許大鳳，葉磊，張麗娜，韓永鏡，周本國，檀根甲

1 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，安徽 合肥 230031；

2 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽 合肥 230036；

3 安徽省煙草公司，安徽 合肥 230022

煙草根黑腐病是由根串珠霉菌（Thielaviopsis basicola）侵染引起的土傳真菌病害[1]，在我國河南、山東、云南、安徽和貴州等煙區(qū)均有發(fā)生，對煙葉生產(chǎn)危害極大[2]。煙草根黑腐病主要在根部出現(xiàn)壞死[3]，通常與煙草根腐病、煙草黒脛病等病害混合發(fā)生，由于這些病害的癥狀相似，僅憑癥狀難以準(zhǔn)確鑒定[3-4]，土壤中煙草根黑腐病菌除了用選擇培養(yǎng)基、普通PCR[5]鑒定外，康振輝[6]等應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR（real -time PCR）對該菌在土壤中的檢測方法進(jìn)行了研究。本試驗(yàn)針對煙草根黑腐菌與其它真菌的ITS序列差異，設(shè)計(jì)了一對特異性引物TbF/TbR，建立了針對煙草根黑腐菌的real-time PCR檢測方法，對田間土壤中煙草根黑腐病菌孢子量進(jìn)行定量檢測，為煙草根黑腐病的早期診斷和有效防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌培養(yǎng)和基因組DNA提取

試驗(yàn)所用的煙草根黑腐病菌株分離自皖南煙區(qū)發(fā)病植株，煙草黑脛病菌株、煙草根腐病菌株、小麥赤霉病菌株、油菜菌核病菌株和水稻紋枯病菌株均由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。轉(zhuǎn)接的菌株平板培養(yǎng)7 d后，收集菌絲，采用CTAB法提取其基因組DNA。

1.2 特異性引物的設(shè)計(jì)

依據(jù)GenBank中登錄的煙草根黑腐病菌及其近緣菌株rDNA的ITS區(qū)的序列差異，多重比對后設(shè)計(jì)煙草黑腐病菌特異引物TbF/TbR（TbF：5'-TCAT CGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCT-3'，TbR：5'-CAGGGAAGCTGTATATACAACAGCCGATG-3'），引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.3 引物特異性驗(yàn)證

選取以煙草黑脛?。≒hytophthora parasitica var.nicotianae）、煙草根腐?。‵usarium oxysporum）、小麥赤霉（Fusarium graminearum）、油菜菌核（Sclerotinia sclerotiorum）、水稻紋枯?。≧hizoctonia solani ）等田間土傳病害的病原菌來檢測引物特異性。各取濃度為50 ng/μL的DNA模板，參照康為世紀(jì)公司的2xEs Taq MasterMix（Dye）說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行凝膠電泳檢測，有條帶的產(chǎn)物送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序，驗(yàn)證引物的特異性。

1.4 引物real-time PCR的靈敏度檢測

將分離純化后到的煙草根黑腐菌用0.5%的吐溫20水溶液沖洗培養(yǎng)基，收集孢子懸液，顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算濃度后，再用0.5%的吐溫20水溶液稀釋成濃度為1×106個(gè)/mL、1×105個(gè)/mL、1×104個(gè)/mL、1×103個(gè)/mL、1×102個(gè)/mL和10個(gè)/mL的孢子懸液。分別取不同濃度的孢子懸浮液加入直徑為3 mm、5 mm的鋼珠和0.3 g 的酸洗玻璃珠在研磨器中65HZ，震蕩1 min進(jìn)行破壁反應(yīng)，再通過CTAB法提取DNA作為模板，無菌水作空白對照，每個(gè)反應(yīng)的模板取1 μL，以康振輝等[6]設(shè)計(jì) 的 引 物Tb5/Tb6（5'-TATTCATTGCTGAGTGGC -3'/5'-GGTTTTCCGGCATGTTAT- 3'）和本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物TbF/TbR，參照TaKaRa SYBR? Premix Ex Taq?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）說明書。進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.5 檢測土壤中煙草根黑腐菌的real-time PCR反應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采集皖南煙區(qū)多年未種植煙草的田塊土壤，清理雜物并滅菌烘干。將分離純化后的煙草根黑腐菌的孢子制成懸液經(jīng)顯微鏡觀察計(jì)數(shù)后，稀釋并接種到土樣中，使土壤中煙草根黑腐菌分生孢子濃度為每克土壤106、105、104、103、102、10個(gè)孢子，作為不同濃度梯度的土樣，采用康為世紀(jì)公司Soil Genomic DNA Kit試劑盒提取土壤樣品總DNA，每個(gè)土樣做三次重復(fù)，對照用未接種的土樣。

1.6 煙草土壤取樣及煙草根黑腐病調(diào)查

土壤樣品采集于皖南煙區(qū)，在宣城市黃渡鄉(xiāng)選取五塊煙田，煙田起壟后煙苗移栽前采用五點(diǎn)采樣法取樣，每個(gè)田塊按X形布點(diǎn)在田壟上采樣,取樣時(shí)去掉表層土，在5～20 cm土層深度，每點(diǎn)取樣200 g左右，裝袋密封帶回實(shí)驗(yàn)室。本次共取25個(gè)樣品，每個(gè)樣品放室內(nèi)晾干后采用四分法，康為世紀(jì)公司Soil Genomic DNA Kit試劑盒提取各土壤樣品總DNA，進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

五月份煙株旺長期，對五塊煙田進(jìn)行煙草根黑腐病發(fā)病率調(diào)查，每塊煙田隨機(jī)調(diào)查1000株。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行顯著性差異（LSD）統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性驗(yàn)證

依據(jù)GenBank中登錄根串珠霉屬（Thielaviopsis basicola）及其近緣菌株rDNA的ITS區(qū)的序列差異，利用軟件MegAlign、PrimerPremier 5.0、Oligo 6.0相結(jié)合設(shè)計(jì)一對特異性引物TbF/TbR。進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，從圖1中看到，只有第1泳道有一條獨(dú)立且清晰的150 bp左右的條帶，其它供試菌株和清水對照均沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，對第1泳道對應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果用DNA STAR軟件分析序列，比對結(jié)果與T.basicola的ITS序列100%相似，說明引物具有較強(qiáng)的特異性。

圖1 引物TbF/TbR的特異性驗(yàn)證Fig.1 The specific amplification of Thielaviopsis basicola by primer pair TbF/TbR

由圖2 TbF/TbR和 Tb5/Tb6引物的Real-time PCR反應(yīng)結(jié)果中可以看出，左圖中曲線2比曲線1進(jìn)入平臺期的循環(huán)數(shù)低，說明曲線2擴(kuò)增效率明顯高于曲線1。在右圖中，曲線1和曲線2在87.06℃時(shí)出現(xiàn)最大峰，但是曲線1出現(xiàn)多峰，87.06℃也有明顯的峰值，說明曲線2的引物特異性更強(qiáng)，real-time PCR的結(jié)果更加可靠。

圖2 引物Tb5/Tb6和TbF/TbR Real-timePCR反應(yīng)結(jié)果Fig.2 The Ct curve and melt curve of real-time PCR detection using Tb5/Tb6 and TbF/TbR as primers

表1 各濃度T.basicola分生孢子的real-time PCR反應(yīng)結(jié)果Tab.1 Results of real-time PCR of different concentrations of T.basicola conidia

2.2 引物靈敏度檢測

以10倍濃度梯度的根黑腐菌孢子提取的DNA作為模板，進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果如表1所示：用TbF/TbR進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，檢測的煙草根黑腐菌模板DNA下限在1.74 ng/μL。

2.3 不同濃度梯度接種的土樣實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

在煙草根黑腐菌不同濃度孢子的土樣中，取0.1 g提取DNA作模板，每個(gè)土樣取3次重復(fù)，以未接菌的土壤為空白對照，進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)得到CT值，結(jié)果如表2所示，各濃度孢子的土壤real-time PCR擴(kuò)增曲線如圖3所示。結(jié)果表明，所有接種的土壤都有CT值，最后的溶解曲線都是單一的峰值，且溶解溫度為84.87℃（圖4）。由表中反應(yīng)的CT值和土壤孢子量，可以計(jì)算出每個(gè)反應(yīng)體系中分生孢子數(shù)目的對數(shù)(X)和對應(yīng)的ct值(Y)之間呈線性關(guān)系，即SYBR Green qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = -1.5206x + 24.919，如圖5。

圖3 不同孢子濃度土樣的real-time PCR擴(kuò)增曲線Fig.3 The real-time PCR amplification curve of soil samples with different concentrations of spore

圖4 不同孢子濃度土樣的real-time PCR溶解曲線Fig.4 The real-time PCR melt curves of soil samples with different concentrations of spore

2.4 土壤檢測結(jié)果

圖5 10倍濃度梯度根黑腐菌孢子接種土樣的real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 The real-time PCR standard curve for soil samples inoculated by 10X concentration gradient Thielaviopsis basicola

分別在五塊煙草試驗(yàn)田中，進(jìn)行五點(diǎn)取樣，土樣檢測的結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，取自第1、2、3和4號田塊的樣品并沒有檢測到含有煙草根黑腐菌的孢子，而5號田塊能夠檢測到煙草根黑腐菌的孢子，計(jì)算得到平均每克土壤有3483個(gè)孢子。

表3 各試驗(yàn)田土壤樣品的檢測結(jié)果Tab.3 Detection results of soil samples in different plots

2.5 試驗(yàn)田發(fā)病調(diào)查

在五月份煙草旺長期時(shí)，進(jìn)行田間病害調(diào)查，以在煙草旺長期時(shí)，對田間進(jìn)行病害調(diào)查，調(diào)查時(shí)將田間萎蔫、矮化和黃葉的煙株記為發(fā)病，各田塊發(fā)病率如表4所示。從表中可以看出，5號田發(fā)病最為嚴(yán)重，達(dá)56.6%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它田塊中的發(fā)病率。

表4 各試驗(yàn)田塊根黑腐病發(fā)病率Table 4 Incidence of black root rot of tobacco in different plots

3 討論與結(jié)論

我國農(nóng)業(yè)科技工作者在煙草根黑腐病的病原鑒定和病原菌檢測方面開展了大量工作。邊傳紅[2]、竇彥霞[7-8]等對煙草根黑腐菌進(jìn)行了病原菌的分離和鑒定，確定了病原菌是T.basicola，并通過其種群內(nèi)遺傳研究發(fā)現(xiàn)，全國各地間的T.basicola的遺傳多樣性豐富，但是其在rDNA-ITS序列的差異基本沒有變化。Paulin-Mahady 等[9]對Thielaviopsis的DNA研究發(fā)現(xiàn)T.basicola和該屬的其它菌種的rDNA有明顯的不同。陸星星等[4]和趙永強(qiáng)等[5]等通過設(shè)計(jì)特異的ITS引物，成功檢測到T.basicola，康振輝等[6]通過該方法對土壤中T.basicola進(jìn)行定量研究。本研究根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)特異性引物TbF/TbR 對T.basicola的DNA進(jìn)行real-time PCR，反應(yīng)的結(jié)果與引物Tb5/Tb6的結(jié)果相比較，可以看出TbF/TbR的擴(kuò)增效率更高，特異性更強(qiáng)。之后用接種10倍濃度梯度的T.basicola孢子的土樣提取DNA作模板，用引物TbF/TbR進(jìn)行realtime PCR得到土壤孢子的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = -1.5206x + 24.919，R2=0.9909（P＜0.01），通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)結(jié)果重復(fù)性可靠，可以通過該方法定量檢測煙田土壤中根黑腐病菌T.basicola孢子。在對5塊試驗(yàn)田土壤進(jìn)行T.basicola檢測時(shí)，只有5號田檢測到T.basicola，而后期的病害調(diào)查證實(shí)田塊1、2、3和4號發(fā)病率遠(yuǎn)低于5號田塊，與上述田間的病菌量檢測結(jié)果一致。證明本研究建立的檢測方法不僅能快速的定性檢測土壤T.basicola的存在，還能進(jìn)一步準(zhǔn)確的檢測田間的土壤帶菌量。