李叢艷，梅秀麗，鄺良德，李 娟，雷 岷，郭志強(qiáng)，張翠霞，謝曉紅*

(1.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都 610066；2.動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610066；3.成都市農(nóng)林科學(xué)院畜牧研究所，四川成都 611130)

熱休克因子（Heat Shock Factor，HSFs）是調(diào)控?zé)嵝菘说鞍祝℉eat Shock Protein，HSFs）最重要的轉(zhuǎn)錄因子，它通過與HSPs 基因啟動(dòng)子區(qū)的熱休克元件（HSE）結(jié)合，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)HSPs 的表達(dá)[1]。不同的熱休克因子在不同組織中表達(dá)，其結(jié)構(gòu)很相似，但功能上有著不同程度的差異。HSF1 是動(dòng)物體內(nèi)最具代表性也是最重要的HSFs，在進(jìn)化中高度保守并存在于各個(gè)物種中，在熱應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)HSFs 的表達(dá)中發(fā)揮著重要作用[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)HSF1 上多個(gè)SNPs 位點(diǎn)與牛的耐熱性有關(guān)[4-7]。HSF4通過剪切變異體促進(jìn)或抑制HSPs 的表達(dá)，從而調(diào)控?zé)嵝菘朔磻?yīng)的動(dòng)態(tài)平衡[8]，其他HSFs（HSF2、HSF3、HSF5）具有物種特異性，針對(duì)不同的組織或在不同條件下激活[9-12]。

肉兔全身被毛且汗腺較少，夏季高溫時(shí)非常容易出現(xiàn)熱應(yīng)激，嚴(yán)重影響其生長(zhǎng)速度、繁殖性能以及抗病力等[13]，因此培育在高溫環(huán)境條件下仍能維持高生產(chǎn)水平的抗熱應(yīng)激肉兔群體是育種者的長(zhǎng)期目標(biāo)。四川白兔和閩西南黑兔是在我國(guó)（中）亞熱帶氣候下長(zhǎng)期選擇形成的地方品種，對(duì)高溫高濕環(huán)境具有自然耐受性；齊興肉兔含有四川白兔血緣，耐熱性較好；齊卡巨型兔為引進(jìn)的大型肉兔品種，耐熱性差；加利福尼亞兔為中型肉兔品種，耐熱性能優(yōu)于齊卡巨型兔。本研究以上述5 個(gè)耐熱性能差異較大肉兔品種（系）為對(duì)象，采用DNA混池重測(cè)序和直接測(cè)序技術(shù)，對(duì)HSF1 和HSF4 基因進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)和群體遺傳學(xué)分析，以期為篩選耐熱相關(guān)分子標(biāo)記、開展耐熱肉兔品種培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)選擇齊卡巨型兔、齊興肉兔、加利福尼亞兔、四川白兔以及閩西南黑兔各30 只（公、母各半），共計(jì)150 個(gè)個(gè)體，采集5 g 左右耳組織樣品，置于裝有干冰的采樣箱帶回實(shí)驗(yàn)室，-20℃冰箱凍存?zhèn)溆?。其中齊卡巨型兔、齊興肉兔以及加利福尼亞兔來源于四川省畜牧科學(xué)研究院種兔場(chǎng)，四川白兔來源于國(guó)家級(jí)四川白兔保種場(chǎng)成都鼎鑫兔業(yè)有限責(zé)任公司種兔場(chǎng)，閩西南黑兔來源于安岳晨陽兔業(yè)有限公司。

1.2 基因組DNA 提取 按照動(dòng)物組織樣DNA 提取試劑盒說明書提取樣品中的DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其OD 值，根據(jù)測(cè)量的濃度將樣本稀釋到50～100 ng/μL，-20℃保存以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作。

1.3 DNA 池重測(cè)序篩選SNPs 以齊卡巨型兔、齊興肉兔以及加利福尼亞兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，運(yùn)用DNA 混池重測(cè)序技術(shù)篩選SNPs，每個(gè)品種選擇10 個(gè)樣本進(jìn)行混池。測(cè)序深度為30，篩選的SNP 位點(diǎn)測(cè)序深度大于40。通過與NCBI 上家兔基因組對(duì)比，定位HSF1 和HSF4 基因序列，分析SNPs 位點(diǎn)，選擇錯(cuò)義突變位點(diǎn)重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行基因分型。

1.4 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)篩選獲得的HSF1 和HSF4 基因突變位置，以及GenBank 中提供的家兔HSF1（基因登錄號(hào)：NW_003160976.1）和HSF4（基因登錄號(hào)：NC_013673.1）基因序列，利用Primer Premier 5 設(shè)計(jì)特異性引物，送至上海生工生物工程股份有限公司合成。由于HSF1 上篩選出的3 個(gè)SNPs 位點(diǎn)間距離較短，因此設(shè)計(jì)1 對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物信息見表1。

1.5 PCR 擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：DNA 模板（50 ng/μL）1 μL，上、下游引物（10 μmol/μL）各1 μL，2×Taq Master Mix（1.5 mmol/L）10 μL，ddH2O 7 μL。PCR 反應(yīng)擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35 次；72℃延伸7 min，4℃保存。110 V條件下，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳30 min。

1.6 測(cè)序 利用ABI 3730XL 測(cè)序儀采用雙脫氧鏈末端終止法對(duì)5 個(gè)群體150 個(gè)個(gè)體的PCR 擴(kuò)增結(jié)果直接進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行個(gè)體基因分型。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 基因型頻率和基因頻率采用基因直接計(jì)數(shù)法計(jì)算；有效等位基因數(shù)（Ne）、基因雜合度（He）、基因純合度（Ho）和多態(tài)信息含量（PIC）以及Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)的檢驗(yàn)采用PopGene 軟件進(jìn)行分析；應(yīng)用Haploview 軟件進(jìn)行連鎖不平衡（LD）和單倍型分析；不同群體的基因（型）和單倍型（組合）分布采用SPSS 17.0 進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 SNPs 的確定 3 個(gè)DNA 池重測(cè)序結(jié)果（表2）發(fā)現(xiàn)，HSF1 基因及其上、下游序列有32 個(gè)單堿基突變位點(diǎn)和8 個(gè)插入/缺失突變位點(diǎn)，其中有2 個(gè)單堿基突變及1 個(gè)插入/缺失位點(diǎn)位于基因外顯子區(qū)，導(dǎo)致了錯(cuò)義突變；HSF4 基因及其上、下游序列有11 個(gè)單堿基突變位點(diǎn)和3 個(gè)插入/缺失突變位點(diǎn)，其中有1 個(gè)單堿基突變位于外顯子上，引起錯(cuò)義突變。

2.2 PCR 產(chǎn)物測(cè)序 個(gè)體的PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果見圖1。150 個(gè)個(gè)體中檢測(cè)到3 個(gè)SNPs 位點(diǎn)，分別為SNP1、SNP2 以及SNP4。SNP3 為假陽性SNP 位點(diǎn)，在群體中未發(fā)現(xiàn)多態(tài)，均為正常CCT 序列（正常序列為連續(xù)4 個(gè)CCT，缺失序列為連續(xù)3 個(gè)CCT），未出現(xiàn)缺失（表2，圖1）。

2.3 HSFs 基因的遺傳多態(tài)性分析 HSFs 基因的遺傳多態(tài)性分型結(jié)果見表3～4。3 個(gè)SNPs 位點(diǎn)的基因型和基因分布在5 個(gè)群體中均存在顯著（P＜0.05）或極顯著差異（P＜0.01），SNP1 在群體的基因型頻率與耐熱性高低呈現(xiàn)互相對(duì)應(yīng)關(guān)系，而SNP2 和SNP4 無明顯規(guī)律可循。地方品種四川白兔和閩西南黑兔在SNP1 中無多態(tài)，均為GG 純合體，在SNP2 和SNP4 中均呈現(xiàn)中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），且為哈- 溫平衡群體（P＞0.05）。齊興肉兔和加利福尼亞兔含有全部3 個(gè)SNPs，均呈中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），除齊興肉兔在SNP1、SNP2中表現(xiàn)為哈- 溫不平衡群體外（P＜0.05），其余均表現(xiàn)為哈- 溫平衡群體（P＞0.05），2 個(gè)群體在SNP1 優(yōu)勢(shì)基因型為GG，齊興肉兔的GG 型頻率高于加利福尼亞兔。齊卡巨型兔在3 個(gè)SNPs 上均表現(xiàn)中度多態(tài)性（0.25＜PIC＜0.5），且為哈- 溫平衡群體（P＞0.05），其在SNP1 上的優(yōu)勢(shì)基因型為GA。

表1 PCR 擴(kuò)增引物序列

表2 DNA 池重測(cè)序結(jié)果重要SNPs 信息

圖1 SNPs 測(cè)序結(jié)果

表3 5 個(gè)肉兔品種（系）HSFs 基因的基因型頻率和基因頻率

2.4 連鎖不平衡和單倍型分析 利用Haploview 軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析（表5，圖2），結(jié)果表明，SNP1 與SNP2 處于完全連鎖不平衡（complete LD）（LOD=12.87，D'=1，r2=0.201），2 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)共組成了CG、CA、TG 3 種單倍型；SNP1 與SNP4（LOD=1.23，D'=0.403，r2=0.028）以及SNP2 與SNP4 間（LOD=0.03，D'=0.032，r2=0.001）連鎖的可能性極小。

表4 5 個(gè)肉兔品種（系）HSFs 基因的多態(tài)性分析

表5 肉兔HSFs 基因的連鎖不平衡

圖2 單倍型塊圖

對(duì)5 個(gè)肉兔群體構(gòu)建單倍型，共得到3 種單倍型（表6）。在地方品種四川白兔和閩西南黑兔中只存在H1 和H3 2 種單倍型，優(yōu)勢(shì)單倍型均為H3；齊卡巨型兔中包含所有單倍型，其優(yōu)勢(shì)單倍型為H2；齊興肉兔和加利福尼亞兔中包含所有3 種單倍型，其優(yōu)勢(shì)單倍型均為H3。

表6 單倍型統(tǒng)計(jì)分析

3 討 論

本研究利用DNA 池重測(cè)序技術(shù)檢測(cè)HSF1 和HSF4 的重要SNPs 位點(diǎn)，結(jié)果在2 個(gè)基因及其上、下游共檢出54 個(gè)SNPs，選擇其中4 個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)進(jìn)行一代測(cè)序分型，發(fā)現(xiàn)其中3 個(gè)SNPs 表現(xiàn)出預(yù)期多態(tài)，而SNP3（缺失突變）并未表現(xiàn)出預(yù)期多態(tài)，推測(cè)該位點(diǎn)可能是一個(gè)假陽性SNP。趙冰茹等[14]采用DNA 混池重測(cè)序時(shí)也發(fā)現(xiàn)細(xì)毛羊LAMB1 基因10 個(gè)錯(cuò)義突變中有3 個(gè)假陽性SNPs，推測(cè)可能是由于重測(cè)序技術(shù)的堿基偏好性使得個(gè)別SNP 測(cè)序時(shí)的覆蓋率不高，或由于二代測(cè)序讀長(zhǎng)較短，進(jìn)而造成后續(xù)序列拼接、組裝等生物信息學(xué)分析困難。因此，盡管DNA 池重測(cè)序篩查的SNP 位點(diǎn)的準(zhǔn)確性較高，但仍需要采用其他方法進(jìn)行驗(yàn)證。

HSF1 是HSFs 家族中最重要的一員。Hong 等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在溫度不斷升高的條件下，哺乳動(dòng)物細(xì)胞通過激活HSF1 使HSFs 表達(dá)量增加，充分表明了HSF1在動(dòng)物的熱應(yīng)激反應(yīng)中具有重要作用。有鑒于此，國(guó)內(nèi)外多個(gè)研究者對(duì)HSF1 基因與耐熱的關(guān)系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其與牛的耐熱性有關(guān)。Li 等[6-7]發(fā)現(xiàn)，HSF1基因的T909C 和G4693T 突變及其構(gòu)建的單倍型與中國(guó)荷斯坦奶牛的耐熱性能有關(guān)，4 年后Li 等[15]在3′-UTR 區(qū)域新發(fā)現(xiàn)1 個(gè)SNP 位點(diǎn)，并進(jìn)一步證實(shí)了之前變異位點(diǎn)是重要的耐熱性分子標(biāo)記；王延久等[5]發(fā)現(xiàn)，HSF1 基因第3 內(nèi)含子中存在1 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，在耐熱性能不佳的荷斯坦奶牛、耐熱性能好的魯西黃牛和渤海黑牛的群體中分布差異較大，推測(cè)其可能與耐熱性有關(guān)；Baena 等[4]也發(fā)現(xiàn)，HSF1 上的多態(tài)位點(diǎn)與安格斯牛的耐熱性有關(guān)。本研究在家兔HSF1 基因外顯子8 上發(fā)現(xiàn)的SNP1 和SNP2 均造成了氨基酸突變，且位于該基因4 個(gè)可變剪切體的共有序列內(nèi)，單倍型分析發(fā)現(xiàn)它們呈完全連鎖狀態(tài)（D'=1）。5 個(gè)群體在SNP1 上的GG 基因型頻率大小及耐熱性能均表現(xiàn)為四川白兔= 閩西南黑兔＞齊興肉兔＞加利福尼亞兔＞齊卡巨型兔，說明SNP1 的GG 基因型可能對(duì)兔耐熱性的形成有積極作用，是重要的耐熱性候選分子標(biāo)記，與上述研究結(jié)論一致。SNP2 在5 個(gè)群體的優(yōu)勢(shì)基因型分布并無規(guī)律，因此推測(cè)該位點(diǎn)的變異可能與肉兔的耐熱性無關(guān)。單倍型分析發(fā)現(xiàn)，四川白兔、閩西南黑兔以及耐熱性次之的齊興肉兔和加利福尼亞兔的優(yōu)勢(shì)單倍型均為H3，而耐熱性差的齊卡巨型兔的優(yōu)勢(shì)單倍型為H2，與前面單個(gè)SNPs多態(tài)分析的結(jié)果相符，推測(cè)單倍型H3 可能是肉兔耐熱性的優(yōu)勢(shì)單倍型。

HSF4 在HSFs 中發(fā)現(xiàn)較晚，Tanabe 等[8]研究結(jié)果表明，HSF4 通過可變剪接形成HSF4a 和HSF4b 剪切體，通過抑制和激活熱休克蛋白的表達(dá)，參與熱應(yīng)激的調(diào)節(jié)。此外，HSF4 參與晶狀體的正常發(fā)育，該基因突變是白內(nèi)障產(chǎn)生的重要原因[16-18]。本研究選擇HSF4 作為肉兔耐熱的候選基因，發(fā)現(xiàn)5 個(gè)肉兔群體在HSF4 上基因型分布和基因分布與品種間的耐熱性能高低并無規(guī)律的對(duì)應(yīng)關(guān)系，推測(cè)該位點(diǎn)可能與肉兔的耐熱性無關(guān)。

4 結(jié) 論

本研究表明，肉兔HSF1 基因中SNP1 的基因型GG 及單倍型H3 可能與肉兔的耐熱性有關(guān)。下一步應(yīng)檢測(cè)不同基因（單倍）型個(gè)體間HSF1 基因表達(dá)量是否存在顯著差異，以對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證，為在生產(chǎn)上應(yīng)用該分子標(biāo)記開展耐熱肉兔新品種培育提供依據(jù)。