李彬彬,宋桂森,全鑫杰,蒲艷,徐曄,牛淑慧,敖曉琳,陳淑娟,何利,劉書亮,楊勇

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,四川 雅安,625014)

生物胺(biogenic amine, BA)是一類具有潛在毒性的生物活性物質(zhì)，食品中BA主要是在微生物氨基酸脫羧酶的作用下將游離的氨基酸脫羧而生成的，因此BA廣泛存在于蛋白質(zhì)豐富的發(fā)酵食品中。適量的BA是人體的活性物質(zhì)[1]，但攝入過量的外源BA則會(huì)危害人體健康[2-7]。面對(duì)發(fā)酵食品生產(chǎn)加工過程中高BA含量的問題，除采取控制前體物水平[8]、抑制產(chǎn)胺微生物生長[9]等措施外，常通過接種不具有氨基酸脫羧酶活性而具有生物胺氧化酶活性的微生物來降低發(fā)酵食品中BA含量，并取得了良好的效果[10-12]。

生物胺氧化酶(amine oxidase, AOs) 是廣泛存在于動(dòng)植物、微生物體內(nèi)的能夠?qū)⒁焉傻腂A分解成相應(yīng)的醛、氨氣和過氧化氫的一類酶[13-14]。AOs作為BA代謝中的關(guān)鍵酶，一直是國內(nèi)外BA降解研究的熱點(diǎn)。AOs主要分為單胺氧化酶(monoamine oxidase, MAO)、二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)和多胺氧化酶(polyamine oxidase，PAO)。MAO多屬于含銅氧化酶，主要氧化酪胺等；DAO主要作用于組胺和腐胺，屬于含銅的氧化酶；PAO是指所有能氧化多胺類物質(zhì)的酶，是催化多胺氧化降解的關(guān)鍵性酶[15-17]。在微生物體內(nèi)，該酶可通過誘導(dǎo)產(chǎn)生，常見的誘導(dǎo)方式主要是在培養(yǎng)基中添加BA或以BA為主要氮源，通過對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化可提升微生物產(chǎn)AOs的能力。周小虎等[18]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以正己胺為誘導(dǎo)氮源時(shí)，黑曲霉FF05產(chǎn)AOs酶活力最高，通過對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)條件的優(yōu)化，酶活力顯著提高。

本研究室前期從四川香腸中篩選出了1株不具有氨基酸脫羧酶活性但具有AOs活性的微生物，經(jīng)鑒定為屎腸球菌Ef2，研究發(fā)現(xiàn)，該菌株對(duì)發(fā)酵香腸中色胺、尸胺和組胺、腐胺均有高效的降解能力[19]。為了更好的利用該菌株，并保證發(fā)酵肉制品的安全性，本研究首先對(duì)該菌株的安全性進(jìn)行檢測，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化該菌株產(chǎn)AOs的培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)條件，為分離和純化該菌株產(chǎn)生的AOs提供了保證，也為深入研究該菌株產(chǎn)生的AOs奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

屎腸球菌Ef2 (Enterococcusfaecium)，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)肉品科學(xué)與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保藏。

金黃色葡萄球菌ATCC 25923 (Staphylococcusaureus)，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 試劑與設(shè)備

辣根過氧化物酶(250 U/mg)、4-氨基安替比林、2.4.6-3溴-3-羥基苯甲酸等，成都康迪生物科技有限公司；細(xì)菌總DNA提取試劑盒、PCR相關(guān)試劑，天根公司；蒸餾水、超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

SW-GJ-1FD超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司；PCR和凝膠成像儀，Bio-Rad； Varioskan flash全波長酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher Science公司； pH S-3C+酸度計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器公司；SCIENTZ-950E超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物科技公司；LHS-250SC恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海榮豐有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制作

種子培養(yǎng)基: MRS液體培養(yǎng)基。

誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基:乳糖 50 g，腐胺 6 g，酵母膏 8 g，MgSO43 g，MnSO40.03 g，K2HPO42 g，乙酸鈉 1.5 g，吐溫-80 1 mL，超純水 1 L，調(diào)節(jié)pH值7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.3.2 屎腸球菌Ef2的安全性評(píng)估

1.3.2.1 溶血實(shí)驗(yàn)

以金黃色葡萄球菌為陽性對(duì)照，用接種環(huán)蘸取活化的菌液，于血平板劃線，37 ℃培養(yǎng)48 h后觀察菌落長出后有無溶血現(xiàn)象。溶血與否按以下進(jìn)行判斷[20]：α-溶血，在菌落周圍由于紅細(xì)胞的不完全破裂形成草綠色溶血環(huán)；β-溶血，由于紅細(xì)胞的完全破裂在菌落形成透明溶血環(huán)；γ-溶血，紅細(xì)胞無損壞，菌落周圍無變化未形成透明溶血環(huán)。選取具有γ-溶血特性的菌株，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2.2 藥敏實(shí)驗(yàn)

采用藥敏片瓊脂擴(kuò)散法[21]進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。所用的藥敏紙片：慶大霉素、鏈霉素、氯霉素、替考拉寧、四環(huán)素、青霉素、紅霉素、利福平、萬古霉素、氨芐西林。

1.3.2.3 耐藥基因的PCR檢測

采用PCR法檢測屎腸球菌Ef2中11種抗生素耐藥相關(guān)基因[22-23]，分別為TEM、aac(6′)/aph2、aph(3′)-Ⅲ、ant(6)-Ⅰ、ermB、TetM、VanA、VanB、mef、ant(2″)-Ⅰ和ant(4′,4″)基因。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性93 ℃、2 min，變性93 ℃、30 s，復(fù)性55 ℃、30 s，延伸72 ℃、1 min，35個(gè)循環(huán)，補(bǔ)充延伸72 ℃、5 min(其中ermB基因按預(yù)變性93 ℃、2 min，變性93 ℃、30 s，復(fù)性37 ℃、90 s，延伸72 ℃、2 min，35個(gè)循環(huán)，補(bǔ)充延伸72 ℃、5 min的條件進(jìn)行)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2.4 毒力基因PCR檢測

擇取7種常見的和公認(rèn)的腸球菌毒力基因，分別為gelE、efaA、ace、asaI、cylA、esp和hyl基因，進(jìn)行PCR擴(kuò)增[24]。PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性94 ℃ 4 min，變性90 ℃ 40 s，復(fù)性58 ℃、30 s，延伸72 ℃、1 min，35個(gè)循環(huán)，補(bǔ)充延伸72 ℃、5 min。PCR反應(yīng)采用25 μL反應(yīng)體系: DNA模板1 μL，premix Taq 10 μL，上/下游引物各 1 μL，ddH2O 12 μL。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化

1.3.3.1 不同氮源及其質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

在誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，分別以質(zhì)量濃度4 g/L的組胺、酪胺、腐胺、尸胺、苯乙胺代替培養(yǎng)基中的氮源，與誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中其他成分混合，接種培養(yǎng)；在確定最佳誘導(dǎo)氮源的培養(yǎng)基中，分別加入0.5、1、2、4、6、8、10 g/L的誘導(dǎo)氮源，接種培養(yǎng)。3個(gè)重復(fù)，測定AOs活性，以確定不同氮源及其質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響。

1.3.3.2 不同碳源及其質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

分別以質(zhì)量濃度20 g/L的葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、麥芽糊精、可溶性淀粉作為碳源，與誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中除碳源以外的成分混合，接種培養(yǎng)；在確定最佳碳源的培養(yǎng)基中，分別加入10、30、50、70、90、100 g/L的碳源，接種培養(yǎng)。3個(gè)重復(fù)，測定AOs活性，以確定不同碳源及其質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響。

1.3.3.3 酵母膏及其質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

在確定最佳碳源、氮源的培養(yǎng)基中，分別加入質(zhì)量濃度0、1、3、5、7、10、15 g/L的酵母膏，接種培養(yǎng)。3個(gè)重復(fù)，測定AOs活性，以確定酵母膏對(duì)產(chǎn)酶的影響。

1.3.3.4 不同金屬離子及其質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

在確定最佳碳源、氮源的培養(yǎng)基中，分別加入乙酸鈉(1、3、5、7、9 g/L)、MgSO4(0.5、1、2、3、4 g/L)、MnSO4(0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 g/L)、CuSO4(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L)、K2HPO4(1、2、3、4、5 g/L)，接種培養(yǎng)，篩選出對(duì)酶活影響較大的幾種無機(jī)鹽，采用L9(33)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，測定AOs活性，以確定不同金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響。

1.3.3.5 誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基成分優(yōu)化的正交實(shí)驗(yàn)

采用L9(33)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)確定的碳源、氮源以及酵母膏質(zhì)量濃度進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

1.3.4 誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.3.4.1 不同初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

在最佳誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，分別選擇初始pH值為5.0～8.0，以每增加0.5為1個(gè)處理。在37 ℃、靜置培養(yǎng)48 h，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，測定AOs活性，以確定最佳的初始pH值。

1.3.4.2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

在最佳誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，最優(yōu)初始pH值條件下，分別在25、28、30、34、37、40 ℃靜置培養(yǎng)48 h，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，測定AOs活性，以確定最佳培養(yǎng)溫度。

1.3.4.3 不同接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

在最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，最優(yōu)初始pH值、培養(yǎng)溫度條件下，分別接種為1%、3%、5%、7%、9%的種子液，靜置培養(yǎng)48 h，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，測定AOs活性，以確定最佳接種量。

1.3.4.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

在最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在最優(yōu)初始pH值、培養(yǎng)溫度、接種量條件下，分別靜置培養(yǎng)12～72 h，以每增加12 h為1個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，測定AOs活性，以確定菌株的最佳產(chǎn)酶時(shí)間。

1.3.4.5 誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)

采用L9(33)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)上述誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)條件進(jìn)行正交優(yōu)化。

1.3.5 AOs粗酶液的提取

將菌株誘導(dǎo)產(chǎn)酶的培養(yǎng)液在4 ℃ 8 000 r/min離心15 min后，獲得菌體，用預(yù)冷的50 mmol/L pH 7.0的磷酸鈉緩沖液沖洗細(xì)胞2次后，懸浮于10倍體積的緩沖液中。加入終濃度為20 mg/mL的溶菌酶，37 ℃處理2 h后，于冰浴下超聲波破碎細(xì)胞(功率60%、超聲時(shí)間30 min、工作時(shí)間6 s)，鏡檢細(xì)胞破碎情況。4 ℃ 8 000 r/min離心15 min去除細(xì)胞碎片，上清液即為粗酶液。

1.3.6 酶活性的測定方法

參考FOSTER的方法[25]，以將體系中AOs替換為胺氧化酶商品酶為陽性對(duì)照。以將體系中AOs替換為磷酸鉀緩沖液為陰性對(duì)照。

酶活單位定義：以每分鐘內(nèi)510 nm吸光值變化0.01為1個(gè)酶活力單位(U)。相對(duì)酶活力以每組實(shí)驗(yàn)中酶活力最高為100%。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 屎腸球菌Ef2安全性檢測結(jié)果

2.1.1 溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果

屎腸球菌Ef2的溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。觀察血平板可知,接種金黃色葡萄球菌菌落周圍形成透明溶血環(huán)，呈β-溶血。接種屎腸球菌Ef2區(qū)域無變化，為γ-溶血，即對(duì)溶血無作用或不溶血[20]，因此可證明屎腸球菌Ef2非溶血菌株。

1-金黃色葡萄球菌; 2-屎腸球菌Ef2圖1 溶血實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果Fig.1 The results of hemolysis test

2.1.2 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1可知：屎腸球菌Ef2對(duì)四環(huán)素、青霉素、紅霉素、利福平、萬古霉素、氨芐西林等大部分抗生素藥物高度敏感，對(duì)替考拉寧中度敏感，對(duì)慶大霉素、鏈霉素和氯霉素不敏感。因此可認(rèn)為屎腸球菌Ef2對(duì)絕大多數(shù)抗生素敏感，具有一定的安全性。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of antibiotics susceptibility test

注：抑菌圈直徑≥15高度敏感(H); 10～14中度敏感(I); <10不敏感(L)。

2.1.3 耐藥基因的PCR檢測結(jié)果

如圖2所示，2號(hào)泳道165 bp左右出現(xiàn)了ant(4′,4″)基因的目的條帶，其余耐藥基因均無被檢出。ant(4′,4″)基因?yàn)榘被擒疹惪股啬退幭嚓P(guān)基因，主要介導(dǎo)對(duì)慶大霉素、鏈霉素等氨基糖苷類藥物的敏感程度[23]。該結(jié)果與藥敏實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果基本一致，可以得出屎腸球菌Ef2對(duì)慶大霉素和鏈霉素不敏感，對(duì)四環(huán)素、青霉素和萬古霉素等大多數(shù)抗生素敏感。

M-DNA marker; 1-VanA; 2-ant(4′,4″); 3-ermb; 4-TEM; 5-TetM; 6-VanB;7-ant(6)-I; 8-ant(2″)-I; 9-aac(6′)/aph(2″); 10-mef; 11-aph(3′)-III圖2 屎腸球菌Ef2耐藥基因的PCR電泳圖Fig.2 The electrophoresis results of drug resistance genesPCR in Enterococcus faecium Ef2

2.1.4 毒力基因的PCR測定結(jié)果

毒力基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示，均無目的條帶檢出，表明屎腸球菌Ef2無毒力基因檢出，可以判定該菌株不會(huì)產(chǎn)生常見的毒蛋白。毒力基因的檢測已成為分析腸球菌安全性的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[26]，王曉蕊等[27]對(duì)豆醬中產(chǎn)細(xì)菌素的屎腸球菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)無毒力基因檢出，初步證實(shí)該菌株是安全的。

M-DNA marker; 1-ace; 2-asaI; 3-cylA; 4-efaA; 5-esp; 6-hyl; 7-gelE圖3 屎腸球菌Ef2毒力基因的PCR電泳圖Fig.3 The electrophoresis results of virulence genes PCRin Enterococcus faecium Ef2

由于溶血性細(xì)菌易引起溶血現(xiàn)象，從而導(dǎo)致敗血癥的發(fā)生[21]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)屎腸球菌Ef2不會(huì)引起溶血現(xiàn)象，對(duì)紅細(xì)胞無影響。通過藥敏實(shí)驗(yàn)和耐藥基因PCR檢測得出屎腸球菌Ef2對(duì)慶大霉素、鏈霉素不敏感，而對(duì)萬古霉素等其他大部分抗生素抗菌藥物敏感。毒力基因PCR結(jié)果無毒力基因檢出，可判定該菌株不會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的毒蛋白。因此結(jié)合溶血實(shí)驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)、耐藥基因和毒力基因PCR檢測結(jié)果可初步判定屎腸球菌Ef2是安全的，具有潛在的應(yīng)用前景，可選取該菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 屎腸球菌Ef2誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 氮源及其質(zhì)量濃度對(duì)酶活力的影響

不同誘導(dǎo)氮源及其質(zhì)量濃度對(duì)屎腸球菌Ef2產(chǎn)AOs活力的影響結(jié)果由圖4所示。由圖可知，腐胺作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基的氮源時(shí)，酶活力最高，尸胺最低。隨著腐胺質(zhì)量濃度升高，AOs酶活力也隨之升高，當(dāng)腐胺質(zhì)量濃度> 4 g/mL后，酶活力開始逐漸下降，由此可以得出，高濃度誘導(dǎo)氮源能夠抑制酶活力。BA對(duì)微生物產(chǎn)AOs有著重要的影響，OKAMURA等[28]研究發(fā)現(xiàn)酪胺等BA能夠特異性誘導(dǎo)Klebsiellaaerogenes產(chǎn)酪胺氧化酶。朱霞[29]分別用丙胺、正丁胺、正戊胺、正己胺、芐胺作為黑曲霉產(chǎn)AOs的誘導(dǎo)氮源，發(fā)現(xiàn)正己胺的誘導(dǎo)能力最好，丙胺和芐胺的誘導(dǎo)能力較差，因此選取正己胺作為唯一的誘導(dǎo)氮源。由于菌株的不同，以及BA之間的結(jié)構(gòu)性質(zhì)差異，影響著微生物對(duì)BA的利用。因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選取腐胺為誘導(dǎo)氮源，其質(zhì)量濃度為4 g/mL。

圖4 不同氮源及其質(zhì)量濃度對(duì)AOs酶活力的影響Fig.4 Effect of different nitrogen sources and mass concentrations on the activity of amine oxidase

2.2.2 碳源及其質(zhì)量濃度對(duì)酶活力的影響

不同誘導(dǎo)碳源及其質(zhì)量濃度對(duì)屎腸球菌Ef2產(chǎn)AOs酶活力的影響結(jié)果由圖5所示。由圖可知，不同碳源對(duì)AOs的誘導(dǎo)結(jié)果差異較大，說明碳源對(duì)屎腸球菌Ef2產(chǎn)AOs酶的影響較大，其中乳糖對(duì)產(chǎn)AOs的效果最好，蔗糖對(duì)產(chǎn)AOs的效果最差，低于40%。因此選擇乳糖為誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的碳源。隨著乳糖質(zhì)量濃度的升高，AOs酶活力呈先上升后下降趨勢。當(dāng)乳糖質(zhì)量濃度為50 g/L時(shí)，酶活力最高。因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇乳糖質(zhì)量濃度為50 g/L。但在黑曲霉的相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)碳源對(duì)菌株產(chǎn)AOs影響不顯著，不同碳源條件下黑曲霉均能較好的完成生長[18]，這可能是不同菌種之間的差異造成的。

圖5 不同碳源及其質(zhì)量濃度對(duì)AOs酶活力的影響Fig.5 Effect of different carbon sources and mass concentrations on the activity of amine oxidase

2.2.3 酵母膏及其質(zhì)量濃度對(duì)酶活力的影響

酵母膏及其質(zhì)量濃度對(duì)屎腸球菌Ef2產(chǎn)AOs酶活力的影響結(jié)果由圖6所示。當(dāng)不添加酵母膏，即酵母膏濃度為0時(shí)，AOs酶活力最低。隨著酵母膏質(zhì)量濃度逐漸升高，AOs酶活力也隨之升高，可知酵母膏的添加有利于AOs的產(chǎn)生，可能與酵母膏為菌株的生長提供了必要的生長因子有關(guān)[30]。當(dāng)濃度>10 g/L時(shí)，酶活力下降，可得出高濃度的酵母膏能夠抑制AOs酶活力。因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取酵母膏質(zhì)量濃度為10 g/L。

圖6 酵母膏及其質(zhì)量濃度對(duì)AOs酶活力的影響Fig.6 Effect of yeast extract and mass concentrations on the activity of amine oxidase

2.2.4 不同金屬離子及其質(zhì)量濃度對(duì)酶活力的影響

由不同金屬離子及其質(zhì)量濃度對(duì)屎腸球菌Ef2產(chǎn)AOs酶活力的影響結(jié)果表明Mg2+、Na+、Mn2+對(duì)屎腸球菌Ef2產(chǎn)生物胺氧化酶的影響較大，且在最適濃度處的酶活力較其他金屬離子高，因此選擇Mg2+、Na+、Mn2+進(jìn)行后續(xù)的正交實(shí)驗(yàn)。

2.2.5 不同金屬離子對(duì)產(chǎn)酶影響的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加Mg2+、Na+、Mn2+，并對(duì)這3個(gè)因素的濃度復(fù)配進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果如表2所示。

表2 不同金屬離子對(duì)產(chǎn)酶影響的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of effect of differentmetal ions on enzyme production

由表2可知，Mg2+、Mn2+、Na+的極差值分別為1.32、3.06、12.8。Na+的極差值最大，其次為Mn2+。因此Na+和Mn2+在金屬離子中是影響屎腸球菌Ef2產(chǎn)AOs的主要因素，Mg2+影響較小。3個(gè)因子的主次順序?yàn)镃→B→A。由表3方差分析結(jié)果可知，Na+在95%的置信度下影響顯著，說明金屬離子中Na+對(duì)誘導(dǎo)屎腸球菌Ef2產(chǎn)AOs有顯著性差異，與極差分析結(jié)果相一致。而Mg2+和Mn2+對(duì)誘導(dǎo)屎腸球菌Ef2產(chǎn)AOs不存在顯著性差異。

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

注：*表示P<0.05。

根據(jù)此正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得出各因子的最佳水平為A3→B1→C3，即Mg2+、Mn2+、Na+的質(zhì)量濃度分別為3 g/L、0.03 g/L、1.5 g/L得到的AOs的活力最高。在此條件下進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶，得到酶活力為12.54 U/mL。

2.2.6 誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，碳源、氮源、酵母膏的極差值分別為5.95、16.48、7.01。氮源的極差值最大，其次為酵母膏。因此在以乳糖為主要碳源、腐胺為主要氮源的誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，氮源和酵母膏是影響屎腸球菌Ef2產(chǎn)AOs的主要因素，碳源影響較小。3個(gè)因子的主次順序?yàn)锽→C→A。由表5方差分析結(jié)果可知，氮源在95%的置信度下影響顯著，說明氮源對(duì)誘導(dǎo)屎腸球菌Ef2產(chǎn)AOs有顯著性差異，與極差分析結(jié)果相一致。而碳源和酵母膏濃度對(duì)誘導(dǎo)屎腸球菌Ef2產(chǎn)AOs不存在顯著性差異。

表4 誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal test results of medium for theenzyme induction

表5 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 5 Variance analysis of orthogonal experiment

注：*表示P<0.05。

根據(jù)此正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得出各因子的最佳水平為A2→B3→C1，即乳糖、腐胺、酵母膏的質(zhì)量濃度分別為50、6、8 g/L得到的AOs的活力最高。在此條件下進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶，得到酶活力為15.01 U/mL。

2.3 屎腸球菌Ef2誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)條件的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

當(dāng)初始pH值為7.0時(shí)酶活力最高，最有利于AOs的產(chǎn)生。培養(yǎng)溫度可能影響著菌株的生長代謝情況，當(dāng)培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)，由于菌株的生長代謝旺盛，酶活力達(dá)到最高，因此選擇誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度為30 ℃。當(dāng)接種量為1%時(shí)，酶活力最高。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加酶活力在36 h處達(dá)到最高，可能是由于以乳糖為碳源，以腐胺為主要氮源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基并不適宜屎腸球菌Ef2的生長，在誘導(dǎo)產(chǎn)酶前期，菌株微生物為了適應(yīng)培養(yǎng)基環(huán)境，分泌出AOs來維持生長；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過36 h時(shí)，由于在微生物生長過程中，培養(yǎng)液處于動(dòng)態(tài)變化之中，再加上菌株不能完全利用腐胺進(jìn)行生長，隨著營養(yǎng)物質(zhì)不斷消耗，各種代謝產(chǎn)物隨著細(xì)胞的生長不斷分泌出來，積累在培養(yǎng)基中，老化的細(xì)胞自溶，從而影響了AOs的產(chǎn)生，導(dǎo)致酶活力下降。

2.3.2 誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)條件的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Orthogonal test results of culture conditions forthe enzyme induction

由表6可知，pH值、培養(yǎng)溫度、接種量、培養(yǎng)時(shí)間的極差值分別為14.70、6.24、13.01、33.64。培養(yǎng)時(shí)間的極差值最大，其次分別為pH值、接種量、培養(yǎng)溫度。因此在以乳糖為主要碳源、腐胺為主要氮源的誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，培養(yǎng)時(shí)間和pH值是培養(yǎng)條件中影響屎腸球菌Ef2產(chǎn)AOs的主要因素，培養(yǎng)溫度的影響最小，說明培養(yǎng)時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)屎腸球菌Ef2產(chǎn)AOs有著重要的影響。4個(gè)因子的主次順序?yàn)镈→A→C→B。根據(jù)此正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得出各因子的最佳水平為A2→B3→C1→D3，即pH、培養(yǎng)溫度、接種量、培養(yǎng)時(shí)間分別為7.0、32 ℃、0.5%、36 h得到的AOs的活力最高，該結(jié)果與周小虎等[18]對(duì)黑曲霉產(chǎn)AOs培養(yǎng)條件優(yōu)化的結(jié)果一致。在此條件下驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果為26.12 U/mL。

經(jīng)過上述實(shí)驗(yàn)對(duì)屎腸球菌Ef2產(chǎn)酶培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶，酶活力提高了139.63%。

3 結(jié)論

采用溶血實(shí)驗(yàn)、藥敏實(shí)驗(yàn)、常見的耐藥基因和毒力基因的PCR擴(kuò)增對(duì)屎腸球菌Ef2進(jìn)行安全性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶血實(shí)驗(yàn)呈陰性、無毒力基因檢出，對(duì)慶大霉素、鏈霉素不敏感，而對(duì)萬古霉素等其他大部分抗生素抗菌藥物敏感，因此初步判定該菌株是安全的，具有潛在的應(yīng)用前景，可用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。通過單因素結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)對(duì)屎腸球菌Ef2產(chǎn)AOs的誘導(dǎo)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最后確定誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最佳成分為：乳糖50 g/L、腐胺6 g/L、酵母膏8 g/L、MgSO43g/L、MnSO40.03 g/L、乙酸鈉1.5 g/L，最佳培養(yǎng)條件為：初始pH 7.0、接種量0.5%、培養(yǎng)時(shí)間36 h、培養(yǎng)溫度32 ℃。AOs酶活力從誘導(dǎo)前的10.9 U/mL提升至26.12 U/mL，酶活力提高了139.63%。本研究結(jié)果表明，屎腸球菌Ef2是安全的，不具有產(chǎn)毒基因，這對(duì)接種該菌株于發(fā)酵肉制品中來降低其中BA提升發(fā)酵肉制品的食用安全性具有重要意義，并且通過對(duì)培養(yǎng)及誘導(dǎo)條件的優(yōu)化可顯著提升該菌株產(chǎn)AOs的活力，為深入研究AOs提供了理論基礎(chǔ)。