白戈，楊大海，姚恒，謝賀

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，育種與生物技術(shù)研究中心，云南昆明圓通街33號(hào) 650021

外界環(huán)境條件能夠顯著地影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，植物為了能夠適應(yīng)外界逆境條件，進(jìn)化出了復(fù)雜的生理及分子響應(yīng)機(jī)制[1-3]。已發(fā)現(xiàn)多種植物基因參與到植物抗逆過(guò)程，如bHLH蛋白、NAC蛋白、AP2/EREBP等轉(zhuǎn)錄因子尤為重要[2,4-5]。其中一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子Stress Associated protein （SAP）基因家族在調(diào)控植物抗逆過(guò)程中非常重要。該基因家族的大多數(shù)基因具有兩個(gè)鋅指基序，在N端具有一個(gè)A20結(jié)構(gòu)域，在C端具有一個(gè)AN1鋅指結(jié)構(gòu)域[6]。

水稻的OSISAP1及OSISAP8基因能夠被諸如冷、脫水、鹽、重金屬、傷害及ABA等多種逆境條件誘導(dǎo)，在水稻中過(guò)表達(dá)OSISAP1能夠誘導(dǎo)WRKY76、OsRCI2-5等抗逆基因表達(dá)并提高水稻抗旱能力[7]。在煙草中過(guò)表達(dá)OSISAP1及OSISAP8基因會(huì)提高煙草的耐冷性、耐旱性、耐鹽性[6,8]。水稻已鑒定出一組A20/AN1類(lèi)型的鋅指蛋白，包括ZFP177、ZFP181、 ZFP176、ZFP173、ZFP181、ZFP176及ZFP157，這些基因能夠被冷、干旱及雙氧水脅迫誘導(dǎo)。在煙草中過(guò)表達(dá)ZFP177能夠提高煙草對(duì)高溫及低溫的抗性，但該轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)干旱及鹽脅迫更敏感[9]。在擬南芥中過(guò)表達(dá)擬南芥內(nèi)源AtSAP5基因能夠顯著的提高擬南芥的抗旱性，該基因所對(duì)應(yīng)的T-DNA插入突變體則對(duì)干旱脅迫表現(xiàn)敏感[10]。SAP類(lèi)鋅指蛋白在植物干旱等逆境中發(fā)揮功能，其部分成員的抗旱功能在擬南芥、水稻等多個(gè)物種中得到了驗(yàn)證，但在茄科物種中物種自身的SAP類(lèi)基因在干旱條件下的作用研究較少。本文克隆了煙草中NtSAP5基因并對(duì)該基因的組織特異表達(dá)及干旱條件下的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)過(guò)表達(dá)后的抗旱表型進(jìn)行分析，為研究煙草對(duì)干旱響應(yīng)及抗旱分子機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料、種植條件及干旱脅迫處理

用于基因表達(dá)分析的煙草栽培品種K326，種子由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院保存。K326種子在花盆中萌發(fā)，在16小時(shí)光照、28℃，8小時(shí)黑暗、23℃培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng)。

本文采用了2種干旱處理?xiàng)l件：一是6～7葉煙草幼苗，移出花盆，清水漂去根部的培養(yǎng)基質(zhì)，用濾紙吸干根部水分；然后將煙草植株整體在空氣中干燥，在處理的0 h、0.5 h、1 h取葉片樣品，方法詳見(jiàn)文獻(xiàn)[7]；二是6～7葉時(shí)煙草幼苗停止?jié)菜?天，觀察抗旱表型。取樣樣本液氮速凍，保存于-80℃中用于RNA提取。

1.2 煙草RNA提取與cDNA制備

采用Qiagen RNeasy mini plant kit（Cat 74104 ）提取煙草的RNA。在冰上準(zhǔn)備10 μL的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，包括2 μg總RNA、1 μL的50 μM oligo（dT）和1 μL的10 mM dNTP和適量經(jīng)DEPC處理過(guò)的水，將該體系在65℃溫浴5 min后，迅速置于冰上1 min。

將上述體系中加入2 μL的10× RT Buffer、4 μL的25 mM MgCl2、2 μL的0.1 M DTT、1 μL的RNaseOUT（40 U/μL）和1 μL的SuperScript III RT（200 U/μL）后，在50℃下保持50 min，并在85℃下使酶失活、在冰上冷卻終止反應(yīng)，即獲得cDNA。

1.3 基因克隆

根據(jù)中國(guó)煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)基因ID Ntab0877490設(shè)計(jì)引物，采用PCR方法克隆獲得候選基因片段，PCR擴(kuò)增的詳細(xì)步驟及注意事項(xiàng)請(qǐng)參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（上冊(cè)）》?？寺∩嫌我颪tSAP5-F：5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGC ATGGCTCAGAGAACAGAGAAAG-3',下游克隆引NtSAP5-R：5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAG CTGGGTCTCAAAGTTTAACGATCTTCG -3'。（標(biāo)下劃線部分為gateway接頭序列，用來(lái)發(fā)生重組反應(yīng)將序列導(dǎo)入到pDONR-Zeo載體中）根據(jù)gateway BP反應(yīng)將擴(kuò)增獲得到的片段通過(guò)重組反應(yīng)導(dǎo)入到pDONR-Zeo載體中。然后將含有NtSAP5序列的pDONR-Zeo通過(guò)LR反應(yīng)導(dǎo)入到gateway過(guò)表達(dá)載體pB2GW7中。

1.4 植物轉(zhuǎn)基因

將含有NtSAP5片段的pB2GW7載體通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404中。然后采用葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草品種K326。通過(guò)Basta抗生素篩選獲得具有NtSAP5基因的過(guò)表達(dá)材料。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR

反應(yīng)體系為20 μL，包括 10 μL 的2× SYBR buffer，1 μL的cDNA，正向、反向引物各1 μL，7 μL的水。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃，1 min；94℃，30 sec，58℃，30 sec，40個(gè)循環(huán)；72℃，5 min。

所有qRT-PCR進(jìn)行三次重復(fù)，以煙草內(nèi)源26s核糖體 RNA基因?yàn)閮?nèi)參。內(nèi)參引物：26S-F 5' -GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3'；26S-R，5'- TCTCCCTTTAACACCAACGG-3'?；蛱禺愐铮篘tSAP5-qRT-F，5'-CCAAGGTCGCATATCCTCAT-3'；NtSAP5-qRT-R，5'-GCCGGTTAATCCTAGCTTCC-3'。2-ΔΔCT方法計(jì)算倍數(shù)變化，三次生物學(xué)重復(fù)計(jì)算±SD，Error bars為±SD（n = 3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtSAP5序列信息

在中國(guó)煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中查找到該基因ID為Ntab0877490.1，該基因與擬南芥中AtSAP5基因最為同源，因此將該基因命名為NtSAP5。設(shè)計(jì)特異引物通過(guò)克隆獲得NtSAP5的CDS編碼區(qū)，該片段大小為500 bp左右。通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)煙草NtSAP5基因的CDS序列為474個(gè)堿基，編碼281個(gè)氨基酸，NtSAP5蛋白分子量為17513.94，等電點(diǎn)為9.5070。將其編碼CDS序列與基因區(qū)間序列比對(duì)，NtSAP5基因沒(méi)有內(nèi)含子。在NCBI網(wǎng)站上通過(guò)Blasp比對(duì)發(fā)現(xiàn)NtSAP5蛋白與絨毛煙草一個(gè)蛋白（NCBI登錄號(hào)為 XP_009631181）最為相似，氨基酸同源性達(dá)到97%。其次NtSAP5與栽培煙草中的一個(gè)蛋白（中國(guó)煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)基因ID為Ntab0779290）最為相似，氨基酸同源性達(dá)到93%。除了這兩個(gè)基因，NtSAP5與茄科番茄、馬鈴薯中的同源基因編碼蛋白的同源性較高，與水稻OSISAP1蛋白同源性較低，僅為60%。

分析NtSAP5蛋白的結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)NtSAP5蛋白的N端與C端，在21-45、97-134氨基酸范圍內(nèi)分別編碼一個(gè)A20與AN1結(jié)構(gòu)域（圖1），該結(jié)構(gòu)域?yàn)橐粋€(gè)鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，具有結(jié)合DNA的功能。

圖1 .NtSAP5蛋白結(jié)構(gòu)域注釋Fig.1 Functional domain annotation of NtSAP5

2.2 NtSAP5基因各煙草組織表達(dá)量及干旱誘導(dǎo)表達(dá)量

采用RT-PCR方法檢測(cè)NtSAP5基因在煙草根、葉片、莖、花、幼莢中的表達(dá)量，結(jié)果顯示，NtSAP5基因在煙草根中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，在莖和葉中表達(dá)量較少，在花中表達(dá)量最低（圖2A）。干旱脅迫下的RT-PCR結(jié)果表明，NtSAP5基因在干旱脅迫處理1小時(shí)，2小時(shí)的時(shí)候表達(dá)量上調(diào)，而在干旱脅迫處理2小時(shí)后表達(dá)量下調(diào)（圖2B），圖2B的干旱脅迫方法采用的是空氣干燥脫水處理[7]，與采用停止?jié)菜幚砀珊禇l件下的基因表達(dá)結(jié)果趨勢(shì)一致，結(jié)果未附。

提取栽培煙草K326的RNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用特異引物克隆獲得NtSAP5基因的CDS片段，獲得500 bp左右的目的片段，片段大小符合預(yù)期。將該片段的測(cè)序結(jié)果在中國(guó)煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blastn比對(duì)，結(jié)果表明擴(kuò)增序列與目的序列完全相同。將擴(kuò)增得到的目的片段通過(guò)BP反應(yīng)克隆到gateway pDONR-Zeo載體中。然后將在pDONR-Zeo載體中的目的片段經(jīng)過(guò)LR反應(yīng)克隆到gateway過(guò)表達(dá)載體pG2BW7中。將構(gòu)建好的載體通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草，通過(guò)抗生素篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。

采樣并提取轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株及非轉(zhuǎn)基因植株的RNA，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用real-time PCR檢測(cè)基因的轉(zhuǎn)基因植株NtSAP15的表達(dá)量。收取表達(dá)量顯著增高的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的T0代種子，其中OE_1植株的NtSAP15的表達(dá)量比非轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)量增加5倍，OE_2植株的NtSAP15的表達(dá)量比非轉(zhuǎn)基因植株標(biāo)量上調(diào)27倍（圖3）。

圖2 NtSAP5基因煙草中各組織表達(dá)量及干旱脅迫表達(dá)量Fig.2 Expression of NtSAP5 gene in tobacco tissues and under drought stress

圖3 NtSAP5過(guò)表達(dá)植株基因表達(dá)量Fig.3 Transcript-level expression analysis of two NtSAP5 overexpression lines

將兩個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因T0代種子播種，分單株收獲T1代植株種子。將從不同T1轉(zhuǎn)基因株系收獲的種子播種在濃度為20mg/L的Basta平板上，挑選出萌發(fā)后存活超過(guò)98%的轉(zhuǎn)基因株系為轉(zhuǎn)基因純合株系。選取并種植純合轉(zhuǎn)基因株系及非轉(zhuǎn)基因煙草植株，待植株長(zhǎng)到6-7葉期時(shí)，停止?jié)菜珊得{迫處理，干旱處理7天。圖4 為干旱脅迫處理7天NtSAP5過(guò)表達(dá)煙株與未轉(zhuǎn)基因煙株表型，包括干旱脅迫處理過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株OE_1、干旱脅迫處理過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株OE_2、干旱處理非轉(zhuǎn)基因煙草植株，其中OE_1、OE_2及非轉(zhuǎn)基因植株各選3株植株。結(jié)果表明經(jīng)過(guò)七天的干旱處理，過(guò)表達(dá)NtSAP5基因的煙草植株與非轉(zhuǎn)基因植株相比具有明顯的耐旱性，非轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出明顯的干枯表型，而兩個(gè)獨(dú)立的NtSAP5轉(zhuǎn)基因株系葉片較為挺拔，尤其是OE_2轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)更強(qiáng)的耐旱性，這與OE_2株系中更高的NtSAP5表達(dá)量相吻合。

圖4 NtSAP5轉(zhuǎn)基因植株的抗旱表型Fig.4 Drought resistance phenotype of NtSAP5 transgenic lines

3 討論與結(jié)論

本研究通過(guò)同源克隆獲得了煙草中SAP5同源基因，將該基因命名為NtSAP5。通過(guò)克隆獲得栽培煙草NtSAP5序列，該基因CDS區(qū)域長(zhǎng)度為474 bp，蛋白編碼長(zhǎng)度為278 aa。NtSAP5基因沒(méi)有內(nèi)含子，其編碼蛋白在N端具有一個(gè)A20結(jié)構(gòu)域，在C端具有一個(gè)N1結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域都是較為保守的鋅指結(jié)構(gòu)域，根據(jù)兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域的存在，可推斷該基因具有結(jié)合DNA的功能。水稻OSISAP1沒(méi)有已知的核定位信號(hào)，但定位在細(xì)胞核中[11]，擬南芥AtSAP5具有一個(gè)核定位信號(hào)且定位在細(xì)胞核內(nèi)。水稻OSISAP1能夠通過(guò)A20鋅指結(jié)構(gòu)域與其它SAP成員如RLCK253相結(jié)合[10]。NtSAP5與水稻的同源基因類(lèi)似，沒(méi)有已知的核定位信號(hào)結(jié)構(gòu)域（NLS），NtSAP5可能通過(guò)與其它轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合被招募進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)，同時(shí)也不能排除存在未知的核定位信號(hào)進(jìn)入細(xì)胞核的可能性。

轉(zhuǎn)錄因子是植物逆境應(yīng)答信號(hào)通路早期信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要成員。轉(zhuǎn)錄因子OSISAP1在水稻干旱脅迫下表達(dá)量先上升后下降，表明其在干旱的早期應(yīng)答中發(fā)揮作用[12]。在本研究中，NtSAP5的干旱應(yīng)答變化也出現(xiàn)先上升，而后緩慢下降，提示在NtSAP5同樣在煙草抗旱的早期反應(yīng)中行使功能。NtSAP5在根與葉片中表達(dá)量較高，在花與幼莢中表達(dá)量低，表明該基因在煙草的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)器官及營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段行使功能，該基因在根中的高量表達(dá)，提示該基因可能在在根對(duì)干旱響應(yīng)中發(fā)揮作用，具體情況需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

NtSAP5在栽培煙草K326中的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因純合株系在干旱脅迫處理下，與對(duì)照相比具有明顯的耐旱性。這些結(jié)果驗(yàn)證了該基因在煙草抗旱的生理過(guò)程中發(fā)揮功能。NtSAP5基因在擬南芥中的AtSAP5同源基因及水稻中的OSISAP1同源基因均能提高植物對(duì)干旱的抗性，但在茄科作物中，對(duì)該類(lèi)基因的研究較少， NtSAP5基因增強(qiáng)煙草抗旱能力的結(jié)果，對(duì)SAP5等鋅指蛋白基因在茄科作物中功能的研究提供了初步的證據(jù)。

本研究從煙草中克隆到一個(gè)鋅指蛋白基因，命名為NtSAP5基因，其具有保守的A20與N1鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域。NtSAP5基因在茄科的番茄及馬鈴薯中具有相應(yīng)同源基因且同源性較高，在雙子葉擬南芥與單子葉水稻中也均有同源基因但同源性相對(duì)較低。該基因在干旱脅迫下的表達(dá)量變化及在栽培煙草K326中過(guò)表達(dá)所呈現(xiàn)出的抗旱表型，表明該基因參與煙草抗旱早期應(yīng)答的調(diào)控過(guò)程且具有顯著增強(qiáng)煙草耐受干旱脅迫的功能。