查飛，王洲，2，薛正蓮,2*，蔣雪彪，紀(jì)國(guó)輝

1(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖，241000) 2(微生物發(fā)酵安徽省工程研究中心，安徽 蕪湖，241000)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus，VP)是一種嗜鹽性細(xì)菌，又稱腸炎弧菌，廣泛分布于海水和鹽水湖等含鹽水域，來(lái)源于魚、蝦、貝類等海產(chǎn)品[1-2]。其具有條件致病性，可引起食物中毒，是一種重要的食源性病原微生物，會(huì)導(dǎo)致以腹瀉、腸痙攣等為主要癥狀的急性腸胃炎，嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)敗血癥導(dǎo)致死亡，尤其是在夏秋季節(jié)[3-6]。除了已報(bào)道的溶血素TDH、TRH和腸毒素等致病因子的作用外，生物膜的形成也能夠增強(qiáng)菌株的致病性[7-9]。作為水產(chǎn)品的主要致病菌，副溶血性弧菌在正常的少鹽環(huán)境中難以存活，但是其引發(fā)食物中毒的事件仍頻頻發(fā)生[10]，這與細(xì)菌在逆境條件下的生物膜形成有關(guān)。研究表明，即使食品加工過程中經(jīng)過嚴(yán)格的清洗消毒工序，在食品接觸表面還可能殘留微生物并形成生物膜[11-12]。

生物膜(biofilm，BF)是微生物細(xì)胞附著在載體表面，通過分泌產(chǎn)生的胞外多聚物(extracellular polymeric substances，EPS)，主要是一些胞外多糖、胞外纖維蛋白和脂蛋白等物質(zhì)，將自身包裹其中而形成細(xì)菌聚合物，可以增強(qiáng)微生物細(xì)胞對(duì)不良環(huán)境的抵抗和耐受能力，造成極大的食品安全隱患[13]。同時(shí)，生物膜的形成對(duì)微生物的抗生素耐受性也具有一定的促進(jìn)作用，研究表明，副溶血性弧菌具有廣譜耐藥性，對(duì)阿莫西林等抗生素的平均耐藥性較其他細(xì)菌高50%[14]，其耐藥性的產(chǎn)生與生物膜形成有關(guān)。據(jù)報(bào)道，細(xì)菌以生物膜形式存在時(shí)，耐藥性可增加10～1 000倍[15]，這由于生物膜形成的胞外聚合物將抗生素與微生物細(xì)胞隔離，減緩其進(jìn)入胞內(nèi)的速度。除了改變微生物細(xì)胞對(duì)環(huán)境的抗逆性外，生物膜的清除難度也促進(jìn)了微生物的生長(zhǎng)繁殖，加重了細(xì)菌污染，目前還沒有抑制生物膜形成的有效方法。而表面活性劑作為一類兩性化合物，既含有親水基團(tuán)，又含有疏水基團(tuán)，其表面帶有電荷，與帶負(fù)電的生物膜相互作用，會(huì)影響胞外聚合物的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響生物膜的形成[16]。

目前，關(guān)于細(xì)菌生物膜的形成機(jī)制研究，多集中于大腸桿菌和銅綠假單胞菌等模式生物，副溶血性弧菌生物膜的形成特性及其防控措施鮮有報(bào)道。因此，本文通過對(duì)鹽濃度、pH值和幾種不同類型的表面活性劑對(duì)副溶血性弧菌生物膜形成的作用分析，確定副溶血性弧菌生物膜的形成條件，并綜合分析不同類型的表面活性劑對(duì)生物膜形成的抑制特性，為副溶血性弧菌的生物膜防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)菌株：副溶血性弧菌ATCC17802，本實(shí)驗(yàn)室保藏；

培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、硫檸膽蔗瓊脂培養(yǎng)基(TCBS)，杭州百思生物技術(shù)有限公司。

其他相關(guān)試劑：胰蛋白胨、瓊脂粉、NaCl、酵母粉、葡萄糖、硫酸、苯酚、十二烷基硫酸鈉(SDS)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、檸檬酸二銨，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器：ZQZY-BG搖床，上海知楚儀器有限公司；1510全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，賽默飛世爾(上海)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

TSB培養(yǎng)基：溶解30 g粉末于1 000 mL水中，調(diào)節(jié)到不同pH值，分裝，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 副溶血弧菌的活化培養(yǎng)及菌液制備

從TSB斜面培養(yǎng)基上挑取適量菌體，轉(zhuǎn)接至5 mL 3% NaCl的TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12～16 h，再移取200 μL培養(yǎng)菌液至新鮮的5 mL 3%NaCl TSB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12～16 h。

1.2.3 微孔板法

以有蓋的無(wú)菌24孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行菌株生物膜的培養(yǎng)，每孔中先加入2.5 mL新鮮TSB培養(yǎng)基，再接入500 μL菌液，平行3次。并以TSB培養(yǎng)基作陰性對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)72 h后，緩緩移去孔中的培養(yǎng)物，并且每孔用蒸餾水清洗2～3次，晾干后加入3 mL 0.1%結(jié)晶紫溶液進(jìn)行染色，室溫靜置20 min，倒掉染色劑后再以蒸餾水清洗2～3次，洗去浮色，倒置晾干20 min，除去殘余水分，再加入2 mL 33% 乙酸脫色 10 min，并測(cè)定OD570nm值。

通常采用OD570nm值來(lái)反映生物膜與接觸面黏附的牢固程度，為了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較分析，以陰性對(duì)照孔的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差為界定值(ODC)，可對(duì)生物膜進(jìn)行分類:OD≤ODC為無(wú)黏附(-)，ODC4ODC為強(qiáng)黏附(+++)[17]。

1.2.4 培養(yǎng)基pH值和NaCl含量對(duì)副溶血性弧菌成膜的影響

配制不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0、1%、3%、5%)的NaCl溶液和不同pH值(6、7、8、9)的TSB培養(yǎng)基，平行3次，37 ℃培養(yǎng)72 h后，按照方法1.2.3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 培養(yǎng)溫度對(duì)副溶血性弧菌成膜的影響

在確定培養(yǎng)基pH值和NaCl含量對(duì)菌株成膜性能的前提下，分別在不同溫度條件下(4、25、37 ℃)進(jìn)行菌株的成膜培養(yǎng)，平行3次，按照方法1.2.3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 不同表面活性劑對(duì)副溶血性弧菌成膜的影響

分別配制十二烷基硫酸鈉(SDS)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和檸檬酸二銨母液，然后在24孔中分別加入不同質(zhì)量濃度的上述3種表面活性劑(表1)，將孔板在37 ℃下靜置培養(yǎng)72 h，測(cè)定OD570nm值,如式(1)所示。

(1)

表1 不同表面活性劑的終質(zhì)量濃度Table 1 Final concentrations of different surfactants

1.2.7 SDS對(duì)副溶血性弧菌生長(zhǎng)的影響

采用96 孔板測(cè)定SDS的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，分別在96孔板中加入SDS母液與培養(yǎng)基混合至終濃度，見表1，每個(gè)孔板接10 μL菌液，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，以不加SDS的培養(yǎng)基作對(duì)照，測(cè)定OD600nm值。

1.2.8 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、200、400、600、800 μL，分別置于25 mL比色管中，準(zhǔn)確補(bǔ)水至2 mL，加入苯酚2 mL，混勻1 min，小心加入濃硫酸10 mL，再混勻1 min，置沸水浴15 min，冷卻后測(cè)定OD490nm的值，并繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

1.2.9 胞外多糖的測(cè)定

吸取10 mL培養(yǎng)液至50 mL離心管中，離心取上清液，加入等體積的無(wú)水乙醇，混勻5 min，4 000 r/min離心15 min，棄去上清，沉淀用10 mL水溶解，吸取2 mL按照1.2.8的方法測(cè)定OD490nm值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀取葡萄糖含量，計(jì)算樣品中胞外多糖的的質(zhì)量濃度[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值和NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)副溶血性弧菌生物膜形成的影響

由表2可知，在不同的培養(yǎng)基、pH值及NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，副溶血性弧菌的成膜特性具有明顯差異，只有在特定條件下才能夠形成生物膜。其中，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，pH 6和pH 7的條件下以及NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、pH 8的條件下均能形成中等黏附的生物膜。在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、pH 9的條件下能形成強(qiáng)黏附性生物膜，可能是因?yàn)樵摋l件為副溶血性弧菌的培養(yǎng)最佳條件，其菌濃達(dá)到最高，大大促進(jìn)了其生物膜的形成。其他鹽濃度和pH條件下的生物膜無(wú)黏附。

表2 不同pH值和NaCl含量下副溶血性弧菌生物膜的形成Table 2 Formation of VP biofilms at different pH valuesand salt concentrations

注：括號(hào)中為測(cè)定生物膜時(shí)的3組平行實(shí)驗(yàn)的平均菌濃OD600nm。

細(xì)菌生物膜的形成包括定殖、成熟和脫落釋放等過程，定殖階段涉及細(xì)胞對(duì)介質(zhì)的黏附以及細(xì)胞間的黏附等，與細(xì)胞膜的特性有關(guān)。副溶血性弧菌是一類陰性嗜鹽菌，對(duì)培養(yǎng)基中的鹽濃度要求較高，Na+對(duì)于嗜鹽菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整性有重要意義[19-20]。過高或過低的Na+濃度都會(huì)影響菌株的正常生長(zhǎng)。同時(shí)，環(huán)境pH值也會(huì)對(duì)細(xì)胞膜表面的電荷變化產(chǎn)生影響，從而影響生物膜形成初期的粘附過程。本研究發(fā)現(xiàn)，3%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl條件下，菌株的生長(zhǎng)較好，生物膜測(cè)定時(shí)菌體OD值較高(表2)。另一方面，在pH 9的條件下，細(xì)胞膜表面大量負(fù)電荷的積累也促進(jìn)了生物膜的形成和穩(wěn)定。

2.2 不同溫度下副溶血性弧菌生物膜形成

由圖2可知，隨著溫度的升高，不同鹽濃度和pH條件下的生物膜形成量也不斷升高。在4 ℃下，該菌株生物膜形成量最低，生物膜形成明顯受到抑制，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，低溫會(huì)抑制生物膜的形成[21]，這與菌體在低溫情況下的生長(zhǎng)和代謝速率較低有關(guān)。同時(shí)，研究結(jié)果表明，37 ℃下不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)與培養(yǎng)基pH條件下的生物膜形成均較好。且在37 ℃溫度條件下，質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%NaCl和pH 9是副溶血性弧菌形成最適條件，因此，在后續(xù)生物膜培養(yǎng)和分析實(shí)驗(yàn)中均采用此條件進(jìn)行培養(yǎng)。

圖2 不同溫度下副溶血性弧菌生物膜的形成Fig.2 Formation of VP biofilms at different temperatures

2.3 SDS對(duì)副溶血性弧菌生物膜影響

在對(duì)副溶血性弧菌生物膜形成條件分析的基礎(chǔ)上，對(duì)表面活性劑影響生物膜形成的特性進(jìn)行分析。

首先，對(duì)SDS在生物膜形成中的作用進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同SDS質(zhì)量濃度對(duì)副溶血性弧菌生物膜形成的影響Fig.3 Effect of different SDS concentrations on biofilm formation of VP

隨著SDS質(zhì)量濃度的增加，該菌株生物膜的形成呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在SDS質(zhì)量濃度小于600 mg/L時(shí)，SDS對(duì)生物膜的形成具有促進(jìn)作用，生物膜量隨著SDS質(zhì)量濃度的提高不斷增加，在600 mg/L時(shí)達(dá)到峰值。當(dāng)SDS質(zhì)量濃度大于600 mg/L時(shí)，SDS會(huì)抑制副溶血性弧菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致其生物膜形成減弱。IZANO等[22]研究了SDS對(duì)伴放線放線桿菌生物膜的形成作用，當(dāng)SDS質(zhì)量濃度高于臨界膠束濃度時(shí)，SDS會(huì)破壞蛋白質(zhì)的折疊，使蛋白質(zhì)變性，從而影響生物膜的形成，對(duì)菌體的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。SDS是一種陰離子表面活性劑，低濃度SDS會(huì)影響細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)了細(xì)胞與細(xì)胞間的信號(hào)傳遞，同時(shí)，利于胞外蛋白質(zhì)和多糖等物質(zhì)的分泌，參與到生物膜的形成過程，當(dāng)濃度過高時(shí)，在抑制菌株生長(zhǎng)的同時(shí)，也會(huì)使胞外蛋白質(zhì)變性，破壞生物膜的形成。

2.4 PVP對(duì)副溶血性弧菌生物膜的影響

由圖4可以看出,隨著PVP質(zhì)量濃度的增加，該菌株生物膜的形成呈先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)PVP質(zhì)量濃度小于600 mg/L時(shí)，在一定程度上促進(jìn)了生物膜的形成，但是沒有SDS的促進(jìn)作用明顯，在600 mg/L時(shí)達(dá)到峰值，當(dāng)PVP質(zhì)量濃度大于600 mg/L時(shí)，抑制生物膜的形成。PVP是一種聚乙烯類非離子型表面活性劑，MARSHALL等[23]認(rèn)為這種表面活性劑的疏水基會(huì)影響初始粘附過程中的高聚物的形成，從而使細(xì)菌生物膜成分發(fā)生改變，影響生物膜的穩(wěn)定性，通過激光共聚焦顯微鏡圖像顯示，非離子表面活性劑可以將生物膜厚度由5～40 μm減小到5～25 μm。因此，可能是低濃度的PVP改變了細(xì)胞的通透性，促進(jìn)其胞外多糖的分泌，增加生物膜的形成，當(dāng)PVP濃度過高時(shí)，其中的疏水基改變了生物膜的成分，影響其穩(wěn)定性，從而抑制其生物膜的形成。

圖4 不同PVP質(zhì)量濃度對(duì)副溶血性弧菌生物膜形成的影響Fig.4 Effect of different PVP concentrations on biofilm formation of VP

2.5 檸檬酸二銨對(duì)副溶血性弧菌生物膜的影響

由圖5可知，隨著檸檬酸二銨質(zhì)量濃度的增加，可以顯著促進(jìn)生物膜的形成，且呈梯度增加。檸檬酸二銨是1種兩性離子表面活性劑，其分子中既帶有正電荷，又帶有負(fù)電荷，可能是檸檬酸二銨具有非極性固體表面單層吸附的能力，增強(qiáng)了副溶血性弧菌與介質(zhì)的粘附能力，從而促進(jìn)了副溶血性弧菌生物膜的形成。

1～7：檸檬酸二銨質(zhì)量濃度0、200、400、600、800、1 000、2 000 mg/L；a-副溶血性弧菌生物膜形成情況；b-副溶血性弧菌生物膜形成促進(jìn)率圖5 不同檸檬酸二銨質(zhì)量濃度對(duì)副溶血性弧菌生物膜形成情況和生物膜形成促進(jìn)率Fig.5 Different concentrations of diammonium citrate on the biofilm formation and promotion rate of biofilm formation of VP by different concentrations of diammonium citrate

2.6 SDS對(duì)副溶血性弧菌的MIC

從圖3可以看出，SDS對(duì)副溶血性弧菌生物膜的形成影響顯著，進(jìn)而研究了不同質(zhì)量濃度SDS對(duì)副溶血性弧菌生長(zhǎng)的影響，由圖6可知，隨著SDS質(zhì)量濃度增加，副溶血性弧菌的生物量會(huì)不斷下降，其生長(zhǎng)顯著受到抑制，當(dāng)SDS質(zhì)量濃度為600 mg/L，培養(yǎng)時(shí)間為24 h時(shí)，副溶血性弧菌生物量達(dá)到最低，是抑制該菌生長(zhǎng)的最低濃度，因此，SDS對(duì)該菌株的最小抑菌濃度(MIC)為600 mg/L。

圖6 不同SDS質(zhì)量濃度對(duì)副溶血性弧菌生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of different SDS concentrations on VP growth

2.7 副溶血性弧菌胞外多糖的測(cè)定

圖7 添加SDS的副溶血性弧菌胞外多糖的測(cè)定Fig.7 Determination of extracellular polysaccharides of VP with SDS

由圖7可知，添加了SDS的副溶血性弧菌培養(yǎng)液中，終濃度為600 mg/L時(shí)，即最小抑菌濃度，其胞外多糖含量達(dá)到41.27 mg/L，而對(duì)照胞外多糖含量為28.99 mg/L，其含量是對(duì)照的1.42倍。因此，當(dāng)SDS處于臨界膠束濃度時(shí)，促進(jìn)了該菌株胞外多糖的分泌從而顯著促進(jìn)生物膜的形成。

3 結(jié)論

副溶血性弧菌形成生物膜，增加細(xì)胞對(duì)環(huán)境的抵抗能力得以殘存，進(jìn)而污染食品，造成極大的食品安全隱患[24]。細(xì)菌生物膜的形成是由起始到逐步成熟、穩(wěn)定再到逐漸老化的動(dòng)態(tài)過程，副溶血性弧菌生物形成也經(jīng)歷了這3個(gè)階段，起始生長(zhǎng)階段，菌濃較低，與介質(zhì)的粘附較弱，隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)，菌濃逐漸升高，菌膜逐步成熟，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到衰亡期，菌膜老化，伴隨胞外多糖分泌減少，菌膜里的菌體逐漸衰亡，導(dǎo)致生物膜結(jié)構(gòu)被破壞進(jìn)而脫落[25]。

目前，對(duì)生物膜的清除方法主要有抗菌劑涂層、多酶清洗劑和表面活性劑等[26]，其中表面活性劑是1種兩性化合物，因其帶有電荷而與生物膜相互作用來(lái)達(dá)到清除效果，但是，表面活性劑對(duì)生物膜的抑制或清除作用具有一定的限制性。因此，本文通過表面活性劑與副溶血性弧菌生物膜的形成作用進(jìn)行了分析，主要從表面活性劑的種類和用量上展開研究，SDS、PVP、檸檬酸二銨這3種不同類型表面活性劑的影響比較顯著，且呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。結(jié)果表明，副溶血性弧菌在不同的條件下形成生物膜的量也不同，培養(yǎng)條件為37 ℃，3%NaCl、pH 9時(shí)，形成生物膜的量最多，高鹽和高溫有助于其生物膜形成。低濃度(小于600 mg/L)的SDS和PVP可以促進(jìn)副溶血性弧菌生物膜的形成，高濃度的表面活性劑會(huì)抑制生物膜的形成，然而隨著檸檬酸二銨濃度升高可以促進(jìn)生物膜的形成。當(dāng)SDS濃度為副溶血性弧菌的最小抑菌濃度時(shí)，即600 mg/L，對(duì)其生物膜的促進(jìn)作用顯著，其胞外多糖含量是對(duì)照的1.42倍。本研究結(jié)果為生物膜的消除和食品安全提供了理論基礎(chǔ)，病原微生物形成生物膜殘留在食品加工器械表面因其難以清除而導(dǎo)致食品污染，雖然這3種表面活性劑不能作為食品添加劑直接添加到食品中，但是SDS和PVP可以作為新型清洗劑,對(duì)食品器械上殘留的生物膜達(dá)到一個(gè)較好的清除作用。