃的卵巢保存液中，2～4 h 內(nèi)帶回試驗室。為防止卵巢被污染，浸泡卵巢的生理鹽水中應加入青霉素、鏈霉素。

1.3.2 卵母細胞采集 本實驗采用抽吸法進行卵母細胞收集。用帶有21 G 針頭的10 mL 注射器在卵巢上抽吸2～6 mm 卵泡并在抽吸前吸取2 mL 采卵液，從而將卵母細胞吸出流入采卵液。

1.3.3 卵母細胞選擇 將采卵液注入培養(yǎng)皿，在體視顯微鏡下?lián)斐鰩в新亚鸺毎穆炎?，通常選擇A、B 級卵母細胞進行成熟培養(yǎng)。A 級卵母細胞要求有3 層以上卵丘細胞緊密包圍，而且A 級的卵丘細胞擴張充分；B 級要求卵母細胞質(zhì)均勻，卵丘細胞低于3 層或部分包圍卵母細胞。

1.3.4 卵母細胞的成熟培養(yǎng) 培養(yǎng)溫度為38.5℃時卵母細胞的成熟率最高，體外培養(yǎng)時間以24 h 為宜。二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)卵母細胞，氣相環(huán)境：5%CO2、95%空氣、100%濕度。判斷卵母細胞是否成熟主要依據(jù)卵丘細胞是否擴散并排出第一極體。

1.3.5 觀察卵丘細胞擴展情況 采用口吸管將培養(yǎng)卵丘卵母細胞復合體（COCs）后的液滴輕輕吸凈，使COCs 整體充分平鋪于皿底，以便觀察拍照，石蠟油保持不動。卵丘擴展級數(shù)的判斷引用Vanderhyden[10]的分級方法。并把G3、G4 級擴展定為卵丘擴展狀態(tài)，G1、G2 級擴展及其他形態(tài)（COCs 收縮成團或己經(jīng)脫落）定為卵丘未擴展狀態(tài)。

1.3.6 觀察第一極體排出情況 IVM 24 h 后將成熟卵母細胞移到0.1%透明質(zhì)酸酶中，移液槍反復吹打，使卵母細胞成為裸卵，在體視鏡下觀察卵母細胞第一極體排出情況，記錄排出第一極體的卵母細胞數(shù)。

1.3.7 抗氧化指標測定 成熟24 h 后收集培養(yǎng)基，利用超氧化物歧化酶（SOD）酶活力檢測試劑盒測定SOD總活力；利用谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）酶活力檢測試劑盒測定GSH-Px 總活力；利用丙二醛（MDA）檢測試劑盒測定MDA 含量。試劑盒購自南京建成生物工程研究所，測定步驟嚴格按試劑盒說明書進行。通過公式計算被測樣品中MDA 含量及 SOD、GSH-Px 活力。

1.4 實驗設計

1.4.1 添加不同濃度ALA 對體外成熟綿羊卵丘擴展和卵母細胞核成熟的影響 使用含有不同濃度ALA（0、10、50、100、200 μmol/L）的IVM 培養(yǎng)基孵育綿羊卵母細胞24 h，并觀察卵丘擴展情況，統(tǒng)計第一極體排除情況。將COCs 隨機分配到5 個組中，分別進行3 次重復。

1.4.2 添加不同濃度ALA 對體外成熟綿羊卵母細胞培養(yǎng)基SOD 和GSH-Px 活力以及MDA 含量的影響 使用含有不同濃度ALA（0、10、50、100、200 μmol/L）的IVM 培養(yǎng)基孵育綿羊卵母細胞24 h，收集培養(yǎng)基并保存在-20℃以供后續(xù)測定。將COCs 隨機分配到5 個組中，每個指標測定分別進行3 次重復。

1.5 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)處理使用SPSS 21.0 統(tǒng)計學軟件包。以平均數(shù)±標準差或百分率表示不同類型數(shù)據(jù)。多組比較滿足正態(tài)性和方差齊性的采用單因素方差分析，不滿足則采用K 個獨立樣本檢驗或Kruskal-Wallis 秩和檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 添加不同濃度ALA 對綿羊體外成熟卵丘擴展和卵母細胞核成熟的影響 如表1 和圖1 所示，添加50、100 μmol/L ALA 卵丘擴展率較對照組增加（P＜0.05），而添加200 μmol/L ALA 具有抑制卵丘擴展的趨勢。與對照組相比，100 μmol/L ALA 組觀察到核成熟率增加（P＜0.05），添加200 μmol/L ALA 具有抑制細胞核成熟的趨勢。添加100 μmol/L ALA 較添加50 μmol/L ALA 更能促進綿羊卵丘擴展和卵母細胞核成熟。由此可知，添加100 μmol/L ALA 可以促進綿羊體外成熟后的卵丘擴展和核成熟。

2.2 添加不同濃度ALA 對綿羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)基SOD 和GSH-Px 活力及MDA 含量的影響 如表2 所示，與對照組相比，添加100 μmol/L ALA 的培養(yǎng)基SOD 活力增加（P＜0.05）；添加100 μmol/L ALA 可以增加培養(yǎng)基GSH-Px 活力（P＞0.05）；添加50、100 μmol/L ALA可降低MDA 含量（P＜0.05）。由此推出，綿羊卵母細胞成熟培養(yǎng)基添加100 μmol/L ALA 可以起到抗氧化作用，改善綿羊卵母細胞發(fā)育的微環(huán)境，從而能提高卵母細胞的核成熟率。

表1 不同濃度ALA 對綿羊卵丘細胞擴展和卵母細胞核成熟的影響

圖1 體外成熟24 h 后綿羊卵丘擴展狀態(tài)（4×10）及排出第一極體的核成熟卵母細胞（10×10）

表2 不同濃度ALA 對綿羊卵母細胞成熟培養(yǎng)基酶活力和MDA 含量的影響

3 討 論

Veshkini 等[6]通過氣相色譜法測定小卵泡和大卵泡卵泡液中ALA 平均濃度分 別為75.4、125.7 μmol/L。本實驗結果表明，在IVM 無血清培養(yǎng)基中添加100 μmol/L ALA 可以促進綿羊卵母細胞的卵丘擴展和核成熟，而200 μmol/L ALA 可能抑制卵丘擴展和核成熟，這種促進作用與成熟培養(yǎng)基抗氧化能力的增強有關。

本實驗中，添加100 μmol/L ALA 顯著促進綿羊卵母細胞的核成熟。Veshkini 等[6]實驗表明，添加100 μmol/L ALA具有促進綿羊卵母細胞核成熟的趨勢；Ghaffarilaleh 等[2]在3 月齡羔綿羊上的實驗也證明，添加50 μmol/L ALA（羔羊卵泡液ALA 生理濃度范圍為22.7～40.8 μmol/L）d并不能顯著促進核成熟。但Veshkini 等[6]和Ghaffarilaleh 等[2]的實驗均表明，添加200 μmol/L ALA 會顯著抑制細胞核成熟。Marei 等[1,3]、鄭海英等[8]研究表明，添加50 μmol/L ALA顯著促進牛卵母細胞的核成熟，Marei 等[1]還發(fā)現(xiàn)添加100、200 μmol/L ALA 可造成牛卵母細胞核成熟率的顯著降低以及核成熟顯著異常。這與本實驗添加100 μmol/L ALA促進綿羊核成熟的實驗結果形成了濃度差異，可能是由于ALA 在牛羊卵泡液里生理濃度范圍不同導致的，在牛卵泡液中ALA 濃度為35.9～71.8 μmol/L[11]。Marei 等[1]認為，添加100 μmol/L 和200 μmol/L ALA 抑制核成熟的現(xiàn)象可能與抑制卵丘擴展有關，這也與本實驗中添加200 μmol/L ALA 抑制綿羊卵丘細胞擴展的趨勢相一致。

ROS 是由線粒體形成的氧衍生分子并作為細胞代謝的中間產(chǎn)物。高水平ROS 會誘導氧化應激導致線粒體內(nèi)膜電位的降低、紡錘體的破壞和細胞質(zhì)三磷酸腺苷（ATP）水平的降低[12]。線粒體內(nèi)膜電位的大小決定氧化代謝水平和ATP 產(chǎn)生水平，并且與胚胎發(fā)育密切相關[13]。卵母細胞成熟過程中的許多事件依賴于ATP的產(chǎn)生，包括細胞骨架的重排、GVBD 和核成熟[14]。即高水平的ROS 會影響卵母細胞的成熟，ROS 水平降低可改善卵母細胞成熟。ROS 水平受內(nèi)源抗氧化酶如SOD、GSH-Px、過氧化氫酶（CAT）[15]和外源抗氧化劑的調(diào)節(jié)。本實驗得出，ALA 可以通過促進SOD 酶活力和降低脂質(zhì)過氧化起到抗氧化作用，這也與孫麗君等[4]在人卵母細胞上的結果相一致。為了驗證ALA 在培養(yǎng)基中的抗氧化作用是否可以促進胞質(zhì)成熟，需要檢測細胞質(zhì)里ROS 水平以及內(nèi)源抗氧化劑GSH 水平，這也是本研究下一步的補充內(nèi)容。

4 結 論

綿羊卵母細胞成熟培養(yǎng)基添加100 μmol/L ALA 可以起到抗氧化作用，明顯改善綿羊卵母細胞發(fā)育的微環(huán)境，顯著提高綿羊卵母細胞的卵丘擴展和核成熟率。