姚艷艷,劉心田,常麗榮*,錢浩,王曉輝,車建鋒,李長青
1(威海長青海洋科技股份有限公司,國家海產(chǎn)貝類工程技術(shù)研究中心,山東 榮成,264300) 2(威海市漁業(yè)技術(shù)推廣站,山東 威海,264200)
海帶(LaminariajaponicaAresch)是一種重要食品、肥料、飼料及工業(yè)原料,有著很高的經(jīng)濟價值。據(jù)統(tǒng)計,2017年,我國經(jīng)濟海藻養(yǎng)殖總量達223.5萬t,其中海帶(鮮品)年產(chǎn)量達148.7萬t[1]。而目前國內(nèi)對海帶的加工方式還是以自然曬干、烘干、鹽漬等簡單加工為主,無論哪種方式,都面臨著環(huán)境污染嚴重、高耗能、勞動密集、附加值低等嚴峻問題。
近年來,海帶提取物相關(guān)技術(shù)、產(chǎn)品陸續(xù)涌現(xiàn),尤其是在農(nóng)業(yè)[2]、食品[3]、化妝品[4]、保健品[5]、醫(yī)藥[6]等領(lǐng)域表現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。工業(yè)上,海帶的提取加工方法主要有化學(xué)法、物理法、生物法等[7-8]?;瘜W(xué)法和物理法存在能耗高、污染環(huán)境的缺點;而生物發(fā)酵降解技術(shù)是利用微生物產(chǎn)生的褐藻膠裂解酶、纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等來降解藻體,是海帶提取加工產(chǎn)業(yè)的創(chuàng)新應(yīng)用,具有反應(yīng)條件溫和、節(jié)約能耗、綠色環(huán)保等特點,是海帶及其他經(jīng)濟海藻提取加工的新技術(shù)。目前,國內(nèi)外對海帶的生物降解方法仍以生物酶解技術(shù)為主[9-10],存在降解得率低、資源浪費大、酶制劑成本高等問題。只有少量文獻報道利用復(fù)合菌株對海帶進行發(fā)酵降解[11-12],而已報道的產(chǎn)酶菌株種類較少,且產(chǎn)酶較單一,產(chǎn)酶能力低[13-15],難以滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。
皺紋盤鮑主要以海帶為食,其腸道內(nèi)含有多種益生菌及產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株[16-18],但從鮑魚腸道內(nèi)篩選應(yīng)用于降解海帶的微生物尚未見報道。本試驗從鮑魚腸道中,以篩選產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株為出發(fā)點,進一步篩選能夠?qū)нM行發(fā)酵降解的海洋源菌株,最大程度地提取和利用以褐藻膠為主的海帶有效成分,提高海帶降解得率。
成熟鮑魚:威海長青海洋科技股份有限公司;褐藻膠裂解酶:1 000 U/mL,國家海產(chǎn)貝類工程技術(shù)研究中心;復(fù)合酶:20 000 U/mL,諾維信創(chuàng)新與發(fā)展中心;血液瓊脂基礎(chǔ),脫纖維羊血:青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒:寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。
褐藻酸鈉,MgSO4·7H2O,F(xiàn)eSO4·7H2O,(NH4)2SO4,KH2PO4,K2HPO4,蛋白胨,酵母粉,可溶性淀粉,F(xiàn)ePO4,KCl,CuSO4,MgCl2:分析純,國藥化學(xué)試劑有限公司。
AL104分析天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;L535-1低速離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;UV2800S紫外分光光度計,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司,HFsafe-1200生物安全柜,上海力申科學(xué)儀器有限公司;DHZ大容量恒溫振蕩培養(yǎng)箱,上海精宏實驗設(shè)備有限公司;SHP-250型生化培養(yǎng)箱,上海森信實驗儀器有限公司;STTIK高壓滅菌鍋,施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司;BIOER XP基因擴增儀,杭州博日科技有限公司;SC80S凝膠成像系統(tǒng),上海山富科學(xué)儀器有限公司。
富集培養(yǎng)基:褐藻酸鈉5 g,蛋白胨2 g,MgSO4·7H2O 0.01 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5 g,過濾海水1 000 mL,調(diào)節(jié)初始pH至7.2,121 ℃滅菌20 min。
篩選培養(yǎng)基:褐藻酸鈉5 g,(NH4)2SO42 g,KH2PO43 g,K2HPO47 g,NaCl 30 g,MgSO4·7H2O 0.1 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 000 mL,調(diào)節(jié)初始pH至7.0,121 ℃滅菌20 min。
液體發(fā)酵培養(yǎng)基:見參考文獻[19]。
血平板:配制100 mL的血液瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基于121 ℃滅菌15 min,冷卻至50 ℃,無菌操作加入10 mL無菌的脫纖維羊血,搖勻,傾注平板,凝固后,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
蛋白酶培養(yǎng)基:脫脂奶粉30 g,瓊脂15 g,陳海水1 000 mL,調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH至7.6,121 ℃滅菌20 min。
淀粉酶培養(yǎng)基、纖維素酶培養(yǎng)基:見參考文獻[20]。
1.4.1 菌種富集及初篩
取鮮活的鮑魚腸道作為實驗樣品,用研缽研磨后,加入裝有100 mL富集培養(yǎng)基的三角燒瓶中,于25 ℃下富集培養(yǎng)16 h,將富集后的樣品梯度稀釋至10-4,取各梯度下樣品100 μL涂布篩選培養(yǎng)基,25 ℃下培養(yǎng)2~5 d。
1.4.2 溶血素的產(chǎn)生
將2216E培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)的待測菌株點種于血平板上,25 ℃培養(yǎng)24 h,根據(jù)菌落周圍的溶血圈情況,來判斷溶血素的產(chǎn)生。
1.4.3 產(chǎn)酶能力篩選
用接種環(huán)挑取純化后的菌株單菌落,分別點種于蛋白酶培養(yǎng)基、淀粉酶培養(yǎng)基和纖維素酶培養(yǎng)基,25 ℃培養(yǎng)24~48 h。菌落周圍產(chǎn)生透明圈的菌株為陽性,不產(chǎn)透明圈的菌株為陰性。
淀粉酶培養(yǎng)基顯色:輕輕刮下菌苔,用蒸餾水或1 mol/L NaCl溶液沖洗培養(yǎng)基表面,用盧戈氏碘液染色5 min。
纖維素酶培養(yǎng)基顯色:輕輕刮下菌苔,用蒸餾水或1 mol/L NaCl溶液沖洗培養(yǎng)基表面,用0.1%剛果紅染液染色30 min,再用1 mol/L NaCl溶液洗脫1~2次,每次浸泡20 min。
1.5.1 菌株菌落形態(tài)觀察
菌株在篩選平板上25 ℃培養(yǎng)48 h后,觀察平板上菌落形態(tài),并進行革蘭氏染色,觀察細菌形態(tài)。
1.5.2 16S rRNA分子鑒定
以提取菌株的總DNA為模板,以27F和1 492R為引物[21],進行Touchdown-PCR擴增反應(yīng),反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,60 ℃下退火30 s,72 ℃延伸1 min 30 s,每個循環(huán)降低1 ℃,共進行15個循環(huán);再進行94 ℃變性30 s,45 ℃下退火30 s,72℃延伸1 min 30 s,共進行25個循環(huán);最后在72 ℃下延伸10 min。凝膠回收目的片段后,送樣測序。
將得到的測序結(jié)果在EzBioCloud網(wǎng)站上進行序列比對,并找出與之同源性接近的不同菌株序列,應(yīng)用MeGA 5.0軟件進行聚類與同源性分析。遵循鄰接法(neighbor-joining method)原則,并通過自舉分析(boostrap)進行置信度檢測,自舉數(shù)據(jù)集為1 000次,構(gòu)建分支系統(tǒng)發(fā)育樹。
25 mL比色管中加入2 mL含1.5% NaCl的0.5% 褐藻酸鈉溶液,在30 ℃水浴中放置10 min,再加入10~100 μL酶液,振蕩混勻后于30 ℃水浴中反應(yīng)30 min,加入3 mL DNS試劑混勻,沸水浴5 min后立即冷卻至室溫,定容至25 mL,在540 nm處檢測光吸收值。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準曲線確定產(chǎn)生還原糖的量。酶活力單位定義為:30 ℃下每分鐘產(chǎn)生1 μg的還原糖所需要的酶量。發(fā)酵液酶活力定義為:1 mL發(fā)酵液含酶活單位(U/mL)。
在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中接種3次傳代后的菌株,在預(yù)實驗最佳的培養(yǎng)條件下培養(yǎng),在菌株生長過程中每間隔5 h取樣1次,測定發(fā)酵液的OD600值及酶活力值大小,繪制出菌株的生長和產(chǎn)酶曲線。
利用硫酸銨分級鹽析法制備粗酶,并用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)溶解。
最適溫度的測定:在25、30、35、40、45、50 ℃下測定酶活力,其中底物濃度5‰,反應(yīng)pH 7.0。
最適pH的測定:在pH 6.5、6.8、7.0、7.3、7.5、8.0、8.5下測定酶活力,其中底物濃度5‰,酶解溫度是35 ℃。
金屬離子對酶活力的影響:在反應(yīng)體系中加入K+(KCl)、Fe2+(FeSO4·7H2O)、Cu2+(CuSO4)、Na+(NaCl)、Mg2+(MgCl2)、Ca2+(CaCl2)下測定酶活力,其中底物濃度5‰,酶解溫度是35 ℃,反應(yīng)pH 7.5。
選取100目海帶粉,海帶粉與水的料液質(zhì)量比為1∶12,在菌株產(chǎn)生的褐藻膠裂解酶最佳酶解條件下,利用菌株發(fā)酵液、褐藻膠裂解酶、復(fù)合酶對海帶發(fā)酵降解6 h,并計算海帶降解得率。
海帶降解得率是指干海帶發(fā)酵后溶于水中的可溶性固形物占干海帶的百分含量,按公式(1)計算:
(1)
式中:w,海帶發(fā)酵得率,%;c,海帶發(fā)酵上清液的可溶性固形物的百分含量,%;m,發(fā)酵后所得海帶發(fā)酵上清液質(zhì)量,g;m0,發(fā)酵用的干海帶質(zhì)量,g。
通過以褐藻酸鈉為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基初篩,從鮑魚腸道中篩選得到100多株菌,其中有12株是產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株,通過搖床振蕩發(fā)酵培養(yǎng),測定不同菌株發(fā)酵上清液的酶活力大小,結(jié)果如表1所示。其中YY7菌株的酶活力最高,且經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)后,其遺傳穩(wěn)定性及產(chǎn)酶活力穩(wěn)定,因此,將此菌株進行菌種鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究。
表1 不同菌株產(chǎn)褐藻膠裂解酶活力對比Table 1 The alginate lyase activity in different strains
菌株YY7在篩選平板上培養(yǎng)48 h后,菌體周圍產(chǎn)生明顯水解透明圈,單菌落呈現(xiàn)不透明圓形,邊緣整齊,顏色微白,直徑約1.5 mm,邊緣整齊,表面光滑、濕潤,稍有隆起,顯微鏡下觀察為彎桿狀,革蘭氏陰性菌。
通過分子生物學(xué)手段,鑒定菌株YY7的16S rRNA基因序列為1 476 bp,在EzBioCloud網(wǎng)站上經(jīng)過序列比對,發(fā)現(xiàn)其16S rRNA與弧菌屬Vibrioalgivorus的SA2(T)菌株的相似性最高,為99.72%,依據(jù)16S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹聚類分析(圖1),結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征觀察,初步鑒定為弧菌屬菌株,并命名為Vibriosp. YY7。
圖1 YY7菌株的16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequenceof YY7 stains
將YY7菌株點種于血平板上培養(yǎng),并沒有產(chǎn)生溶血現(xiàn)象,表明YY7菌株不具有潛在致病性。通過其他培養(yǎng)基鑒定YY7菌株的產(chǎn)酶情況后,發(fā)現(xiàn)YY7菌株在蛋白酶培養(yǎng)基(圖2-a)和淀粉酶培養(yǎng)基(圖2-b)上均有透明圈,說明菌株YY7還具有蛋白酶和淀粉酶活性。水產(chǎn)動物益生菌的篩選大多通過體外篩選產(chǎn)酶菌株獲得[22],因此推斷YY7菌株可能是鮑腸道內(nèi)的潛在益生菌。
a-蛋白酶培養(yǎng)基; b-淀粉酶培養(yǎng)基圖2 YY7菌株在蛋白酶培養(yǎng)基和淀粉酶培養(yǎng)基的產(chǎn)酶情況Fig.2 The enzyme production of YY7 strains on protease medium and amylase medium
對YY7菌株進行生物量監(jiān)測和產(chǎn)褐藻膠裂解酶曲線的繪制,如圖3。由圖3可見,菌體的生長隨時間的延長逐漸升高,在18 h后開始進入穩(wěn)定生長期,菌株生物量接近最大值,酶活力在20 h達到最高值,為54.31 U/mL,與已報道的弧菌Vibriosp. QY107[14]、Vibriosp. SS-1[18]等菌株相比,菌株YY7的發(fā)酵產(chǎn)酶周期更短,生產(chǎn)速度較快,在工業(yè)化生產(chǎn)中,極大縮短了發(fā)酵時間,從而降低雜菌污染的風(fēng)險,節(jié)約了生產(chǎn)成本,具有極大的生產(chǎn)優(yōu)勢。
圖3 YY7菌株的生長曲線及酶活力曲線Fig.3 Growth curve and enzyme activity curve of YY7 strains
2.4.1 褐藻膠裂解酶最適反應(yīng)溫度的確定
將酶反應(yīng)體系分別置于25、30、35、40、45、50 ℃的水浴中反應(yīng),測定不同溫度下褐藻膠裂解酶的活力,結(jié)果見圖4。從圖4可以看出,隨著溫度升高,酶活力逐漸升高,35 ℃達到最高值,40 ℃時酶活力略有降低,之后溫度越高,酶活力逐漸降低,可能是溫度越高,對酶的破壞越大,從而活力逐漸降低。故該酶的最適反應(yīng)溫度為35 ℃。
圖4 溫度對酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on enzyme activity
2.4.2 褐藻膠裂解酶最適pH確定
酶解反應(yīng)體系中pH是影響酶的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的重要因素,同時也影響底物和酶的解離狀態(tài)[23]。為探究反應(yīng)體系pH對褐藻膠裂解酶活力的影響,選取pH 6.5、6.8、7.0、7.3、7.5、8.0、8.5七個梯度進行酶活力測定,結(jié)果見圖5。由圖5可知,褐藻膠裂解酶活力隨著體系pH的增大呈現(xiàn)先增大后減小趨勢,在pH 7.5附近達到最大值,繼續(xù)增大pH,褐藻膠裂解酶活力反而下降,可能是堿性環(huán)境影響了酶與底物的結(jié)合,也可能是在堿性環(huán)境下酶蛋白的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性都遭到了破壞。因此該酶的最適反應(yīng)pH為7.5。
圖5 pH對酶活力的影響Fig.5 Effect of pH on enzyme activity
2.4.3 金屬離子對褐藻膠裂解酶酶解反應(yīng)的影響
選取5種金屬離子研究它們對褐藻膠裂解酶活力的影響,結(jié)果見圖6。從圖6可以看出Na+、Mg2+、K+、Ca2+對酶活力都有不同程度的促進作用,此結(jié)果與李麗妍[24]的結(jié)果一致,各金屬離子對酶活力的促進作用由高到低依次為Na+>Mg2+>K+>Ca2+,Na+對酶活力的促進作用最大,可能與產(chǎn)酶菌株來自高鹽的海洋環(huán)境有關(guān)[24],且褐藻膠裂解酶對Na+的依賴性較高[25]。而Fe2+和Cu2+對褐藻膠裂解酶活力起抑制作用。因此,在褐藻膠裂解酶的應(yīng)用過程中,可以根據(jù)需求在反應(yīng)體系中添加Na+、Mg2+、K+、Ca2+,提高酶活力。
圖6 金屬離子對酶活力的影響Fig.6 Effect of metal ion on enzyme activity
2.5.1 海帶發(fā)酵過程中總糖及還原糖含量變化
海帶粉與水按1∶12比例攪拌均勻,將反應(yīng)體系pH調(diào)至7.5±0.1后,加入1 000 U發(fā)酵液或酶,于35 ℃下酶解6 h。YY7發(fā)酵液降解海帶過程中總糖及還原糖含量的變化情況見圖7。由圖7可見,海帶在酶解發(fā)酵過程中,反應(yīng)體系中的總糖和還原糖含量逐漸升高,這可能與菌株YY7發(fā)酵液中各種酶的作用有關(guān),海帶中褐藻膠、海藻淀粉、海藻多糖等大分子物質(zhì)都有可能被部分降解。
圖7 海帶發(fā)酵過程中總糖及還原糖含量變化Fig.7 Content changes of total sugar and reducing sugar during fermentation of Laminaria japonica Aresch
2.5.2 海帶降解得率對比分析
海帶降解得率反應(yīng)海帶降解效果,海帶降解得率對比見圖8。與褐藻膠裂解酶和復(fù)合酶相比,YY7發(fā)酵液對海帶的降解效果最佳,海帶降解得率可達到65%以上,表明YY7發(fā)酵液對海帶降解具有較好的效果。
圖8 不同酶對海帶降解得率的影響Fig.8 Effect of different enzymes on degradation yield ofLaminaria japonica Aresch
2.5.3 海帶降解前后的顯微結(jié)構(gòu)差異
海帶粉通過YY7發(fā)酵液降解前后,海帶粉的顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化,結(jié)果見圖9。
圖9 海帶粉降解前后的顯微照片F(xiàn)ig.9 Photomicrographs before and after degradation of kelp powder
從圖9中可以看出,海帶粉降解前,海帶的細胞結(jié)構(gòu)較明顯,完整的細胞結(jié)合較緊密;而海帶粉降解后,其細胞結(jié)構(gòu)明顯被降解,完整的細胞也被分散開。這可能是由于海帶粉經(jīng)過YY7菌株產(chǎn)生的褐藻膠裂解酶、蛋白酶、淀粉酶等降解后,細胞間結(jié)合變得松散,細胞壁、細胞膜等組織結(jié)構(gòu)也被部分降解。
從皺紋盤鮑腸道中,以褐藻酸鈉為唯一碳源,篩選出產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株12株,其中酶活力最高的是YY7菌株,通過16S rRNA初步鑒定YY7菌株與弧菌屬Vibrioalgivorus的SA2(T)菌株的相似性最高,為99.72%;通過培養(yǎng)基鑒定發(fā)現(xiàn),YY7菌株不具有溶血性,同時還產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶。根據(jù)YY7菌株的生長曲線和產(chǎn)酶曲線可知,YY7菌株的生長速度快,其褐藻膠裂解酶活力在20 h可達到最高54.31 U/mL,最適溫度為35 ℃,最適pH 7.5,Na+、Mg2+、K+、Ca2+對褐藻膠裂解酶活力具有促進作用,F(xiàn)e2+和Cu2+起抑制作用。最后利用YY7發(fā)酵液對海帶粉進行降解處理發(fā)現(xiàn),海帶降解得率可達65%以上,降解效果佳。本研究結(jié)果表明,該菌株適合應(yīng)用于海帶的加工利用,對于提高海帶利用率具有非常重要的作用。下一步還將繼續(xù)優(yōu)化YY7菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件,并進行放大培養(yǎng),探索其在海帶精深加工的應(yīng)用研究。