吳捷，吳傳超，顧秋亞，余曉斌*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

紅景天是在高海拔地區(qū)發(fā)現(xiàn)的景天科珍稀植物[1]，紅景天苷(salidroside, SAL)和酪醇(tyrosol, TYR)是所有紅景天屬植物的主要生物活性成分[2]。由于其具有抗氧化[3]、抗疲勞[4]、抗衰老[5]和適應(yīng)性[6]等藥理作用，被用作食品作物和民間醫(yī)藥。而酪醇和紅景天苷含量的高低和抗氧化能力強(qiáng)弱常被作為評(píng)價(jià)紅景天屬植物藥用價(jià)值的指標(biāo)[7]。

隨著酪醇和紅景天苷在健康食品、化妝品和制藥工業(yè)中的需求增加，野生紅景天植物被過度開發(fā)[8-9]。然而，紅景天植物的人工栽培一直受到海拔要求的限制，且種植面積大，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，活性成分含量低[10-12]。近年來，組織和細(xì)胞培養(yǎng)以及化學(xué)合成方法已用于SAL和TYR的生產(chǎn)，但這些方法成本高，產(chǎn)量低，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重[13-14]。中藥的發(fā)酵炮制過程實(shí)際上是一個(gè)生物轉(zhuǎn)化的過程，具有選擇性強(qiáng)，反應(yīng)條件溫和，轉(zhuǎn)化效率高，副產(chǎn)物少，有效成分破壞少，毒副作用低，下游處理方便等特點(diǎn)[15-17]。

酪醇的合成途徑被認(rèn)為起源于酪氨酸[18]。微生物轉(zhuǎn)化酪醇及紅景天苷靠的是多酶反應(yīng)，其中酪氨酸脫羧酶作為連接反應(yīng)中初生代謝與次生代謝之間重要酶類，影響反應(yīng)的進(jìn)展與速度[19-20]。

本文利用生物轉(zhuǎn)化的方法合成酪醇，并利用篩選出的菌株發(fā)酵紅景天，以提高其中的紅景天苷含量和抗氧化性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及培養(yǎng)基

菌株：酵母菌株、乳酸菌菌株，由江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏。培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基；氨基酸脫羧酶選擇培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L，酵母浸粉3 g/L，葡萄糖1 g/L，1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液1 mL，L-酪氨酸5 g/L，pH 6.8。紅景天發(fā)酵培養(yǎng)基：紅景天粉末50 g/L，KH2PO44g/L，尿素4 g/L，(NH4)2SO43 g/L，MgSO40.25 g/L。

1.1.2 中藥及試劑

紅景天，無錫市同仁堂藥店；酪醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度均為98%)、紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品，大連美侖生物技術(shù)公司；甲醇、乙腈為色譜純，其他常用化學(xué)試劑均為市售分析純。

1.2 菌株的篩選

1.2.1 菌種初篩

酪氨酸在酪氨酸脫羧酶的作用下會(huì)產(chǎn)生CO2，形成的堿性產(chǎn)物生物胺會(huì)使培養(yǎng)基的pH下降，從而使指示劑溴甲酚紫變成紫色[21]。且L-酪氨酸在選擇平板中脫羧形成溶于水的產(chǎn)物酪醇，而L-酪氨酸微溶于水，因此在平板上形成透明圈，可以根據(jù)透明圈的大小和顏色變化程度來判斷微生物轉(zhuǎn)化L-酪氨酸的能力。

1.2.2 復(fù)篩

將初篩所得到的菌株接種到50 mL種子液中，培養(yǎng)24 h后按5%(體積分?jǐn)?shù))接種量接于加入酪氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min下培養(yǎng)72 h。設(shè)置空白對(duì)照，不接入菌但加入酪氨酸；將種子液接種到不加入酪氨酸的50 mL的發(fā)酵液中，得到菌種對(duì)照；發(fā)酵3 d后，在4 ℃、10 000 r/min下離心10 min，將上清液旋干后用甲醇沉淀其中的蛋白，離心去除沉淀后再用10 mL甲醇定容，過0.22 μm濾膜，得到待檢測(cè)的樣品。

1.3 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析

1.3.1 HPLC檢測(cè)

酪醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取20 mg酪醇標(biāo)準(zhǔn)品溶于10 mL甲醇中，并依次稀釋到質(zhì)量濃度為50、100、200、400、800 mg/mL。得到標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=3.300 1x+3.792，相關(guān)系數(shù)R2= 0.997 6。色譜條件及設(shè)備：采用SBC-18色譜柱(4.6 mm×150 mm)，流動(dòng)相：A 0.1%磷酸∶B甲醇∶C乙腈=75∶20∶5(V∶V∶V)，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm，溫度：30 ℃。

1.3.2 液質(zhì)聯(lián)用分析

采用HPLC-ESI-MS測(cè)定化合物的相對(duì)分子量，根據(jù)圖譜上相對(duì)保留時(shí)間以及特征碎片離子推斷化合物的結(jié)構(gòu)骨架及其斷裂方式。

質(zhì)譜條件：離子方式：ESI-；離子源溫度100 ℃；脫溶劑溫度400 ℃；毛細(xì)管電壓3.5 kV；碰撞能量6 V；檢測(cè)器電壓1 800 V；選擇離子掃描范圍m/z在50～1 500。

1.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

酵母菌以YPD為基本培養(yǎng)基，加入蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉等碳源，添加質(zhì)量濃度分別為15、30、45、60、75 g/L；加入(NH4)2SO4、NH4Cl2、黃豆粉、玉米漿、胰蛋白胨、酵母粉等氮源，添加質(zhì)量濃度分別為15、30、45、60、75 g/L，測(cè)定酪醇的產(chǎn)量，酪氨酸底物添加量為4 g/L。

1.5 應(yīng)用

1.5.1 紅景天發(fā)酵

稱取紅景天2.5 g置于250 mL三角瓶中，加水50 mL，混勻，121 ℃滅菌20 min，即得中藥發(fā)酵培養(yǎng)基，將所篩選的菌株按接種量(體積分?jǐn)?shù))10%接種到紅景天發(fā)酵培養(yǎng)基，酵母菌發(fā)酵體系于30 ℃、180 r/min發(fā)酵48 h，乳酸菌發(fā)酵中藥體系于37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h。

1.5.2 總還原力測(cè)定

參照AGRAWAL等[22]的方法，略有改動(dòng)。吸取0.5 mL待測(cè)樣液，向其中加入0.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液及0.5 mL PBS，混勻并置于50 ℃水浴恒溫反應(yīng)20 min，取出放入冰浴中迅速冷卻，再加入0.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻后離心。取上清液1.0 mL，加入1.0 mL水，再加入1.0 mL 0.1% FeCl3溶液，混勻，室溫靜置10 min后在700 nm處測(cè)定其吸光值，吸光值與待測(cè)樣品的總還原力呈正相關(guān)。

1.5.3 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參照WANG等[23]方法并加以改進(jìn)。吸取1.0 mL乙醇溶液，加0.5 mL DPPH自由基乙醇溶液(0.1 mmol/L)，加1.0 mL樣品溶液，混勻，在室溫下避光放置60 min，然后在517 nm下測(cè)定吸光度，并計(jì)算DPPH自由基清除率[14]。

(1)

式中：A0, 溶劑空白管吸光值；Ai,樣品管吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板初篩

從198株菌株中篩選出80株能使平板變色，并具有菌落透明圈的菌株。其中酵母63株，乳酸菌17株。根據(jù)平板變色的時(shí)間和深淺初步判斷微生物產(chǎn)酪氨酸脫羧酶的能力強(qiáng)弱。試驗(yàn)僅觀察平板點(diǎn)種2 d后的平板顏色變化，篩選結(jié)果如圖1。其中圖1-A不能使平板變色，圖1-B和圖1-C都能使平板變色，圖1-C中的菌種長(zhǎng)勢(shì)旺盛，變色范圍較1-B圖中菌株大。培養(yǎng)2 d后，C圖菌株已經(jīng)能使整個(gè)平板變色。初步判斷其轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)。

A-不能使平板變色菌株；B-變色圈小菌株(Y1)；C-變色圈大的菌株(ww0304) 圖1 平板篩選轉(zhuǎn)化酪氨酸菌株Fig.1 Screen screening of transformed tyrosine strains

2.2 HPLC檢測(cè)

通過高效液相色譜對(duì)上述80株菌株是否能夠轉(zhuǎn)化成酪醇進(jìn)行檢測(cè)分析，其中能夠轉(zhuǎn)化成酪醇的有9株，2株為酵母，7株為乳酸菌。并確定了1株轉(zhuǎn)化率最高的菌株WW0304。如圖2所示，紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品在3.304 min出峰，酪醇保留時(shí)間在4.895 min，其中圖2-B為空白對(duì)照組，即不接入菌種只加入底物酪氨酸，且在4.895 min未檢測(cè)到吸收峰，而發(fā)酵液圖2-C和圖2-D均在4.895 min處檢測(cè)到吸收峰，其中圖2-D為菌株WW0304發(fā)酵液圖譜。初步判斷該菌能夠?qū)⒌孜镛D(zhuǎn)化成酪醇和紅景天苷。

A-紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品；B-空白對(duì)照；C-菌株Y1的發(fā)酵液；D-ww0304發(fā)酵液；E-酪醇標(biāo)準(zhǔn)品圖2 HPLC對(duì)產(chǎn)物的初步鑒定Fig.2 Preliminary identification of the product by HPLC

2.3 液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)結(jié)果

對(duì)預(yù)處理后的發(fā)酵液進(jìn)行進(jìn)一步的液質(zhì)分析，圖3為發(fā)酵液預(yù)處理后在保留時(shí)間4.616 min下的一級(jí)質(zhì)譜圖。在m/z為137下的離子峰為[M-H]-,m/z為93下的離子峰猜測(cè)為離子碎片，為[M-H-COOH]-。

圖3 酪醇樣品一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.3 First-order mass spectrum of tyrosol sample

圖4為保留時(shí)間4.613 min下的二級(jí)質(zhì)譜圖。在能量加大的情況下，物質(zhì)斷裂的更加徹底，137的峰大量斷裂。而酪醇上的苯環(huán)不易斷裂，因此未有新的離子峰出現(xiàn)。

圖4 酪醇樣品二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.4 Secondary spectrum of tyrosol sample

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 碳源對(duì)酪醇產(chǎn)量的影響

碳源對(duì)酪醇產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖5所示。當(dāng)乳糖、淀粉為碳源時(shí)，微生物基本不生成酪醇，而當(dāng)葡萄糖為碳源時(shí)，酪醇的產(chǎn)量最高。其原因可能是葡萄糖會(huì)促進(jìn)菌株產(chǎn)酪氨酸脫羧酶，并且對(duì)于菌株合成酪醇來說是必不可少的[24]。其中添加質(zhì)量濃度為20 g/L的葡萄糖，可促使該菌株產(chǎn)酶活性和酪醇的產(chǎn)量最大，為2.3 g/L。

A-不同碳源對(duì)酪醇含量的影響；B-葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)酪醇含量的影響圖5 碳源對(duì)酪醇產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of carbon sources on tyrosol production

2.4.2 氮源對(duì)酪醇產(chǎn)量的影響

氮源對(duì)酪醇產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖6所示。有機(jī)氮源對(duì)酪醇的產(chǎn)量有促進(jìn)作用，當(dāng)添加質(zhì)量濃度為30 g/L的玉米漿時(shí)，酪醇的產(chǎn)量最高，為2.3 g/L。玉米漿能促進(jìn)產(chǎn)酶和提高產(chǎn)量，可能是因?yàn)槠浜写罅康木S生素和其他微量元素。

A-不同氮源對(duì)酪醇含量的影響；B-玉米漿濃度對(duì)酪醇含量的影響圖6 氮源對(duì)酪醇產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of nitrogen source on tyrosol production

2.5 在紅景天發(fā)酵中的應(yīng)用

將9株能夠轉(zhuǎn)化酪氨酸的菌株接種到紅景天培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，通過高效液相色譜(圖7-A)對(duì)其中TRY和SAL進(jìn)行定量分析。發(fā)酵后酪醇和紅景天苷含量都得到提高，其中菌株WW0304(圖7-B菌株Y2)發(fā)酵后總有效成分提高最多，酪醇產(chǎn)量提高235%，紅景天苷產(chǎn)量提高了109.9%左右。

A-發(fā)酵液前后液相對(duì)比圖；B-不同菌種發(fā)酵有效成分含量對(duì)比圖7 不同菌種發(fā)酵液中酪醇和紅景天苷含量對(duì)比Fig.7 Comparison of tyrosol and salidroside in fermentation broth of different strains

以維生素C(Vc)作為陽性對(duì)照，對(duì)紅景天水提液及WW0304紅景天發(fā)酵液的總還原力進(jìn)行研究(圖8)。在不同的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，紅景天發(fā)酵液總還原力均明顯高于水提液的總還原力。在10.5～52.5 mg/L范圍內(nèi)，相同質(zhì)量濃度紅景天發(fā)酵液的總還原力大于Vc溶液的總還原力。

圖8 紅景天水提液及發(fā)酵液還原力對(duì)比Fig.8 Comparison of total reducing power before and after fermentation of Rhodiola

紅景天發(fā)酵前后的DPPH自由基清除率如圖9所示。紅景天發(fā)酵后其清除DPPH自由基能力增強(qiáng)，抗氧化能力增加。在0.42～1.47 g/L，紅景天發(fā)酵液的DPPH自由基清除率高于水提液，空白發(fā)酵液的DPPH自由基清除能力較差。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.42 g/L時(shí)，發(fā)酵液的DPPH自由基清除率為7.98%，而當(dāng)質(zhì)量濃度為168 g/L時(shí)，紅景天發(fā)酵液的清除率達(dá)到61.01%，在0.42～1.47 g/L隨著紅景天濃度的增高，DPPH自由基清除能力增強(qiáng)。

圖9 紅景天發(fā)酵前后DPPH自由基清除率對(duì)比Fig.9 Comparison of DPPH clearance rate before and after fermentation of Rhodiola

3 結(jié)論

酪氨酸和紅景天苷的微生物轉(zhuǎn)化基于多酶反應(yīng)，其中酪氨酸脫羧酶在連接反應(yīng)中作為初級(jí)代謝和次級(jí)代謝之間的重要酶，影響反應(yīng)的速度和進(jìn)程。通過含溴甲酚紫的平板顯色試驗(yàn)，篩選出能轉(zhuǎn)化酪氨酸的菌株，并通過搖瓶復(fù)篩判定其轉(zhuǎn)化能力。實(shí)驗(yàn)確定1株轉(zhuǎn)化率較高的菌株WW0304，以葡萄糖為碳源，玉米粉為氮源，且葡萄糖添加的質(zhì)量濃度為20 g/L，玉米漿質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí)，酪醇產(chǎn)量達(dá)到2.3 g/L。最終將篩選到的菌株應(yīng)用于紅景天發(fā)酵，酪醇產(chǎn)量由發(fā)酵前的0.23 g/L增加為0.78 g/L，提高了235%，紅景天苷產(chǎn)量由發(fā)酵前的0.21 g/L增加到0.43g/L，提高了109.9%。發(fā)酵后的總還原力是發(fā)酵前的1.7倍，DPPH自由基清除能力由發(fā)酵前的35.45%增加到61.01%。本實(shí)驗(yàn)為酪醇的生物合成提供了一種新的思路，并為紅景天的開發(fā)利用提供了新的方向。