張 青 ，黃 錢，劉曉燕 ，甘 淋

（西南醫(yī)科大學(xué)：1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，2附屬醫(yī)院乳腺外科，3醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中心，四川瀘州 646000）

乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢并呈現(xiàn)年輕化，嚴(yán)重威脅著女性的身心健康[1]。乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致其死亡的主要原因，也是臨床治療的難點(diǎn)和重點(diǎn)[2-3]。近年來，雖然對乳腺癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制研究逐年深入，但其具體的發(fā)病機(jī)制仍然是不清楚的，同時也缺乏高效特異的腫瘤診斷標(biāo)志物。尋找乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、評估療效及預(yù)后的早期診療分子標(biāo)志物，其最終目的是要降低乳腺癌人群的死亡率[4]。

細(xì)胞角蛋白（cytokeratin，CK）是細(xì)胞骨架的中間絲蛋白家族中最大、最復(fù)雜的亞類，它不僅維持上皮細(xì)胞及組織的穩(wěn)定性和完整性，同時還參與了細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與細(xì)胞的分裂、運(yùn)動以及分化、凋亡等過程直接相關(guān)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞角蛋白18(cytokeratin 18，CK18)在肺癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌等表達(dá)顯著異常，并且與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移、病情進(jìn)展以及預(yù)后直接相關(guān)[6]。本研究通過對比健康人和乳腺癌患者血清中CK18的表達(dá)情況，以探討其表達(dá)異常能否在乳腺癌的篩查、診斷、腫瘤監(jiān)測及預(yù)后評估等方面提供一種更好地選擇，為其治療提供新的藥物靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2016年9～12月西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺外科乳腺癌患者外周血26例，并經(jīng)病理證實；26例健康人血清來自健康體檢中心。本研究經(jīng)醫(yī)院理委員會批準(zhǔn)，且研究對象均知情，并簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有研究對象均為女性，年齡、性別以及體重等病例資料完整；②患者入院采集血液時未經(jīng)放療、化療或者手術(shù)治療；所有病例經(jīng)病理診斷證實為乳腺癌。

排除指標(biāo)：①妊娠、哺乳期患者；②乳腺癌術(shù)后病理分期、分子分型不明確者；③合并胃癌、結(jié)直腸癌等消化系統(tǒng)或其他惡性腫瘤的乳腺癌患者；④乳腺癌患者在采集外周血前1周內(nèi)有藥物服用史；⑤健康人納入前1年內(nèi)有手術(shù)治療病史或有既往腫瘤病史；⑥患者不同意加入實驗。

1.2 標(biāo)本采集

病理標(biāo)本均為晨起空腹時采集血液標(biāo)本，于取樣30 min內(nèi)置于4℃，3 000 r/min離心10 min，取上清液，分裝后凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要的實驗試劑及儀器

CK18一抗購自Bioworld生物科技有限公司；二抗購自CST公司山羊抗兔；電泳儀、轉(zhuǎn)移電泳儀槽均購自美國Bio-Rad公司；低溫離心機(jī)購自Thermo Fisher公司；酶標(biāo)儀購自BioTek公司；掃描儀購自基因有限公司

1.4 染色方法和結(jié)果判定

免疫組織化學(xué)嚴(yán)格按照Envision兩步法標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行操作，按照WHO乳腺腫瘤組織學(xué)分類（2012）[7]，結(jié)合2015年St.Gallen共識[8]進(jìn)行診斷。ER、PR陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：≥1%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核陽性。HER-2為膜著色，不著色為HER-2（-）；陽性細(xì)胞數(shù)＞10%，著色弱且不連續(xù)為HER-2（1+），著色中等且部分不連續(xù)為HER-2（2+），著色強(qiáng)且連續(xù)為HER-2（3+）；本研究中將HER-2（-/1+/2+）判為陰性，HER-2（3+）判為陽性或過表達(dá)。

1.5 實驗方法

乳腺癌及健康人的血清標(biāo)本采用蛋白質(zhì)免疫印跡（western blot，WB）檢測，將血清標(biāo)本于4℃過夜解凍，4℃，12 000 r/min離心60 min，去除高豐度蛋白。10%SDS-PAGE凝膠分離，上樣50μg總蛋白，PVDF膜100V轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，CK18抗體（1∶500）及GAPDH（1∶10 000）室溫2.5 h后4 ℃過夜；洗膜3次，每次10 min，加入二抗；熒光顯影，并采集蛋白條帶圖像，用ipp6軟件分析相對灰度值。

1.6 統(tǒng)計方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，用百分比描述病理學(xué)資料，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），兩個樣本均數(shù)比較用t檢驗，計數(shù)資料比較用χ2檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健康人和乳腺癌患者血清中CK18含量比較

采用WB檢測26例乳腺癌患者和26例健康人血清中CK18表達(dá)，結(jié)果顯示：在26例乳腺癌患者血清中，CK18陽性表達(dá)19例，陽性率73%；在健康人血清中，CK18陽性表達(dá)25例，陽性率96%（圖1）。分析CK18陽性的乳腺癌患者與健康人血清中CK18/GAPDH相對灰度值，發(fā)現(xiàn)：健康人組CK18/GAPDH相對灰度值為（0.11±0.06），乳腺癌患者組CK18/GAPDH相對灰度值為（0.24±0.10）（圖2）。對兩組的相對灰度值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，提示CK18在乳腺癌患者血清中表達(dá)增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.458，P=0.039）。

圖1 WB檢測CK18在血清中表達(dá)情況

2.2 臨床病理學(xué)特征比較

對CK18在乳腺癌患者血清中表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性進(jìn)行比較,其中CK18陽性表達(dá)乳腺癌患者的中位發(fā)病年齡較CK18陰性表達(dá)乳腺癌患者高，分別為（46±6.30）歲和（45±12.76）歲；腫塊平均直徑在2.5 cm左右，同時伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均在50%以上；兩者病理類型主要以浸潤性導(dǎo)管癌為主，為90%左右，WHO分級主要為Ⅱ級；免疫組化顯示：ER、PR、HER-2均為陽性占90%左右。結(jié)果顯示，CK18在乳腺癌患者血清中表達(dá)情況在上述各種因素中均無統(tǒng)計學(xué)差異，兩者之間差異均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

圖2 兩組血清中CK18和GAPDH相對灰度值比較

表1 乳腺癌患者血清中CK18陽性表達(dá)和CK18陰性表達(dá)臨床病理學(xué)特征比較

3 討論

目前，乳腺癌已經(jīng)成為全球女性最高發(fā)的惡性腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)，2018年美國乳腺癌患者發(fā)病率和死亡率較以往仍持續(xù)升高[9]。據(jù)文獻(xiàn)報道，在我國乳腺癌現(xiàn)已位居女性各類癌癥發(fā)病率之首[10]。故尋找乳腺癌早期診斷和評估預(yù)后的特異性分子標(biāo)志物已成為研究熱點(diǎn)。細(xì)胞角蛋白18存在于上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，例如細(xì)胞周期、凋亡以及癌癥進(jìn)展。目前有許多研究表明，CK18在許多腫瘤疾病中異常表達(dá)，其中包括呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及婦科等多個系統(tǒng)的腫瘤。CK18是肝細(xì)胞中重要的中間絲蛋白，已被確認(rèn)為各種肝炎進(jìn)展的潛在標(biāo)志物。一項Meta分析發(fā)現(xiàn)，與健康人血清相比，肝炎患者血清中CK18表達(dá)水平明顯升高，可能與與肝纖維化加重，肝細(xì)胞凋亡和嚴(yán)重肝損傷有關(guān)，并且表明血清中CK18表達(dá)在檢測肝損傷方面具有重要的價值[11]。Ismail等[12]通過檢測30名肝硬化患者和30名肝癌患者血清中CK18的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清中CK18表達(dá)明顯升高，并且靈敏度高于臨床常用的血清甲胎蛋白（AFP）的測定，并且CK18和AFP聯(lián)合檢測的靈敏度高達(dá)98%，CK18有望成為肝癌患者新的分子生物診斷標(biāo)志物。De等[13]通過觀察179例非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）患者、113例肺部良性疾病患者和200例健康人的血清后發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清中CK18表達(dá)明顯高于良性組和健康組，對NSCLC的預(yù)后評估具有重要的意義。

國內(nèi)外相繼報道了CK18與不同系統(tǒng)腫瘤之間的研究，但與乳腺癌的研究報道并不多，而且既往的研究主要集中在癌組織、癌旁組織中CK18表達(dá)情況，CK18與乳腺癌患者血清的報道甚少。Bozza等[14]發(fā)現(xiàn)在下調(diào)乳腺癌細(xì)胞系（T47D，BT474和MCF7）角蛋白8基因的表達(dá)，隨著K8/K18蛋白表達(dá)的缺失，DR5蛋白表達(dá)水平顯著增加，并增加了TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性，表明K8/K18蛋白的過表達(dá)保護(hù)乳腺癌細(xì)胞系免受TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Yang等[15]評估了乳腺癌中CK18過表達(dá)與ER、PR和HER2之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CK18高表達(dá)與PR和HER2陽性表達(dá)顯著相關(guān)，與ER陽性表達(dá)無明顯關(guān)系，并且高表達(dá)的CK18與腫瘤大?。ā? cm）、年齡（≥50歲）以及乳腺癌疾病的進(jìn)展呈正相關(guān)。Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)將人肺癌H1975和Calu-3細(xì)胞的CK18敲低后其運(yùn)動和遷移能力明顯減弱且CK18高表達(dá)的患者具有更差的總生存期和無病生存期(disease-free survival，DFS）。根據(jù)一項Meta分析顯示，乳腺癌患者血清中CK18高表達(dá)與其總生存期（overall survival，OS）顯著相關(guān)，其在血清中的高表達(dá)預(yù)示著乳腺癌預(yù)后不良[15]。

4 結(jié) 論

CK18在健康人和乳腺癌患者血清中均表達(dá)，但在乳腺癌患者血清中明顯高于健康人。這與以往關(guān)于腫瘤包括乳腺癌、肝癌等的研究結(jié)論相一致，表明CK18是乳腺癌早期診斷、療效、術(shù)后監(jiān)測乳腺癌復(fù)發(fā)的潛在生物標(biāo)志物。另外，在乳腺癌患者血清中CK18表達(dá)與年齡、腫瘤大小、WHO分級高低、病理類型、ER、PR、HER-2表達(dá)與否均無明顯相關(guān)性。這與以往的結(jié)果不符，可能是因為本實驗屬于小樣本資料，在統(tǒng)計分析上可能存在偏倚，需要后期大量的基礎(chǔ)和臨床研究進(jìn)一步證明CK18在乳腺癌血清中的表達(dá)情況及和各臨床因素的關(guān)系。