張文平，趙英杰，羅晟，程新

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌，330045)

乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外的一種糖類高聚物的總稱[1-2]。大量研究表明，乳酸菌胞外多糖具有多種生理功能，如抗氧化、抗腫瘤、促進(jìn)腸道菌群平衡、免疫調(diào)節(jié)等[3]，此外，乳酸菌胞外多糖可以作為一種天然的食品添加劑，改善食品黏稠度、質(zhì)地和風(fēng)味等[4]，因此被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[5-7]。

目前，乳酸菌胞外多糖的產(chǎn)量普遍偏低，這也是制約著其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的主要原因之一[8-9]?；诖?，近年來，大多數(shù)研究都集中在如何進(jìn)一步優(yōu)化乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量[10-12]。葉廣彬等[13]采用響應(yīng)面法優(yōu)化檸檬明串珠菌TD1產(chǎn)胞外多糖條件，優(yōu)化后產(chǎn)量是優(yōu)化前的1.76倍。WANG等[14]對(duì)LactobacillusplantarumKX041合成胞外多糖的發(fā)酵條件進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化，優(yōu)化后，最大胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到599.52 mg/L，是優(yōu)化前的3倍。因此，優(yōu)化菌株?duì)I養(yǎng)和培養(yǎng)條件是提高乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量的重要途徑。

本實(shí)驗(yàn)以提高胞外多糖產(chǎn)量為出發(fā)點(diǎn)，從課題組保藏的20株乳酸菌中篩選高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌，采用形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)手段對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，同時(shí)，采用單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵工藝條件，為乳酸菌胞外多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

乳酸菌，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物資源開發(fā)與利用實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏10.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，無水乙酸鈉5.0 g/L，MgSO40.2 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，吐溫-80 1.0 mL/L，pH 6.2～6.4，121 ℃高壓滅菌，15 min。

改良MRS培養(yǎng)基：用蔗糖代替葡萄糖，其他同MRS培養(yǎng)基。

1.1.3 儀器與設(shè)備

JW-3022HR高速冷凍離心機(jī)，安徽嘉文儀器裝備有限公司；721可見分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；LRH-250-C培養(yǎng)箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司； FEI Quanta 250型掃描電子顯微鏡，美國FEI。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選

將保藏于-80 ℃的20株乳酸菌接種于MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，采取平板劃線法將活化好的乳酸菌接種于改良的MRS固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，選取菌落表面黏稠且可拉絲的單菌落[15]，保藏于MRS培養(yǎng)基斜面，置于4 ℃冰箱保存。

將初篩獲得的菌株接種于改良的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置發(fā)酵24 h。取發(fā)酵液于10 000 r/min，4 ℃條件下離心15 min，取上清液加三氯乙酸至終質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，4 ℃反應(yīng)12 h后，10 000 r/min，4 ℃條件下離心15 min，收集上清液，于上清液中加入3倍體積95%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇溶液于4 ℃浸提12 h后在10 000 r/min，4 ℃條件下離心15 min，收集沉淀，用無水乙醇洗滌沉淀后，將沉淀用去離子水溶解定容，溶液用去離子水透析(8 000～14 000 Da)3 d，每8 h換一次水，透析結(jié)束后減壓真空濃縮至原體積即為粗多糖溶液[16]。

采用硫酸-苯酚法[17]測定胞外多糖含量。從而確定高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌菌株。

1.2.2 高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的鑒定

菌株形態(tài)學(xué)鑒定、掃描電鏡、生理生化特性分析、16S rDNA鑒定分別參考文獻(xiàn)[18-21]進(jìn)行。

1.2.3 單因素優(yōu)化乳酸菌產(chǎn)胞外多糖條件

在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別研究碳源(葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖)、最佳碳源濃度(10、20、30、40、50 g/L)、氮源(酪蛋白、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、蛋白胨、硫酸銨)、最佳氮源濃度(5、10、15、20、25 g/L)、發(fā)酵時(shí)間(18、24、30、36、42 h)、發(fā)酵溫度(20、25、30、35、40 ℃)、發(fā)酵初始pH值(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)、接種量(2%、4%、6%、8%、10%(體積分?jǐn)?shù)))等因素對(duì)乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量的影響。

1.2.4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選發(fā)酵工藝條件顯著因子

根據(jù)單因素的結(jié)果，使用Design-expert 8.0軟件，選用19因素，20次實(shí)驗(yàn)次數(shù)的Plackett-Burman設(shè)計(jì)[22]，采用Design-expert 8.0軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定顯著因子。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，篩選出對(duì)出發(fā)菌株產(chǎn)胞外多糖影響顯著的3個(gè)因子，以胞外多糖產(chǎn)量為響應(yīng)值，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，采用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)三因素五水平實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行顯著性分析[23]，確定最佳發(fā)酵工藝條件。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行Plackett-Burman和Central Composite Design實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析，圖形繪制采用Origin 8.5軟件，數(shù)據(jù)處理采用DPS 7.5軟件；對(duì)不同處理間的數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，Duncan法進(jìn)行多重比較，圖中不同小寫字母表示處理間在P<0.05水平上差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌篩選

將保藏的20株乳酸菌在改良的MRS固體培養(yǎng)基上平板劃線，觀察菌落特征，初篩結(jié)果如表1所示，選取其中6株菌落黏稠、有拉絲現(xiàn)象的菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定其胞外多糖產(chǎn)量進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，其中1、2、6、10、16號(hào)5株菌的胞外多糖的產(chǎn)量基本都在550～800 mg/L之間，而LPC-1的胞外多糖產(chǎn)量可以達(dá)到1 060.39 mg/L，故選擇LPC-1菌株作為出發(fā)菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 產(chǎn)胞外多糖乳酸菌初篩結(jié)果Table 1 Preliminary screening results of exopolysacch-arides-producing lactic acid bacteria

注：“+”：是；“-”：否。

圖1 產(chǎn)胞外多糖乳酸菌復(fù)篩結(jié)果Fig.1 Re-screening results of exopolysaccharides-producing lactic acid bacteria

2.2 菌株LPC-1的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌株LPC-1在改良MRS固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24 h后，菌落形態(tài)如圖2所示，LPC-1菌落呈圓形、乳白色、邊緣整齊光滑，表面濕潤有光澤、黏稠、中央隆起、不透明。通過光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡觀察顯示，LPC-1菌體為革蘭氏陽性，桿狀，不形成芽孢。菌落形態(tài)及菌體照片如圖2所示。

圖2 LPC-1菌株菌落及菌體形態(tài)Fig.2 Colony morphologies and electron micrograph(8 000×) of strain LPC-1

2.2.2 生理生化鑒定

對(duì)LPC-1菌株進(jìn)行生理生化特征分析，以干酪乳桿菌菌株為對(duì)照，結(jié)果如表2所示，LPC-1菌株過氧化氫酶、H2S實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為陰性，可以利用葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、乳糖、棉子糖、甘露糖、阿拉伯糖、蜜二糖等，不能利用鼠李糖，與植物乳桿菌的性質(zhì)接近。

表2 菌株生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical characters of strains

注：“-”表示陰性，“+”表示陽性。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

對(duì)菌株LPC-1的16S rRNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，獲得大小約為1.5 Kb的擴(kuò)增片段(GenBank登錄號(hào)為MK722196)，將序列提交GenBank做Blast同源性比對(duì)分析。結(jié)果顯示，該序列與多株植物乳桿菌16S rRNA基因序列相似性為99%，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果如圖3所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPC-1菌株與乳桿菌屬在同一個(gè)分支，具有極高的同源性。根據(jù)形態(tài)特征、生理生化等微生物學(xué)特性及其遺傳特性16S rDNA將菌株LPC-1初步鑒定為Lactobacillusplantarum。

圖3 16S rDNA構(gòu)建的菌株LPC-1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the polygenetic analysisof 16S rDNA sequences showing the position ofstrain LPC-1

2.3 單因素對(duì)LPC-1胞外多糖產(chǎn)量的影響

2.3.1 碳源對(duì)LPC-1胞外多糖產(chǎn)量的影響

由圖4-A所示，L.plantarumLPC-1均可以利用所添加的多種碳源，但胞外多糖產(chǎn)量各異，其中以蔗糖為碳源時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量最高為1 080.86 mg/L，其次，分別為麥芽糖、葡萄糖和果糖，乳糖最低，因此選擇蔗糖作為L.plantarumLPC-1合成胞外多糖的最佳碳源。DESAI等[24]從印度發(fā)酵穇子中篩選得到1株L.plantarum，研究發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)胞外多糖的最佳碳源為乳糖。而姜云蕓等[25]對(duì)植物乳桿菌K25產(chǎn)胞外多糖影響因素發(fā)現(xiàn)，以葡萄糖為碳源時(shí)，其胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最大，可達(dá)235.4 mg/L。以上說明植物乳桿菌產(chǎn)胞外多糖對(duì)優(yōu)勢碳源的需求存在一定的菌株差異性。

不同蔗糖濃度對(duì)L.plantarumLPC-1產(chǎn)胞外多糖的影響如圖4-B所示，隨著蔗糖濃度的增加，胞外多糖的產(chǎn)量先增加后降低，當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最大1 268.19 mg/L，所以選擇蔗糖質(zhì)量濃度為30 g/L作為L.plantarumLPC-1產(chǎn)胞外多糖的最佳碳源濃度。

圖4 不同碳源和碳源濃度對(duì)L. plantarum LPC-1胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of different carbon sources and concentra-tions on the yield of EPS from L. plantarum LPC-1

2.3.2 氮源對(duì)LPC-1胞外多糖產(chǎn)量的影響

如圖5-A所示，當(dāng)以大豆蛋白胨為氮源時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最大為1 302.03 mg/L，所以選擇大豆蛋白胨為最佳氮源進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。劉晶等[26]從芬蘭傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離得到的LactobacillusparacaseiVL8，利用大豆蛋白胨為氮源，其產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最大，與本研究結(jié)果相一致。

不同大豆蛋白胨濃度對(duì)L.plantarumLPC-1胞外多糖產(chǎn)量的影響如圖5-B所示，當(dāng)大豆蛋白胨為10 g/L時(shí)，L.plantarumLPC-1胞外多糖產(chǎn)量最大，為1 309.12 mg/L，過高或過低的碳氮比均會(huì)降低胞外多糖的產(chǎn)量，所以選擇大豆蛋白胨質(zhì)量濃度為10 g/L作為L.plantarumLPC-1產(chǎn)胞外多糖的最佳氮源濃度。

圖5 不同氮源和氮源濃度對(duì)L. plantarum LPC-1胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources and concentr-ations on the yield of EPS from L. plantarum LPC-1

2.3.3 發(fā)酵時(shí)間和溫度對(duì)LPC-1胞外多糖產(chǎn)量的影響

如圖6-A所示，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)24 h時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最大，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，胞外產(chǎn)量逐漸降低，可能是由于發(fā)酵后期營養(yǎng)物質(zhì)消耗和菌體產(chǎn)生降解多糖的酶。廖乾偉等[27]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌SR2-2胞外多糖隨著時(shí)間的延長而增加，在24 h達(dá)到最大值463.64 mg/L，隨后胞外多糖產(chǎn)量逐漸降低，與本實(shí)驗(yàn)的L.plantarumLPC-1發(fā)酵條件相符合。

發(fā)酵溫度對(duì)L.plantarumLPC-1胞外多糖產(chǎn)量的影響如圖6-B所示，胞外多糖產(chǎn)量隨著溫度升高而增加，當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量最高，溫度再升高時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量有所下降。馮小婉等[28]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌AR307產(chǎn)胞外多糖最佳溫度為32 ℃，與本研究結(jié)果較為相似。

圖6 不同發(fā)酵時(shí)間和溫度對(duì)L. plantarum LPC-1胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of different fermentation time and temper-ature on the yield of EPS from L. plantarum LPC-1

2.3.4 初始pH和接種量對(duì)L.plantarumLPC-1胞外多糖產(chǎn)量的影響

由圖7-A可知，初始pH值對(duì)L.plantarumLPC-1合成胞外多糖的影響較大，L.plantarumLPC-1合成胞外多糖的初始pH值為6.5時(shí)，即弱酸性條件，L.plantarumLPC-1胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最高。王英等[29]對(duì)干酪乳桿菌FM10-3的發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的pH研究也得到了相同的結(jié)論。

接種量對(duì)L.plantarumLPC-1胞外多糖產(chǎn)量的影響如圖7-B所示，當(dāng)接種量為4%(體積分?jǐn)?shù))時(shí)，L.plantarumLPC-1胞外多糖達(dá)到最高，為1 670.00 mg/L。隨著接種量的增加，胞外多糖產(chǎn)量逐漸降低。馮美琴等[22]對(duì)植物乳桿菌70810產(chǎn)胞外多糖優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，接種量為5%(體積分?jǐn)?shù))時(shí)有利于胞外多糖的合成，與本研究結(jié)果略有差異，可能與菌株差異性有關(guān)。

圖7 不同pH值和接種量對(duì)L. plantarum LPC-1胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.7 Effects of different pH and inoculum concentrationon the yield of EPS from L. plantarum LPC-1

2.4 Plackett-Burman篩選發(fā)酵工藝條件顯著因子結(jié)果

Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示，利用Design-expert 8.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析結(jié)果如表4所示，經(jīng)過分析可以得到胞外多糖產(chǎn)量一階模型：

Y=1 224.38+19.44X1-33.88X2-46.88X3-56.30X4+14.90X5-26.49X6+140.12X7+9.62X8-43.18X9+17.54X10-3.19X11+180.03X12+165.92X13+4.69X14

2.5 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選出的3個(gè)顯著因子(溫度、pH、檸檬酸氫二銨)進(jìn)行三因素五水平的中心組合實(shí)驗(yàn)考察，測定胞外多糖產(chǎn)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示，采用Design-expert 8.0 軟件獲得擬合方程：

其中，y為胞外多糖產(chǎn)量，x1、x2、x3分別為溫度、pH值、檸檬酸氫二銨的編碼值。

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值Table 3 Plackett-Burman design matrix and results

表4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)方差分析Table 4 Analysis of variance for the Plackett-Burmandesign

表5 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值Table 5 Central composite design(CCD) matrix andresults

表6 中心組合試驗(yàn)方差分析Table 6 Analysis of variance for the central compositedesign

通過Design-expert 8.0 軟件分析可知，L.plantarumLPC-1合成胞外多糖的最佳發(fā)酵工藝條件為：溫度31.71 ℃、pH值6.68、檸檬酸氫二銨3.26 g/L，在此條件下發(fā)酵所得胞外多糖質(zhì)量濃度理論值為2 069.18 mg/L，根據(jù)實(shí)際可行操作情況，將發(fā)酵條件修正為溫度32 ℃、pH值6.7、檸檬酸氫二銨 3 g/L，采取上述優(yōu)化條件進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果測得胞外多糖平均質(zhì)量濃度為2 064.69 mg/L，與預(yù)測值基本一致。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從20株乳酸菌中篩選出1株高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌LPC-1，經(jīng)鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。本研究從碳源、氮源、發(fā)酵時(shí)間、溫度、pH值、接種量對(duì)合成胞外多糖影響的單因素基礎(chǔ)上聯(lián)合Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)和Central-Composite實(shí)驗(yàn)方法，通過顯著性分析及響應(yīng)面分析，得到最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為：溫度32 ℃、pH值6.7、檸檬酸氫二銨3 g/L，在此條件下發(fā)酵測得實(shí)際質(zhì)量濃度為2 064.69 mg/L，與預(yù)測值基本吻合，與優(yōu)化前相比增加了48.64%。

據(jù)報(bào)道，乳酸菌胞外多糖的產(chǎn)量一般都在50～800 mg/L左右，優(yōu)化后也很少達(dá)到1 000 mg/L，本實(shí)驗(yàn)篩選得到的L.plantarumLPC-1優(yōu)化前胞外多糖質(zhì)量濃度達(dá)到1 060.39 mg/L，最終優(yōu)化后，其胞外多糖質(zhì)量濃度達(dá)到2 064.69 mg/L，與現(xiàn)如今報(bào)道的乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量相比，本實(shí)驗(yàn)篩選得到的L.plantarumLPC-1胞外多糖產(chǎn)量較高，具有較大的研究價(jià)值。