馮雨晴，楊惠娟，史宏志

河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院/煙草行業(yè)煙草栽培重點實驗室/煙草農(nóng)業(yè)減害研究中心，鄭州市金水區(qū)文化路95號 450002

硝態(tài)氮是植物根系吸收利用的主要無機氮素形態(tài)，以硝酸鹽的形式廣泛存在于環(huán)境中[1]。硝酸鹽作為一類重要的含氮化合物，其含量的高低不僅直接影響煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量的形成，更對煙葉安全性和人體健康有著直接或間接的影響。現(xiàn)代醫(yī)學證明，人體攝入的硝酸鹽經(jīng)過體內(nèi)微生物作用還原成的亞硝酸鹽可導致血液的載氧能力下降；另一方面，亞硝酸鹽還可與人體的次級胺，如仲胺、叔胺及氨基酸反應(yīng)，在胃腔中（pH=3）形成強致癌物—亞硝胺，從而誘發(fā)人體消化系統(tǒng)癌變[2-4]；更重要的是，煙草葉片中的硝酸鹽是煙葉和煙氣中強致癌物質(zhì)煙草特有亞硝胺（TSNA）的重要前體物[5]。研究表明，TSNA主要在調(diào)制、貯存陳化過程中逐步形成和積累，在調(diào)制過程中硝酸在微生物作用下還原為亞硝酸，進而與生物堿發(fā)生亞硝化反應(yīng)[6]，在煙葉貯藏過程中硝酸鹽在高溫條件下可產(chǎn)生氣態(tài)氮氧化物，進而與生物堿反應(yīng)生成TSNAs[7-8]。TSNAs可引發(fā)動物形成肺癌、腺癌和食道癌等病變，尤其是N?-亞硝基降煙堿（NNN）和4-（N-甲基亞硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）被國際癌癥研究組織（IARC）列為最高級別I類致癌物[9-11]。白肋煙等晾曬煙煙葉TSNAs較烤煙高幾十甚至幾百倍，與其煙葉硝酸鹽含量偏高密切相關(guān)，近期研究表明，煙葉硝酸鹽含量與 TNSAs 積累呈現(xiàn)出顯著性直線相關(guān)[5]，減少煙葉中硝酸鹽積累量對于降低卷煙制品中NNN和NNK的含量至關(guān)重要[12]。關(guān)于TSNA的相關(guān)研究一直是國際煙草研究的熱點之一，減少煙氣TSNA含量的有效途徑之一是降低煙草原料中的硝酸鹽含量，這已在通過栽培、生物技術(shù)調(diào)控煙葉硝態(tài)氮含量相關(guān)研究和利用不同硝酸鹽含量的煙梗來改變卷煙硝酸鹽含量的研究中得到證實[13-15]。因此，控制和減少煙葉硝態(tài)氮積累對降低煙葉TSNA形成和提高卷煙安全性具有十分重要的意義。對此，筆者對煙葉硝酸鹽的積累與影響因素以及硝酸鹽的調(diào)控技術(shù)進行了綜述，以期為后續(xù)硝酸鹽的調(diào)控研究提供參考。

1 白肋煙硝酸鹽代謝及積累機理

硝酸鹽代謝途徑及積累機制圖如圖1所示。

外界土壤環(huán)境中的硝酸鹽通過根系表皮和皮層細胞膜上的硝酸轉(zhuǎn)運蛋白（nitrate transporters，NRT）進入根系細胞內(nèi)，是植物獲取硝態(tài)氮（即硝酸鹽）并利用的第一步，屬于根部主動跨膜運輸[16-17]。根系形態(tài)和硝酸鹽轉(zhuǎn)運效率是影響硝酸鹽吸收量的關(guān)鍵因素，此外，光照、溫度、介質(zhì)pH、呼吸抑制劑和氧化磷酸化等因素對硝酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)運速率也具有重要影響[18-19]。

圖1 硝酸鹽代謝途徑及積累機制圖Fig.1 Nitrate metabolic pathway and accumulation mechanism

煙草屬于喜硝態(tài)氮作物，對土壤中硝態(tài)氮的吸收主要是通過硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白來完成[20]。硝酸鹽的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)對于硝酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)運至關(guān)重要，根據(jù)高等植物對的親和力，將硝酸鹽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)主要分為2類，即高親和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（High-affinity nitrate transport system，HATS）和低親和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（Low-affinity nitrate transport system，LATS）。當外界硝酸鹽濃度高于0.5mmol/L時，低親和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)在轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮主要作用；當外界硝酸鹽濃度在0.1-0.5mmol/L時，高親和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)在轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮主要作用[18]。目前，關(guān)于硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運方面，人們多集中在NRT1、NRT2、CLCa/b和SLAH3等家族的研究。植物中具有與其對應(yīng)的低親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白NRT1和高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白 NRT2 兩個轉(zhuǎn)運蛋白家族，這兩個家族均由跨膜pH梯度驅(qū)動，以協(xié)同轉(zhuǎn)運機制轉(zhuǎn)運和質(zhì)子H+[21]?；騈RT/PTR FAILY3.1和NRT/PTR FAILY7.3屬于低親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運子，基因NRT2.1和NRT2.5屬于高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運子，均參與硝酸鹽轉(zhuǎn)運，對硝酸鹽分配和利用具有重要影響[22]。NRT1.1又名CHL1，是通過硝酸鹽類似物篩選氯酸鹽得到的CHL1突變體發(fā)現(xiàn)的第一個硝酸鹽運輸?shù)鞍谆騕23]。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)運子NRT1.1和NRT1.2主要在根毛和根表皮表達，NRT1.4主要在葉柄中表達，NRT1.5主要在根木質(zhì)部中柱鞘細胞表達，NRT1.8主要在維管束中木質(zhì)部薄壁細胞中表達，NRT1.9主要在根韌皮部伴胞細胞中表達，NRT1.7主要在老葉韌皮部伴胞細胞和篩板中表達，其中NRT1.4能夠調(diào)控酸鹽的動態(tài)平衡，NRT1.5、NRT1.8和NRT1.9主要參與硝酸鹽的長距離運輸，NRT1.7能夠?qū)⑾跛猁}從老葉轉(zhuǎn)運到內(nèi)葉和葉片中硝調(diào)控硝酸鹽的源-庫供應(yīng)[24-26]。在模式作物擬南芥上，硝酸鹽轉(zhuǎn)運子基因NRT1.1多在根和地上部的生長區(qū)表達[27]。2015年在秈稻中克隆到了NRT1.1B基因，研究發(fā)現(xiàn)它可以加強植物對的吸收、從地下部向地上部轉(zhuǎn)運、增強信號響應(yīng)，以此來提高作物對氮素的利用效率[28]。目前，已從煙草中克隆獲得高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白NRT2 家族成員NRT2.2、NRT2.3、NRT2.4基因，并揭示了其在硝酸鹽吸收轉(zhuǎn)運過程中的作用[29-31]。

1.2 硝酸鹽的還原和同化

植物的氮素同化作用多是從硝酸鹽的還原同化開始的，硝酸鹽被吸收進入植物根系細胞后，小部分留在根部被還原，而大部分被運送到地上部分，在硝酸還原酶（EC 1.6.6.1，nitrate reductase，NR）的作用下形成亞硝酸鹽，然后被亞硝酸還原酶（EC 1.7.7.2，nitrite reductase，NiR）進一步還原成NH3，最后NH3被谷氨酰胺合成酶（EC 6.3.1.2，glutamine synthetase，GS）作用形成谷氨酰胺和谷氨酸，隨后能夠發(fā)生氨基轉(zhuǎn)化形成各種氨基酸進入植物體代謝活動[32]。

1.2.1 硝酸還原酶的作用

NR是硝酸鹽代謝途徑的第一個酶，也是硝酸鹽還原的限速酶[33]。NR主要分布在植物的根、莖和葉中，并定位于細胞質(zhì)中，其活性大小因物種、品種、年齡、部位等因素不同而不同。硝酸還原酶屬于典型的誘導酶，其活性受底物濃度、激素、光、溫度、CO2和氧氣等環(huán)境條件的調(diào)控。SOOD等[34]研究發(fā)現(xiàn)，能誘導NR活性，而則會抑制NR活性；在冬小麥上研究發(fā)現(xiàn)，高溫能引起葉片NRA下降[35]。另外，NR基因表達水平還易受碳水化合物、亞硝酸鹽、谷氨酰胺和等物質(zhì)的影響。NR在光下發(fā)生去磷酸化，引起NRA升高；同時光合作用和碳水化合物可為硝酸鹽還原同化過程提供必須的能量，而亞硝酸鹽、谷氨酰胺和作為硝酸鹽代謝產(chǎn)物能對其代謝過程進行反饋調(diào)節(jié)[36-37]。在擬南芥中編碼NR的主要有兩個基因AtNIA1和AtNIA2，這兩個基因的表達受誘導，它們編碼蛋白的活性也受多種因素的影響，如光照、pH、供氧量等[38-39]。

1.2.2 谷氨酰胺合成酶的作用

硝酸鹽經(jīng)NR和NiR還原后形成NH3，而NH3需要被谷氨酰胺合成酶（GS）同化才能完成氮素還原同化過程[40]。GS是NH3同化的中心酶，也是植物催化無機氮向有機氮轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，對氮素利用具有重大貢獻。GS對NH3的親和力較強，能在低濃度下結(jié)合NH3，對減少細胞氨積累和避免氨損害現(xiàn)象有重要作用[41]。谷氨酰胺和谷氨酸是GS同化硝酸鹽的產(chǎn)物，能為蛋白質(zhì)和葉綠素等生物合成提供氮素供體。GS具有多種同工酶形式，在高等植物中，主要存在2種GS同工酶:胞質(zhì)型，又稱胞液型，GS1，主要位于細胞質(zhì)中；葉綠體型或質(zhì)體型，又稱GS2，其中在葉片中主要位于葉綠體中稱為葉綠體型，而在根中主要存在于質(zhì)體中稱為質(zhì)體型[42]。有研究指出，GS1基因主要參與種子萌發(fā)時營養(yǎng)貯藏和葉片衰老時氮素再利用的運轉(zhuǎn)工作，而GS2基因主要參與光呼吸中NH3、硝酸鹽還原NH3以及循環(huán)NH3的同化利用活動[43]。

1.3 硝酸鹽的貯存和再利用

植物吸收的部分硝態(tài)氮會在根部被還原為亞硝態(tài)氮，但大部分則通過蒸騰作用以形式經(jīng)木質(zhì)部輸送到地上部的莖、葉等器官，分布于細胞的液泡和原生質(zhì)中。在植物細胞中，硝酸鹽多數(shù)是貯藏在液泡（儲存庫，storage pool，SP）中，而僅有一小部分存在于細胞質(zhì)（代謝庫，metabolism pool，MP）[44]。由于硝酸還原酶主要存在于原生質(zhì)中，其中的硝酸鹽可以迅速還原，不易累積；而液泡中的硝酸還原酶活性低，硝酸鹽難以被還原，因而較易累積。這可能是造成硝酸鹽累積的一個重要原因。揭示硝酸鹽在液泡膜的轉(zhuǎn)運調(diào)控機制，調(diào)動植物兩個硝酸鹽庫中的硝酸鹽使之得到更高程度的再利用，是提高植物氮素利用效率和降低植物體內(nèi)硝酸鹽含量的有效途徑之一[45]。在煙草生產(chǎn)中，一般氮肥施用時間較早，煙株在生長中后期可能會出現(xiàn)缺氮或低氮情況，儲存庫的硝酸鹽會釋放到代謝庫中以維持正常代謝活動。CLCa和CLCb定位于液泡膜，被認為是負責硝酸鹽從液泡出入的轉(zhuǎn)運子[46-47]。在擬南芥上發(fā)現(xiàn)，氯離子通道（CLC）基因家族中共有7位成員參與了硝酸鹽在液泡膜內(nèi)外的轉(zhuǎn)運，改變其中的任一位成員都將影響硝酸鹽在葉片中的積累[48]。另外，GS1基因在氮素轉(zhuǎn)運和循環(huán)中起關(guān)鍵作用，該基因過表達后能明顯提高氮代謝、生物量和產(chǎn)量，GS2基因?qū)μ岣叩乩煤透纳妻r(nóng)藝性狀等方面有顯著影響[49]。

2 影響硝酸鹽積累的因素

2.1 遺傳因素

一般情況下，煙草中硝酸鹽的含量因基因型而異，由烤煙的0.10%至白肋煙的3.3%不等，曬煙和雪茄煙硝酸鹽含量也較高[50]。趙曉丹[51]等選取不同類型和品種煙葉進行比較，發(fā)現(xiàn)其硝酸鹽含量差異顯著。不同類型和品種間煙葉硝酸鹽含量的差異多是由遺傳因素控制，主要表現(xiàn)在硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運、硝酸鹽同化利用以及氮效率差異等方面，白肋煙氮效率低，最適施氮量達15-18kg/667m2，烤煙最適施氮量為3-6 kg/667m2，曬煙介于兩者之間。李亞飛等[52]研究表明，煙葉硝酸鹽積累與碳氮代謝關(guān)鍵基因及轉(zhuǎn)錄因子關(guān)系密切。

2.1.1 氮代謝關(guān)鍵基因

硝酸鹽還原同化基因NR和GS對硝酸鹽調(diào)控有重要意義，與烤煙相比，白肋煙煙葉NRA和GSA顯著低于烤煙，造成其硝酸鹽大量積累[52]。煙葉氮同化相關(guān)基因（NIA1、NIA2、GS1、NDHA-1）表達水平低于烤煙，是引起白肋煙煙葉硝酸鹽積累的直接原因[53]。目前，已經(jīng)成功從煙草中克隆出高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因 NRT2 家族成員AtNRT2.2、AtNRT2.3、AtNRT2.4，并揭示了其在硝酸鹽吸收轉(zhuǎn)運過程中的作用[29-30,31]，為進一步通過分子改良進行氮素營養(yǎng)調(diào)控提供了理論依據(jù)。

2.1.2 碳代謝關(guān)鍵基因

白肋煙是一種Yb基因突變體，其煙葉色素含量僅為普通綠色煙草的1/3左右，對光合作用不利[56]。Lewis等[57]研究表明，白肋煙Yb基因突變引起其氮效率下降，白肋煙吸收氮較多，而光合速率弱，光合產(chǎn)物少，因此被同化的氮素較少，多余氮未被利用以硝態(tài)氮形式儲存。與烤煙相比，白肋煙煙葉碳固定和糖類物質(zhì)合成相關(guān)基因（CP12-2、ATJ8、EGY1、GDHA、AGPS1、SPS2、SUS2、DPE2、TPS11）表達水平較低，造成煙葉碳水化合物的形成和積累較少，能量供應(yīng)不足是硝酸鹽大量積累的根本原因[52]。

2.2 發(fā)育因素

同一品種不同部位間硝酸鹽含量有所差異，在植株體內(nèi)，新生的部位活性強，不易積累硝酸鹽，而老組織活性較弱，積累硝酸鹽能力較強。試驗表明，不同部位烤后煙葉硝酸鹽含量表現(xiàn)為中部葉＞上部葉＞下部葉[58]。煙草葉片和煙梗在化學組成上差異較大，與調(diào)制后葉片相比，煙梗的硝態(tài)氮含量和 TSNAs 積累量顯著高于葉片[59]。

2.3 生理因素

從生理學的觀點來看，進入植物的硝態(tài)氮必須經(jīng)過硝酸還原酶的作用還原成氨，才能形成氨基酸和蛋白質(zhì)，參與植物的氨代謝過程。因此，氮代謝關(guān)鍵酶活性對于硝酸鹽積累量具有很大影響。碳氮代謝是植物活動的基礎(chǔ)代謝，兩者密切相關(guān)。氮代謝為煙株碳代謝提供氨基酸、酶蛋白和光合色素[60]。光合作用及其產(chǎn)物為硝酸鹽還原同化作用提供碳骨架和能量動力，對植物硝酸鹽積累具有重要影響[61]。在大麥和玉米作物色素缺乏突變體中，其NRA較野生型品種下降30%-40%，與其突變體的色素含量下降，光合產(chǎn)物減少，還原作用活動所需的能量供應(yīng)和還原力降低密切相關(guān)[62]。有研究表明，白肋煙氮素還原能力比烤煙弱，是其硝酸鹽大量積累的直接原因，色素含量低、光合作用和碳固定能力弱從而導致不能為其氮代謝過程提供充足的能量，是其硝酸鹽大量積累的主要原因[52]。

2.4 生態(tài)因素

生態(tài)條件主要包括氣象條件和土壤條件，是影響烤煙煙葉化學成分的重要影響因素。氣象條件是指煙葉生長所處的氣候因子，包括光照、溫度、降雨量以及空氣的相對濕度等；土壤條件是指植煙土壤的各種理化性質(zhì)包括土壤的pH值、有機質(zhì)、大中微量元素、松緊度、含水量等等，古戰(zhàn)期等從氣候和土壤等方面表述了其對烤煙煙葉化學成分的影響，對優(yōu)質(zhì)烤煙生產(chǎn)提供理論參考[63]。

光照強度通過影響光合作用調(diào)節(jié)硝酸還原酶活性，最終影響植株體內(nèi)累積，光周期縮短和弱光照均會導致的累積[64]。Burton等[65]把一片煙葉分成41塊，分析其和分布和關(guān)系，得出最高出現(xiàn)在葉片基部，朝葉尖方向降低。光作為重要的生態(tài)環(huán)境因子通過調(diào)節(jié)的吸收、基因表達和硝酸還原酶活性來調(diào)節(jié)氮代謝[66-67]。高祖民等[68]指出，在遮光處理條件下，小白菜體內(nèi)硝酸鹽積累量是不遮光條件下的30多倍。王德芳[69]研究表明在正常光照條件下光合作用良好，植株生長量大，吸入的硝酸鹽被稀釋而不致累積很多，同時光合作用可提供硝酸還原酶的能量，使之轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮，也有利于減少硝酸鹽的累積。

硝態(tài)氮的吸收、運輸與水分的運動密切相關(guān)。質(zhì)流是水分驅(qū)動的物質(zhì)運動，蒸騰作用的持續(xù)進行，使溶解于水中的硝態(tài)氮向植物體內(nèi)各處遷移，分布于不同器官的組織內(nèi)部及外部空間的水分中，因此，硝態(tài)氮的代謝過程離不開水分。干旱情況下，硝酸還原酶活性受抑制，硝態(tài)氮的積累顯著增加[71]。因此，合理灌水是調(diào)控煙葉硝態(tài)氮含量的重要手段。

土壤是煙葉生長的基礎(chǔ)，土壤肥力水平與煙葉硝酸鹽積累關(guān)系密切。許自成等從土壤有機質(zhì)含量、pH值、主要營養(yǎng)元素等土壤肥力因素對烤煙葉片硝酸鹽積累影響進行闡述[72]。土壤有機質(zhì)含量是表征土壤供氮能力的重要指標，陳偉等[73]研究表明，不同等級煙葉硝酸鹽含量與土壤有機質(zhì)呈極顯著正相關(guān)。

2.5 栽培因素

磷、鉀肥在促進了一系列生理活動的同時，促進了無機態(tài)氮化合物合成蛋白質(zhì)，從而減少了硝酸鹽含量[77]。磷是煙草NR和NiR的重要組成成分，對煙草氮素吸收和同化具有重要的影響[58]。鉀離子可提高植株硝酸鹽酶活性，降低硝酸鹽含量，與硝酸鹽含量呈極顯著負相關(guān)[78]。氯離子同時對硝酸根離子有拮抗作用和取代效應(yīng)，可以抑制硝化細菌的活性，促進氨基酸含量增加并合成蛋白質(zhì)，從而降低植株硝酸鹽含量[79]。Hitoshi研究表明：缺鋅時，煙草的RNA含量顯著下降，使RNA的代謝受阻進而影響蛋白質(zhì)的合成，造成硝酸鹽的積累[80]。

土壤中Ka、Ca、Mg元素含量決定了土壤pH，土壤pH值又直接影響硝酸鹽和亞硝酸鹽吸收和積累，因此，它們在植物N素轉(zhuǎn)化中起了很重要的作用[81]。在眾多微量元素中，鉬對植物硝酸鹽積累的影響最為明顯。鉬是NR的重要組分，鎢和鉬是同族元素，與鉬存在競爭關(guān)系，缺鉬或施用鎢元素會抑制NR活性，引起植株硝酸鹽積累[82-83]。

目前烤煙生產(chǎn)中，肥料多采用條施和穴施的方式施入，肥料利用率較低[84]。張學軍等[85]研究表明，不同施氮處理對土壤溶液硝態(tài)氮含量有直接影響，采取滴灌施肥技術(shù)可以在不影響產(chǎn)量的條件下減少施氮量，從而降低蔬菜硝酸鹽含量。

種植密度是決定作物有效截光葉面積、影響群體光合效能和田間微氣象的主要因素, 而留葉數(shù)則直接影響烤煙打頂后干物質(zhì)的生產(chǎn)與分配[86]，研究表明，種植密度及留葉數(shù)對烤后煙葉硝酸鹽含量的影響明顯[87]。種植模式對煙草產(chǎn)質(zhì)量、養(yǎng)分利用和土壤理化性質(zhì)有很大影響，烤煙連作顯著降低烤煙根、莖和葉的生物量[88]，同時造成煙地養(yǎng)分比例失調(diào)[89]。

打頂在促進根系發(fā)育的同時，促進對氮素的吸收，硝酸還原酶作為一種誘導酶，其活性也得到加強，因而促使硝態(tài)氮含量下降。研究表明，不同打頂時間對硝態(tài)氮含量影響不同，第一朵中心花開放時進行打頂是保證煙葉中硝酸鹽含量適量的有效方式[90]。

3 降低硝酸鹽積累技術(shù)

3.1 運用生物技術(shù)和遺傳育種進行品種改良

篩選低硝酸鹽積累的優(yōu)良品種是降低硝酸鹽積累的一種有效途徑，根據(jù)目標，選用合適的親本是快速且高效地培育優(yōu)良品種的有效方法[91]。隨著分子生物學的發(fā)展，人們逐漸開始采用生物技術(shù)進行品種改良，能達到事半功倍的效果。Lu等[92]以白肋煙為材料，通過表達NiA基因以獲得高NR活性的植株，在晾制結(jié)束后發(fā)現(xiàn)，煙葉硝酸鹽和TSNAs均有明顯降低。Quillere等[93]對煙草植株過表達NR基因，發(fā)現(xiàn)對葉片內(nèi)的含量降低的影響十分顯著。GS同工酶作為氮素代謝的核心之一，是作物體內(nèi)氮素同化和轉(zhuǎn)移再利用的關(guān)鍵酶。Oliveira等[94]研究表明，GS1基因過表達煙株葉片的鮮重、干重、可溶性蛋白含量和谷氨酰胺合成酶活性都明顯增加。Zheng等[95]發(fā)現(xiàn)過表達苧麻BnGS1-2基因的煙株對氮素的吸收和同化能力增強，并導致株高增加且鮮重和干重提升。

有報道表明，硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的過量表達可顯著提高作物的氮素利用效率和產(chǎn)量[96-97]。朱思慧等[98]成功將吊蘭的NRT 基因 CcNPF8.3.1（Protein NRT1/PTR Family 8.3）、NRT 基 因 CcNPF8.3.2、NRT 基因 CcNPF5.2和NRT 基因 CcNPF8.1轉(zhuǎn)入到雙缺陷型多形漢遜酵母和煙草中，NRT 基因的表達在一定程度上提高了對硝酸鹽的吸收轉(zhuǎn)運功能和植株的抗病性。據(jù)報道，在不影響產(chǎn)量的情況下，白肋煙氮素轉(zhuǎn)運蛋白基因CLC-Nt2的下調(diào)使其硝酸鹽含量降達60%-70%[12]。

如今，陸續(xù)有研究借助葉綠體基因工程分別將藍細菌和藻類的CO2固定機制引入到煙草中，通過改良煙草葉綠體基質(zhì)上的 RuBisco 酶來提高 CO2的固定速率[99-100]。除此之外，將擬南芥中編碼果糖 1，6 - 二磷酸醛縮酶（Fructose 1，6-bisphosphate aldolase）的基因AtptAL 轉(zhuǎn)入到煙草葉綠體中，其醛縮酶活性較野生型煙草提高1.4～1.9 倍，在高 CO2濃度下可達 2.2 倍，能夠促進 CO2的固定，提升光合效率[101]。此項技術(shù)有利于改善白肋煙葉色突變的缺陷，從而有助于減少硝酸鹽的積累。

煙草不同品種間的氮肥利用率存在很大的差異，沈善敏等[102]認為，通過品種改良可使氮肥利用率提高20%～30%，因此篩選氮高效品種或基于氮高效功能基因為靶標的分子育種應(yīng)是提高氮肥利用率最有效的生物學途徑[103-105]。

3.2 運用化學手段調(diào)控生理代謝

硝酸鹽吸收、轉(zhuǎn)運和還原同化過程復雜，易受硝化抑制劑、激素、碳水化合物等化學物質(zhì)的調(diào)控[106]。液泡膜H+焦磷酸酶（V-PPase）能促進營養(yǎng)貯藏，而液泡膜ATP酶（V-ATPase）能抑制營養(yǎng)貯藏，V-PPase和V-ATPase抑制劑能促進NR活性而降低植株組織硝酸鹽含量[107]。氮抑制劑能控制硝化速度，減少氮素的損失，從而提高氮肥利用率[108]。國內(nèi)外的研究表明氮抑制劑對蔬菜的硝酸鹽積累有明顯的抑制作用，目前常用的氮抑制劑有雙氰胺（DCD），與只施尿素相比， 硝酸鹽含量明顯下降，用量以占總施入純氮量的 10 % ～20 %為宜[109]。葉面噴施 0.05 %濃度的鉬肥水溶液和 DCD復合施用其降低硝酸鹽的效果是兩者的和[110]。陳翔等[13]在四川達州研究表明，白肋煙施氮量為210kg/hm2時，采用現(xiàn)蕾打頂結(jié)合打頂后涂抹仿生型信號分子 （Bionics Signal Molecule，BSM）的方法能夠有效降低上部葉硝酸鹽含量。在白肋煙打頂后，噴施生長素、萘乙酸和水楊酸等激素物質(zhì)能調(diào)控煙葉硝酸鹽含量[7]。在旺長期噴施鉬酸鈉同時在成熟期噴施鉬酸鈉和草丁膦的方法有利于促進煙葉發(fā)生氨氣揮發(fā)現(xiàn)象，可有效促進煙葉氮素還原同化，使調(diào)制后煙葉硝酸鹽含量下降47%，進而降低煙葉TSNA含量[111]。

碳氮代謝是植物活動的基礎(chǔ)代謝，兩者密切相關(guān)。噴施丙三醇、殼寡糖和海藻糖等外源糖類均有助于提高煙葉色素含量和光合作用，降低硝酸鹽含量[112-114]。

3.3 合理肥料運籌進行營養(yǎng)調(diào)控

土壤有機質(zhì)含量的高低會影響氮 、磷、硫和其它營養(yǎng)元素的供應(yīng)。史宏志等[115]研究表明施氮量和基追肥比例對肥料氮的吸收利用率均有顯著影響，在0～255 kg/hm2施氮范圍內(nèi)，以施氮量 210 kg/hm2，基肥比例為40%～60%為好。陳翔等[13]研究表明，在施氮量為210 kg/hm2時白肋煙煙葉中的硝酸鹽積累量最低。在進行優(yōu)化施肥時，除考慮施氮量外，氮肥的施用方式也是影響煙葉硝酸鹽含量的重要因素，孫澤東等研究表面滴灌施肥技術(shù)將滴灌與施肥相結(jié)合，能夠提高肥料利用率，促進烤煙氮素吸收和利用[116]。同時在一定氮素水平下，合理搭配使用不同形態(tài)氮肥，對減少煙株含量具有一定效果[102]。高秀瑞等[117]在研究中發(fā)現(xiàn)，采用甘氨酸替代部分硝態(tài)氮肥料的方法能有效地降低硝酸鹽含量。運用水肥一體化等先進的高效施肥方式可顯著提高煙株的NR活性和NITR基因的相對表達量，提高氮肥利用率[118]，與減氮相結(jié)合可顯著降低煙葉硝態(tài)氮積累。

氮、磷、鉀比例失調(diào)，也是硝酸鹽積累的一個重要因素。研究表明，在氮磷肥充足的情況下，葉面噴施鉀肥能顯著降低烤煙煙葉硝酸鹽含量[119]。氯離子通過對硝酸根離子的拮抗作用和取代效應(yīng)，抑制硝化細菌的活性，促進氨基酸含量增加并合成蛋白質(zhì)，從而降低植株硝酸鹽含量[79]。因此對少數(shù)缺氯土壤可適當施用含氯肥料。煙田施用硼、鋅、鉬微肥后，烤煙質(zhì)量和品質(zhì)明顯改善[120]。施用鉬肥后，煙葉NR活性和葉綠素含量升高，光合作用增強，硝酸鹽含量下降[121]。研究表明，在旺長期噴施鉬酸鈉后，煙葉NR和GS活性升高，硝酸鹽還原同化作用增強，對降低煙葉硝酸鹽含量有利[111]。

3.4 其它農(nóng)藝措施

光合作用與硝酸鹽的含量密切相關(guān)，充足的光照能促進氮代謝。因此，為了減少硝酸鹽的積累，需要改進光照條件，合理安排煙葉的栽植密度和留葉數(shù) ，從而避免煙葉上下棚葉位之間的相互遮陰。Steingrover等[122]在晚上增加幾小時的低光照處理，能夠降低液泡中的硝酸鹽含量。水分缺乏會抑制NR的合成，引起煙葉硝酸鹽大量積累，而適量的灌水處理能明顯降低煙葉硝酸鹽含量[71]?？緹熭喿髂苡行Ц纳仆寥牢⑸锃h(huán)境[123]，提高煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量，促進肥料利用率，對降低煙葉硝酸鹽含量有利[124]。

嫁接作為一種栽培技術(shù)手段被廣泛應(yīng)用，在適宜的環(huán)境條件下，嫁接植株的根系活力明顯提高，葉片數(shù)目大幅度增加，同時光合生產(chǎn)能力得到了提升[125-127]。嫁接玫瑰中，利用特定的砧木能刺激 NR 的活性和對氮素的吸收能力[128]。嫁接甜瓜中的氮素含量、關(guān)鍵酶活性、酶活基因相對表達量、轉(zhuǎn)運蛋白基因（CmNRT2.4、CmNRT2.5）和控制轉(zhuǎn)錄因子HY5的基因相對表達量均顯著高于自根甜瓜幼苗，地上部生物量顯著增加，生長勢和氮代謝能力增強[129]。研究表明，烤煙嫁接苗氮代謝關(guān)鍵酶活性和葉綠素含量均高于自根苗，對降低硝酸鹽積累量有利[130]。

4 展望

硝酸鹽是煙葉TSNAs形成的重要前體物，煙葉硝態(tài)氮含量增高是造成煙葉調(diào)制和貯藏過程中TSNA形成的重要因素，在明確硝酸鹽積累機理的基礎(chǔ)上，采取遺傳改良和生理、農(nóng)藝調(diào)控技術(shù)降低硝態(tài)氮積累，是降低煙葉TSNA含量、提高煙葉安全性的重要途徑，也是煙草科研的重要方向。硝酸鹽積累量與氮效率密切相關(guān)，提高氮效率，減少氮肥施用量，可有效降低煙葉硝態(tài)氮積累。因此，降低煙葉硝酸鹽含量對于減氮增效，促進煙葉優(yōu)質(zhì)高效生態(tài)安全意義重大。

硝酸鹽代謝途徑主要包括硝酸鹽吸收、轉(zhuǎn)運和還原同化環(huán)節(jié)，易受品種、施肥、光、溫度、水分、土壤pH等環(huán)境因子的影響，煙葉硝酸鹽積累是復雜代謝后的綜合表現(xiàn)。以往對于降低硝酸鹽的研究多集中在耕作、施肥及土壤改良方面，這些以調(diào)控外界環(huán)境為主導的植物營養(yǎng)調(diào)控手段有一定的局限性。煙葉硝酸鹽含量的差異多是由遺傳因素控制，如何通過基因工程等生物技術(shù)手段選育低硝酸鹽白肋煙品種仍是研究的重點方向。目前，已經(jīng)篩選到控制硝酸鹽積累的一些關(guān)鍵基因，但這些基因與硝酸鹽積累的關(guān)系需進一步驗證，對控制硝酸鹽積累的關(guān)鍵基因需進一步挖掘。加上氮代謝與碳代謝的偶聯(lián)關(guān)系，對于碳代謝過程中關(guān)鍵酶基因及轉(zhuǎn)運蛋白對硝酸鹽積累的作用尚有待探究。

煙草是產(chǎn)量、品質(zhì)嚴重依賴硝態(tài)氮的作物，煙葉硝態(tài)氮含量受氮肥種類及用量、土壤供肥特性、品種對氮素利用效率和利用模式等因素的綜合影響，因此必須注重多種途徑和技術(shù)的結(jié)合，比如提高氮素還原同化能力與增加光合碳固定轉(zhuǎn)化能力相結(jié)合，提高氮素利用率與氮肥減量和調(diào)整形態(tài)相結(jié)合，減少有害物質(zhì)形成與優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)相結(jié)合等，有效促進優(yōu)質(zhì)低害煙葉生產(chǎn)。