王金英，曹帥，黨江波，梁國魯，楊超，張艷，陳益銀

1 西南大學(xué)，園藝園林學(xué)院，重慶北碚區(qū)天生街2號 400716；

2 中國煙草總公司重慶市公司，煙草科學(xué)研究所，重慶市北碚區(qū)天生路2號 400716

熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization, FISH）是一項利用帶有熒光標(biāo)記的核酸探針直接在染色體、細(xì)胞或組織水平定位特定靶核酸序列的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)[1]。其基本原理是：基于核酸分子堿基互補(bǔ)配對原則，利用熒光基團(tuán)標(biāo)記的核酸片段作為探針，與染色體上的特定靶核酸序列進(jìn)行雜交，形成專一的雜交分子，再用熒光顯微鏡檢測雜交信號位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)靶核酸序列在染色體上的定位[2]。熒光原位雜交在植物學(xué)中可用于染色體的識別[3-7]、基因定位[8-11]、物理圖譜的構(gòu)建[12-13]、親緣關(guān)系鑒定及多倍體起源研究[14-15]等應(yīng)用；由此可以看出熒光原位雜交技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域，具有不可替代的作用。

目前被廣泛應(yīng)用的熒光探針主要是基1987年德國Boehringer Manheims 公司推出的地高辛探針標(biāo)記及檢測試劑盒。這種探針成本較低，敏感性更高，易于檢測[16]。探針是原位雜交技術(shù)的核心，根據(jù)研究目的設(shè)計探針這一步驟至關(guān)重要。通常，探針需具適宜的長度，過長會影響探針的滲入，也會增加雜交時間，使雜交效率降低；過短則會降低探針的特異性，特異信號的強(qiáng)度較弱，使雜交信號難以檢測[17]。然而，使用短序列探針可使雜交時間縮短，提高實(shí)驗(yàn)效率。因此，開發(fā)特異性較強(qiáng)的寡聚核苷酸探針在熒光原位雜交中有一定程度的應(yīng)用，主要用于分析染色體中的串聯(lián)重復(fù)序列[18-19]。而在煙草中未見使用寡聚核苷酸為探針進(jìn)行原位雜交的報道。本文通過開發(fā)煙草18S rDNA 寡核苷酸探針，并采用較為簡易的方法進(jìn)行FISH，提供了一種簡便、快捷的煙草18S rDNA 熒光原位雜交方法。

1 材料和方法

1 .1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用材料為野生煙草N.plumbaginifolia（2n = 2x = 20）、云煙87四倍體、煙草五倍體（云煙87八倍體 × N.plumbaginifolia）、煙草六倍體（云煙87八倍體 × L-8四倍體）、云煙87八倍體。其中N.plumbaginifolia、云煙87四倍體引自中國煙草遺傳育種研究（北方）中心，煙草五倍體由云煙87八倍體與 N.plumbaginifolia 雜交獲得，煙草六倍體由云煙87八倍體與L-8四倍體雜交獲得，云煙87八倍體由本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)制，這些材料均取自重慶市果樹學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室[20-22]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 18S rDNA 長序列探針制備

（1）煙草基因組DNA 提取

采用改良CTAB 法[23]提取云煙87四倍體基因組DNA，稀釋至50 ng/μL 后備用。

（2）18S rDNA 保守序列引物設(shè)計

根據(jù) GenBank 注冊序列 N.tabacum 18S rRNA gene（AJ236016.1），使用 Prime Premier 5.0 軟件設(shè)計引物，由上海生工生物工程公司合成。

（3）保守序列克隆與標(biāo)記

采用20 μL 的反應(yīng)體系，包含ddH2O 12.3 μL；10×Buffer 2.0 μL；Mg2+1.5 μL；dNTP 2.0 μL；模版DNA 1.0 μL；Taq 0.2 μL；P(F) 0.5 μL；P(R) 0.5 μL。程序如下：95℃ 預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次，最后延伸72℃10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以此PCR 產(chǎn)物為模版，通過PCR 法進(jìn)行探針標(biāo)記。體系如下：20 μL 的反應(yīng)體系，其中包含有 ddH2O 11.8 μL；10×Buffer 2.0 μL；Mg2+1.5 μL；dNTP（含DIG - dUTP）2.5 μL；模版1μL；Taq 0.2 μL；P(F) 0.5 μL；P(R) 0.5 μL。標(biāo)記程序同擴(kuò)增程序一樣。經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后在DNA 溶液中加入1/10體積3 mol/L pH = 5.2的醋酸鈉，充分混勻，加入2倍體積-20℃預(yù)冷無水乙醇，充分混勻，-20℃靜置30 min，10000 r/min 離心10 min，移去上清液，70%乙醇洗滌，10000 r/min 離心5 min，移去上清液，置于真空干燥器中干燥，加入適量ddH2O，使DNA 溶解。

1.2.2 染色體的制備

以幼嫩的子房為材料制片得到有絲分裂中期染色體[24]：

（1）于晴天上午7:00-9:00，取煙草花序中花冠長度未及花萼長度一半的幼嫩花蕾，置于0.2 mmol/L的8-羥基喹啉溶液中；

（2）于7℃條件下48 h后用卡諾氏固定液（甲醇：冰醋酸=V : V=3 : 1）固定過夜；

（3）將固定過夜的花蕾經(jīng)去離子水漂洗，去除固定液后分解獲取子房，將子房分解為1 mm3大小的組織塊；

（4）將組織塊懸浮于混合酶液（3%纖維素酶+0.3%果膠酶，雙蒸水配制），37℃孵育1-1.5 h；

（5）將酶液吸出，緩緩加入蒸餾水，10 min后吸出蒸餾水，加入卡諾氏固定液進(jìn)行再固定；

（6）再固定20 min后即可進(jìn)行涂片并以酒精燈火焰進(jìn)行快速干燥；

（7）5% Gimusa染色后鏡檢。

1.2.3 18S rDNA 長序列的原位雜交

在云煙87四倍體有絲分裂中期染色體上進(jìn)行FISH試驗(yàn)驗(yàn)證18S rDNA探針的特異性。實(shí)驗(yàn)步驟如下[25-26]：

（1）預(yù)處理：選取分裂相多、分散好、形態(tài)舒展、背景清晰有絲分裂中期染色體制片置于 60℃ 烘箱中烘烤 1 h ；用玻璃刀在制片背面標(biāo)記出雜交區(qū)域；將制片浸入固定液或無水乙醇中褪去 Giemsa 染料；干燥后滴加 100 μg/mL RNase A，加蓋玻片，37℃ 濕盒中處理 1 h；2×SSC 漂洗 3 min，氣干；50 ng/μL 蛋白酶 K 在 37℃ 濕盒中處理 5 ～ 15 min；2×SSC 漂洗 3 min；將制片依次浸入 70%、85%、100% 的乙醇中進(jìn)行梯級脫水，每次 3 min，氣干。

（2）固定：用 4% 多聚甲醛常溫條件下處理 10 min，2×SSC（檸檬酸鈉鹽）漂洗 3 分鐘，70%、85%、100% 乙醇梯級脫水，每次 3 min，氣干。

（3）染色體制片變性：在雜交區(qū)域滴加 70% 去離子甲酰胺，加蓋玻片后在 75℃ 條件下變性 3 min，依次浸入預(yù)冷（-20℃）的 70%、85%、100% 乙醇中進(jìn)行梯級脫水，每次 5 min，氣干。

（4）雜交液的配制：用10 μL 20×SSC、20 μL 50%硫酸葡聚糖(DS)、3 μL10% SDS、1 μL 200 ng/μL探針DNA混合后用dd H2O定容至100 mL，配好后混勻，10000 r/min 離心 30～60 s。

（5）探針變性

采用熱變性法進(jìn)行探針變性，將裝有雜交混合液的 PCR 管浸入 90℃ 熱水中變性 10 min，迅速置于冰水中冷卻 10 min 以上。

（6）雜交：在雜交區(qū)域滴加適量已變性的雜交液，加蓋玻片后置于 37℃ 濕盒中雜交 16 h。

（7）洗脫：雜交反應(yīng)完成后，在暗室中，將染色體制片浸入 42℃ 0.1% SDS（2×SSC配制）漂洗 5 min；42℃ 2×SSC 漂洗 5 min；42℃ 20% 甲酰胺（0.1×SSC 配制）漂洗兩次，每次 10 min；42℃ 2×SSC 漂洗 5 min；常溫 2×SSC 漂洗 5 min；氣干。

（8）抗體孵育：滴加 5% BSA 于制片，37℃ 處理 5 min；滴加 20 ng/μL Anti - DIG - Rhodamine（5% BSA + 0.2% Tween - 20，4×SSC 配制），37℃ 孵育 60 min。

（9）洗脫：37℃ 0.2% Tween - 20（4×SSC 配制）漂洗兩次，每次 5 min；氣干。

（10）鏡檢：用含有 DAPI（4', 6-二脒基-2-苯基吲哚）的抗熒光衰減劑封片，DAPI 濃度 4 ng/μL。Olympus BX53 熒光顯微鏡鏡檢，Spot Cool CCD 采集圖像。

1.2.4 18S rDNA 寡聚核苷酸探針設(shè)計、標(biāo)記與原位雜交

（1）探針設(shè)計與標(biāo)記

選取18S rDNA 上游引物序列FITC（異硫氰酸熒光素）對其5' 端進(jìn)行修飾。對 18S rDNA 上游引物（F：5'CTGAGAAACGGCTACCACA3'）進(jìn)行 BLAST 比對，分析比對結(jié)果，確定為保守序列后合成使用。

在云煙87四倍體、煙草五倍體（云煙87八倍體 × N.plumbaginifolia）、煙草六倍體（云煙87八倍體 ×L-8四倍體）、云煙87八倍體以及N.plimbaginifolia有絲分裂中期染色體上進(jìn)行定位。染色體制片方法與1.2.2同。

（2）雜交

在前述雜交程序上稍有改動：雜交時間改為2 h，其余不變。洗脫：雜交反應(yīng)完成后，將染色體制片依次浸入42℃和常溫的2×SSC 中進(jìn)行洗脫，每次5 min，常溫空氣中干燥后觀察。以長序列探針為對照。

1.2.5 寡聚核苷酸序列探針簡化方法雜交

以N.plumbaginifolia中期染色體為材料應(yīng)用簡化方法雜交，參照陳志[19]的方法進(jìn)行：以2×SSC 配制雜交液，使探針終濃度為 2 ng/μL 進(jìn)行雜交，雜交時間為2 h，雜交后直接用2×SSC 常溫下洗脫2次，常溫空氣中干燥后觀察。

1.2.6 N.plumbaginifolia 5S rDNA 和18S rDNA雙色熒光原位雜交

（1）5S rDNA探針制備

供試探針是從擬南芥5S rDNA 序列中選取的一段長為20 bp 的高度保守序列（專利號：CN103409523A），由上海生工生物工程公司合成，并利用TAMRA （四甲基羅丹明）對其5＇端進(jìn)行修飾。

（2）雜交

5S rDNA 寡聚核苷酸探針和18S rDNA 寡核苷酸序列為探針，按前述簡易步驟進(jìn)行雜交和洗脫空氣干燥后觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 18S rDNA保守序列的引物設(shè)計與擴(kuò)增

利用Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計，取得分最高者：上游引物（F）：5' CTGAGAAACGGCTAC CACA 3'，下游引物（R）：5' CCCATCCCAAAGTCC AAC 3'，預(yù)測擴(kuò)增產(chǎn)物長度為254 bp，以此產(chǎn)物為探針進(jìn)行熒光原位雜交較為合適。

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測云煙87四倍體基因組DNA。結(jié)果顯示：提取的DNA主帶明顯（圖1a），無拖尾現(xiàn)象，點(diǎn)樣孔幾乎沒有樣品殘留，說明純度較高、完整性較好。核酸蛋白檢測儀檢測結(jié)果顯示：提取的云煙87四倍體基因組DNA 在260 nm 處有明顯的吸收峰，OD260 / OD280 在1.8 ～ 2.0范圍內(nèi)，表明DNA 純度較高，可用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳檢測18S rDNA 片段擴(kuò)增檢測，結(jié)果顯示：約 250 bp 位置處產(chǎn)生單一條帶（圖1b），與預(yù)期片段長度一致，表明18S rDNA 片段擴(kuò)增成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。地高辛的標(biāo)記作用使DNA 的分子量發(fā)生改變，因此標(biāo)記DNA 與未標(biāo)記DNA 在瓊脂糖凝膠中的泳動速度不同，標(biāo)記DNA 分子量大，泳動速度慢，表現(xiàn)為電泳條帶滯后?；诖嗽?，對未標(biāo)記PCR 產(chǎn)物和標(biāo)記PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示：標(biāo)記PCR 產(chǎn)物在250 bp 位置處產(chǎn)生單一特異性條帶，（圖1c）該條帶略微滯后于未標(biāo)記PCR 產(chǎn)物的條帶，表明探針標(biāo)記成功。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測圖a.云煙87四倍體基因組DNA 提取電泳檢測圖（箭頭指示gDNA 條帶) b.18S rDNA 片段擴(kuò)增電泳檢測圖（箭頭指示18S rDNA 條帶）c.18S rDNA 片段標(biāo)記電泳檢測圖（有尾箭頭指示未標(biāo)記的18S rDNA 條帶，無尾箭頭指示已標(biāo)記的18S rDNA 條帶）Fig.1 Agarose gel electrophoresis detection a.Agarose gel electrophoresis of genomic DNA from Yunyan 87 tetraploid (The arrow indicates gDNA band) b.Agarose gel electrophoresis of 18S rDNA fragments amplified by PCR (The arrow indicates 18S rDNA band) c.Agarose gel electrophoresis of labeled fragments of 18S rDNA (The arrow with tail indicates unlabeled 18S rDNA band, The arrow without tail indicates labeled 18S rDNA band)

2.2 18S rDNA長序列探針FISH 驗(yàn)證

為驗(yàn)證18S rDNA 探針的特異性，在云煙87四倍體有絲分裂中期染色體上進(jìn)行FISH試驗(yàn)，雜交時間為18 h。結(jié)果顯示：觀察到的特異性信號清晰而明亮，與背景熒光形成強(qiáng)烈反差，可清晰識別出8個18S rDNA 信號位點(diǎn)，（圖2）表明探針特異性強(qiáng)，其序列可用于后續(xù)寡核苷酸探針設(shè)計。

圖2 云煙87四倍體18S rDNA 長序列熒光原位雜交結(jié)果（A，DAPI；B，羅丹明信號；箭頭指示雜交信號位點(diǎn)）Fig.2 In situ hybridization results of Yunyan 87 tetraploid 18S rDNA long sequence fluorescence (A, DAPI; B, Rhodamine signal; Arrows indicate hybridization signals)

2.3 相同時間（2 h）不同引物（長序列和寡聚核苷酸序列）的FISH 驗(yàn)證

圖3 云煙87四倍體18S rDNA 長序列和寡聚核苷酸序列相同時間（2h）的原位雜交圖（A，DAPI；A1，羅丹明信號；B，DAPI；B1，F(xiàn)ITC；箭頭指示雜交信號位點(diǎn)）Fig.3 In situ hybridization results of Yunyan 87 tetraploid 18S rDNA long sequence and oligonucleotide sequence for 2h (A, DAPI; A1, Rhodamine signal; B, DAPI; B1, FITC; Arrows indicate hybridization signals)

在云煙87四倍體中，長序列探針經(jīng)2 h雜交后未見信號出現(xiàn)（圖2 A1），而寡聚核苷酸序列探針經(jīng)2 h雜交處理，即可獲得清晰雜交信號（圖2 B1 ）。寡聚核苷酸探針的位點(diǎn)數(shù)量與前述長序列探針?biāo)@得的探針數(shù)量一致。這表明寡核苷酸探針對18S rDNA 是特異的，可用于煙草18S rDNA 的染色體定位研究，且寡聚核苷酸序列探針的雜交時間可縮短至2 h，較大程度縮短了雜交時間。

2.4 基于18S rDNA寡聚核苷酸探針不同倍性煙草染色體的FISH

圖4 18S rDNA 寡核苷酸探針以及簡易步驟的FISH 結(jié)果圖18S rDNA 寡核苷酸探針在不同倍性煙草上的FISH 驗(yàn)證 （A，煙草五倍體DAPI；A1，煙草五倍體FITC；B，煙草六倍體DAPI；B1，煙草六倍體FITC；C，云煙87八倍體DAPI；C1，云煙87八倍體FITC；D，N.plumbaginifolia DAPI；D1，N.plumbaginifolia FITC）和N.plumbaginifolia 18S rDNA 寡核苷酸探針簡易步驟 FISH（E，N.plumbaginifolia DAPI；E1，N.plumbaginifolia FITC；箭頭指示雜交信號位點(diǎn)）Fig.3 The FISH result diagram of 18S rDNA oligo-nucleotide probes and the FISH verification of 18S rDNA oligo-nucleotide probes in heteroploid tobaccos (A, Pentaploid tobacco, DAPI; A1, Pentaploid tobacco, FITC; B, Hexaploid tobacco, DAPI; B1, Hexaploid tobacco, FITC; C, Yunyan87 octoploid, DAPI; C1, Yunyan87 octoploid, FITC; D, N.plumbaginifolia, DAPI; D1，N.plumbaginifolia, FITC) and photomicrographs of 18S rDNA-FISH in N.plumbaginifolia using simple procedure (E, N.plumbaginifolia, DAPI; E1, N.plumbaginifolia, FITC; Arrows indicate hybridization signals)

2.5 不同倍性煙草材料中的18S rDNA位點(diǎn)

利用寡聚核苷酸序列探針對煙草五倍體、六倍體、八倍體以及N.plumbaginifolia進(jìn)行了FISH。結(jié)果顯示在不同倍性材料中的應(yīng)用均較為良好。

煙草五倍體（圖4 A1）、六倍體（圖4 B1）、八倍體（圖4 C1）以及N.plumbaginifolia（圖4 D1）的染色體上分別能看到9個、12個、16個和2個信號位點(diǎn)，信號較強(qiáng)。結(jié)合前述云煙87四倍體的FISH結(jié)果可看出，煙草四倍體、六倍體和八倍體中18S rDNA位點(diǎn)數(shù)量與倍性呈正比，這表明在煙草基因組加倍過程中，位點(diǎn)數(shù)量無變化。五倍體煙草位點(diǎn)數(shù)目為四倍體煙草位點(diǎn)數(shù)目和N.plumbaginifolia位點(diǎn)的和，這表明遠(yuǎn)緣雜交也未使位點(diǎn)數(shù)量發(fā)生變異。

2.6 寡聚核苷酸序列探針簡易方法進(jìn)行N.plumbaginifolia染色體FISH

經(jīng)簡易步驟，即直接用 2×SSC 稀釋短序列探針至2 ng/μL 進(jìn)行FISH，得到結(jié)果顯示，雜交信號位點(diǎn)的數(shù)目與信號強(qiáng)度與常規(guī)步驟（圖4 E1和圖4 D1）所得結(jié)果相同，可以明顯判定信號位置。可見，簡易步驟可以用于18S rDNA 寡核苷酸探針雜交液的配制。

2.7 基于雙色 FISH 的 N.plumbaginifolia 5S 和18S rDNA 位點(diǎn)分析

N.plumbaginifolia中期染色體上觀察到2個5S rDNA 位點(diǎn)，染色體核型顯示其位于第1對同源染色體長臂靠近端部的位置（圖5）；觀察到兩個18S rDNA 雜交信號位點(diǎn)，染色體核型顯示其位于第8對同源染色體短臂的端部位置（圖5）；雙色熒光原位雜交實(shí)現(xiàn)了5S rDNA 和18S rDNA 在 N.plumbaginifolia 體細(xì)胞中期染色體上的同時定位，并識別出兩對染色體。

圖5 5S rDNA 和18S rDNA 寡核苷酸探針在N.plumbaginifolia 染色體上的雙色熒光原位雜交（A，DAPI；B，TAMRA；C，F(xiàn)ITC；D，B 和 C 的合成圖；有尾箭頭指示5S rDNA 雜交信號位點(diǎn)，無尾箭頭指示18S rDNA 雜交信號位點(diǎn)）Fig.4 Dual-color FISH of 5S and 18S rDNA-FISH in N.plumbaginifolia (A, DAPI; B, TAMRA; C, FITC; D, The composite image of B and C; Arrows with tails indicate 5S rDNA hybridization signals, Arrows without tails indicate 18S rDNA hybridization signals)

3 討論

探針是熒光原位雜交技術(shù)的核心。近年來，合成的寡核苷酸探針因其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)倍受關(guān)注。首先，寡核苷酸探針的長度很短，具有低序列復(fù)雜性和低分子量，容易滲透到細(xì)胞的目標(biāo)區(qū)域，因此所需雜交時間較短。據(jù)測算，長度為20 bp，濃度為100 ng/mL 的寡核苷酸探針只需10 min 就能達(dá)到其最大雜交率。而長度為2 kb，濃度為100 ng/mL 的探針需要16 h 才能達(dá)到其最大雜交率。其次，寡核苷酸探針可識別靶序列中的單堿基變化，因?yàn)槎烫结樀膯螇A基錯配能大幅降低雜交分子的Tm 值。另外，寡核苷酸探針可大量合成，因而成本低廉[27]。

本研究在經(jīng)典rDNA 熒光原位雜交程序的基礎(chǔ)上，設(shè)計出特異性良好的煙草18S rDNA 寡核苷酸探針，并將其成功應(yīng)用于不同本倍性的煙草和野生煙草 N.plumbaginifolia 18S rDNA 的染色體定位研究，解決了現(xiàn)有煙草18S rDNA 熒光原位雜交探針標(biāo)記、檢測程序復(fù)雜，雜交耗費(fèi)時間長的問題。由此我們認(rèn)為對于重復(fù)單位較短且拷貝數(shù)較高的靶序列來說，這種探針設(shè)計方法是可行的。但是，對于重復(fù)單位較長或拷貝數(shù)不是很高的靶序列來說，這種方法不能保證適用。原因可能是：靶序列重復(fù)單位較長時，與靶序列結(jié)合的探針之間的物理距離相對較遠(yuǎn)，熒光基團(tuán)無法在空間上集中形成可檢測的熒光信號；靶序列拷貝數(shù)較少時，探針與靶序列結(jié)合的數(shù)量相對較少，熒光基團(tuán)的積累量不足，導(dǎo)致雜交信號非常弱，現(xiàn)有光學(xué)手段難以檢測。靶序列重復(fù)單位長度、拷貝數(shù)與熒光信號強(qiáng)度之間的定量關(guān)系有待進(jìn)一步探究。

真核生物rDNA 是編碼各種rRNA 前體的基因，包括5S rDNA 和45S rDNA，是高度保守的串聯(lián)重復(fù)序列，其在染色體上的位置隨物種的不同而有一定差異[28]。因此，rDNA 可作為染色體精確識別的有效標(biāo)記45S rDNA 的每個重復(fù)單位依次編碼18S、5.8S 和28S rDNA。大量研究表明，45S rDNA 與核仁的形成直接相關(guān)，由它構(gòu)成的核仁組織區(qū)在形態(tài)上一般表現(xiàn)為染色體的次縊痕，與隨體相連[29]。因此，45S rDNA 信號位點(diǎn)的數(shù)目和位置可以在一定程度上反映隨體的數(shù)目和位置。18S rDNA 屬于45S rDNA 的一部分，其定位位點(diǎn)與45S rDNA 一致。

在不同的報道中，煙草的45S rDNA（18S rDNA）位點(diǎn)數(shù)量不同，如Lim等[30]報道煙草品種（系）095-55為4個，Kovarik等[31]報道煙草45S rDNA（35S rDNA）位點(diǎn)為8個，而合成煙草株系Th37-1、Th37-8和Th37-9的位點(diǎn)分別為9個、8個和10個，Kitamura等[32]報道煙草品種BY-4的45S rDNA（18S rDNA）位點(diǎn)有8個。而本研究發(fā)現(xiàn)，云煙87的45S rDNA（18S rDNA）位點(diǎn)也有8個。這說明，煙草的45S rDNA位點(diǎn)數(shù)量存在一定的變化，不同品種的位點(diǎn)數(shù)量可能會不同。45S rDNA 位點(diǎn)在部分物種中為脆性位點(diǎn)[33-34]，這可能是造成該位點(diǎn)在不同株系（品種）中呈現(xiàn)多樣化的原因。煙草的45S rDNA位點(diǎn)可能也是脆性位點(diǎn)，但這有待后續(xù)研究進(jìn)行驗(yàn)證。不同倍性煙草材料中45S rDNA位點(diǎn)數(shù)量與倍性密切相關(guān)，這說明煙草在倍性變化過程中，其45S rDNA位點(diǎn)數(shù)量為發(fā)生變異。

Villa[35]的研究表明，N.plumbaginifolia的第8對染色體帶有一個隨體，可能是重復(fù)序列的位點(diǎn)[36]。本研究在N.plumbaginifolia 體細(xì)胞中期染色體上觀察到1對18S rDNA 位點(diǎn)，位于第8對染色體的端部，表明該位置可能存在次縊痕結(jié)構(gòu)，這與Villa的研究結(jié)果相近。Cho等[37]曾報道了N.plumbaginifolia的45S rDNA位點(diǎn)和5S rDNA位點(diǎn)，雖數(shù)量與本研究相同，但其位置與本研究的結(jié)果不同，這可能是其使用的株系與本研究所使用的株系不同。

4 結(jié)論

通對野生煙草N.plumbaginifolia 18S rDNA 探針設(shè)計制作以及N.plumbaginifolia 5S rDNA 和18S rDNA 的染色體定位，得到如下結(jié)論：

（1）自行設(shè)計制作的煙草18S rDNA 熒光原位雜交探針（254 bp）特異性強(qiáng)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步設(shè)計的寡核苷酸探針（19 bp）經(jīng)過FISH 驗(yàn)證，結(jié)果表明可用于煙草18S rDNA 的染色體定位研究。簡易步驟在野生煙草 N.plumbaginifolia 染色體上的FISH 驗(yàn)證表明可用于18S rDNA 寡核苷酸探針雜交液的配制。

（2）利用已有的5S rDNA 寡核苷酸探針和自行設(shè)計的18S rDNA 寡核苷酸探針進(jìn)行雙色熒光原位雜交試驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)了5S rDNA 和18S rDNA 在N.plumbaginifolia 中期染色體上的同時定位，并識別出兩對染色體。