李 兵，趙海燕，屠瑞瑩，柳 靜，孟 娟，劉泰然，楊永紅，肖香蘭，陳 東，周香玉，趙 榕

(北京市疾病預(yù)防控制中心 北京市預(yù)防醫(yī)學研究中心，營養(yǎng)與食品衛(wèi)生所，北京 100013)

維生素D是一類具有膽鈣化甾醇生物活性物質(zhì)的總稱，其中麥角鈣化甾醇(維生素D2)和膽鈣化甾醇(維生素D3)是具有生物活性的兩種形式，對保持人體鈣磷平衡、維持骨骼和牙齒健康具有重要作用。維生素D在人體內(nèi)首先轉(zhuǎn)化為25-羥基維生素D，進而代謝為1,25-二羥基維生素D等活性物質(zhì)。人體缺乏維生素D可導致佝僂病、軟骨病等多種疾病[1]，目前維生素D缺乏已經(jīng)成為世界普遍存在的公共衛(wèi)生問題。人體獲取維生素D有日光照射和膳食攝入2個途徑，若能夠接受充足的日光照射，人體自身形成的維生素D即可滿足生理需要，無須額外補充[1]。而對于無法獲得充足日光照射的人群，膳食攝入是其補充維生素D的重要途徑。因此維生素D和25-羥基維生素D在食品中的含量分布十分重要，是開展飲食指導和攝入量評估的重要基礎(chǔ)。

天然維生素D主要存在于動物性食品(魚、肉、蛋、奶)和植物性食品(蘑菇、木耳、銀耳)中[2]。25-羥基維生素D是維生素D的代謝產(chǎn)物，主要存在于動物性食品如魚、肉、蛋、奶中，有研究表明其生物活性是維生素D的1.5～5.0倍[3-5]。由于維生素D和25-羥基維生素D在食品中的含量較低，且基質(zhì)干擾嚴重，因此已有方法多采用皂化除去油脂等干擾物質(zhì)后再使用半制備色譜或者固相萃取等前處理步驟進行凈化后測定，測定方法主要有放射免疫法和色譜法等。本文綜述了近年來食物中維生素D和25-羥基維生素D的檢測方法，包括前處理方法和測定方法，以及含量分布研究的進展，以期為開展相關(guān)工作提供理論依據(jù)。

1 樣品前處理

1.1 皂化方法

皂化是食品中維生素D和25-羥基維生素D檢測的常用前處理方法，主要用以去除脂肪等干擾物質(zhì)達到凈化的目的，并使維生素D從一些結(jié)合物中游離出來進行測定[6]；該方法采用一定量乙醇和氫氧化鉀的水或醇溶液在氮氣的保護下避光進行皂化反應(yīng)，皂化前需在樣品中加入一定量抗氧化劑(如抗壞血酸、焦性沒食子酸、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚等)以保護目標物不被氧化。皂化有熱皂化和冷皂化2種，其中熱皂化通常在50～100 ℃下反應(yīng)15～120 min，有研究認為較高的溫度會引起維生素損失和異構(gòu)化[7]。而冷皂化(常溫下皂化15～16 h)則可避免維生素D在皂化過程中的損失。

1.2 提取方法

樣品皂化后，一般采用有機溶劑提取目標物，常用提取方法為液液萃取法，萃取溶劑通常為石油醚、正己烷、二氯甲烷、丁醇、異辛烷乙醚、異丙醚等單一溶劑或混合溶劑。液液萃取方法簡單、易操作，但存在乳化、有機溶劑消耗量大、繁瑣費時等問題。固相支撐液液萃取可減少這些問題的發(fā)生，該法通常以硅藻土為載體，可為皂化液和提取溶劑提供更大的接觸表面積，從而提高提取效率，降低有機溶劑使用量。Strobel等[8]采用硅藻土固相支撐液液萃取提取了豬肉、牛肉、羊肉和雞肉中的維生素D和25-羥基維生素D，顯著縮短樣品的前處理時間，減少了有機溶劑用量，但由于萃取柱批次間的差異，會導致結(jié)果有偏差，可采用同位素內(nèi)標校正。

也有研究不皂化而直接使用溶劑提取樣品中維生素D和25-羥基維生素D，如H?llera等[9]采用甲醇提取并測定了豬不同組織中的25-羥基維生素D3，方法的回收率為80.3%～105%，相對標準偏差(RSD)為1.0%～26%，檢出限為1～5 ng/g；Jiao等[10]采用Fe3O4聚吡咯磁性納米微粒直接從牛奶中提取富集維生素D2和D3，該方法僅需15 min和0.5 mL有機溶劑，維生素D2和D3的回收率為72%～90%，RSD為3.6%～9.9%，檢出限分別為0.02 ng/mL和0.05 ng/mL，方法簡單快速。

1.3 凈化方法

由于食品基質(zhì)十分復(fù)雜，且維生素D和25-羥基維生素D的含量較低，為了獲得良好的分離度和靈敏度，測定前需采用固相萃取柱或者半制備色譜凈化。硅膠固相萃取和正相半制備色譜是常用的凈化方法，也有研究將兩者聯(lián)用對樣品凈化，以達到更好的凈化效果。如Bilodeau等[11]先采用硅膠固相萃取柱凈化，再分別使用配備有硅膠柱和氨基柱的正相半制備色譜再次凈化，測定了肉、蛋、魚等食品中的維生素D3和25-羥基維生素D3。張潔等[12]研究發(fā)現(xiàn)，對維生素D和25-羥基維生素D含量高的樣品可只采用正相半制備色譜凈化，而對于含量較低的復(fù)雜樣品(如豬肉、禽肉等)需聯(lián)合固相萃取和半制備色譜柱凈化。H?llera等[9]采用甲醇提取、C18固相萃取柱凈化測定豬脂肪和皮中的25-羥基維生素D3。李珉等[13]采用凝膠滲透色譜及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定了油脂性食品中維生素A、D、E，樣品經(jīng)環(huán)己烷-乙酸乙酯(體積比5∶5)提取，采用凝膠滲透色譜凈化去除油脂后上機測定，并將分析結(jié)果與皂化-液液萃取/液相色譜法進行對比，發(fā)現(xiàn)凝膠滲透色譜/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法在檢出限、回收率和精密度方面優(yōu)勢明顯，不但將單個樣品的檢測時間從190 min縮短至45 min，且顯著減少了人工操作，自動化程度高。

2 儀器方法

食品中維生素D和25-羥基維生素D的測定方法有放射免疫法、液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、二維液相色譜法、超臨界流體色譜法、薄層色譜法等。其中液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法能夠?qū)S生素D2/D3、25-羥基維生素D2/D3進行有效分離并測定，具有高選擇性的特點，成為食品中維生素D和25-羥基維生素D的主要測定方法。與液相色譜法相比，液相色譜-質(zhì)譜法靈敏度更高，特異性更強，但檢測成本較高，且對實驗人員操作技能的要求更高。

由于食品中維生素D和25-羥基維生素D的前處理方法非常繁瑣，因此采用內(nèi)標法能夠更精確的定量。維生素D2和維生素D3的化學結(jié)構(gòu)非常相似，在進行液相色譜法測定時，可采用維生素D2和維生素D3、25-羥基維生素D2和D3互為內(nèi)標的方法[14]。液相色譜-質(zhì)譜測定時，常使用同位素內(nèi)標，因為除了色譜分離以外，質(zhì)譜檢測器還可根據(jù)分子量信息將同位素內(nèi)標和目標物提取分離。同位素內(nèi)標與目標物具有相似的分子結(jié)構(gòu)，色譜行為更為相似，可有效校正前處理造成的損失，因此能夠獲得更好的精密度和準確度[15-16]。

2.1 液相色譜法

液相色譜(主要包括正相高效液相色譜、反相高效液相色譜、二維液相色譜和超高效液相色譜)因其良好的分離能力被廣泛用于食品中維生素D和25-羥基維生素D的分析。由于正相色譜需使用大量環(huán)境不友好的溶劑，因此現(xiàn)在多采用配備C18色譜柱的反相液相色譜對食品中維生素D進行測定[16]，隨著色譜填料技術(shù)的不斷發(fā)展，也有采用其他色譜柱分離維生素D的報道，如Pokkanta等[17]使用PFP色譜柱在30 min內(nèi)分離了米糠、植物油中維生素D3等18種化合物。近年來，配備亞2 μm直徑填料色譜柱的超高效液相色譜發(fā)展迅速，因其具有分離度高、分析速度快的特點，逐漸在食品中維生素D的檢測方面發(fā)揮重要作用[18]。由于樣品中維生素D的含量很低，且基質(zhì)干擾嚴重，因此常規(guī)的檢測方法先使用正相半制備色譜凈化，收集餾分濃縮后再采用反相色譜分離測定，需兩臺色譜系統(tǒng)，操作繁瑣費時。近年來發(fā)展起來的二維液相色譜，可以在線使用第一根色譜柱對目標物進行初步分離，再將目標物切割進入第二根色譜柱進一步分離，不僅實現(xiàn)了在線凈化，還減少了前處理步驟，縮短了前處理時間、提高了分析效率。二維液相色譜儀器條件的選擇需考慮色譜柱的差異性和流動相的兼容性。張艷海等[19]采用在線二維液相色譜法測定維生素AD制劑中維生素A和D的含量，分別選擇C8柱和極性嵌合的C18柱作為一維和二維色譜柱，以乙腈-甲醇-水作為流動相進行梯度洗脫，得到維生素D的回收率為90.0%～98.9%,RSD為1.1%，定量下限為0.015 mg/L，方法的準確度和精密度良好，大大提高了實際樣品的分析效率；林玉宙等[20]采用在線二維液相色譜測定了嬰幼兒配方乳品和嬰幼兒米粉中維生素A、D3、E的含量，該方法以超高效C18柱和聚合鍵合的C18鍵合相PHA柱分別作為一維和二維色譜柱，分別以甲醇-水和乙腈-異丙醇為一維和二維的流動相進行梯度洗脫，得維生素D3的回收率為90.1%～99.7%，RSD為0.97%，定量下限為0.005 3 mg/L。且該法與國標10769-2010方法檢測結(jié)果相一致，可用于實際樣品的測定。岑建斌等[21]采用正相二維液相色譜測定了嬰幼兒乳粉中維生素A、D3、E的含量，采用NH2柱和Silica柱作為一維和二維色譜柱，均以異丙醇-環(huán)己烷(2∶98)和正己烷為流動相，方法的平均回收率為86.7%～90.6%，RSD為3.50%～3.83%，定量下限為0.07 mg/kg，此方法與國標方法GB5413.9測定的結(jié)果不存在顯著性差異，可滿足日常乳粉檢測的定量需求。

2.2 液相色譜-質(zhì)譜法

高效液相色譜-質(zhì)譜法可通過色譜分離目標物，還可根據(jù)目標物的質(zhì)荷比進行定性，具有靈敏度高、選擇性好的優(yōu)點，已成為維生素D和25-羥基維生素D的重要分析手段。張潔等[12]采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定畜禽肉中的維生素D3和25-羥基維生素D3，方法的加標回收率為75.0%～97.1%，RSD為1.9%～5.6%，檢出限均為0.60 μg/kg。并且比較了高效液相色譜和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的測定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)后者的靈敏度和特異性均優(yōu)于前者，且線性和重現(xiàn)性均更好。Huang等[22]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定奶粉中維生素D2和D3，兩者的加標回收率為100%～108%，RSD為3.7%～8.2%，定量下限為0.11、0.086 IU/mL。該研究還比較了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的測定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)前者能夠?qū)⒈Ａ魰r間從20 min縮短至10 min，且可以更好地將干擾物與目標物分離，結(jié)果準確度更高。

研究表明，衍生可以提高維生素D的離子化效率，降低背景干擾，常用的衍生劑為4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)。Gomes等[23]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定了母乳、牛奶、羊奶、馬奶中的維生素D2/D3、25-羥基維生素D2/D3、1,25-二羥基維生維D2/D3以及24,25-二羥基維生維D2/D3，方法的回收率為88.2%～105%，RSD為4.8%～14%。并對比了皂化和沉淀蛋白對萃取的影響，確認沉淀蛋白的效果更好。該研究還優(yōu)化了使用PTAD進行柱前衍生的方法，發(fā)現(xiàn)對5種維生素D類似物，當PTAD與其物質(zhì)的量之比為10 000∶1、反應(yīng)1 h時產(chǎn)物的靈敏度均最佳。并通過對前端液相色譜條件進行優(yōu)化，有效降低了基質(zhì)效應(yīng)，使25-羥基維生素D及其異構(gòu)體得到了良好的分離。Gill等[24]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和PTAD衍生的方法測定了牛奶和奶粉中的維生素D3，方法的回收率為94.7%～105%，RSD為1.4%～4.5%，該研究表明經(jīng)PTAD衍生后的產(chǎn)物具有良好的靈敏度和選擇性，有效減少了樣品前處理時間和液相色譜分離時間。在多家實驗室驗證研究中[25]，9家實驗室采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和PTAD衍生法對嬰兒奶粉和營養(yǎng)產(chǎn)品中維生素D2和D3進行了測定，重復(fù)性RSD為1.9%～5.8%，重現(xiàn)性RSD為6.4% ～ 13%，采用標準物質(zhì)NIST 1849a進行準確度試驗，P值為0.32，表明該方法具有良好的準確度和精密度。Nestola等[26]采用在線高效液相色譜-氣相色譜-質(zhì)譜法對食品中維生素D2和D3進行了測定，定量下限分別為128、157 pg，重復(fù)性RSD為1.0%～1.3%，與高效液相色譜/紫外檢測器法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法需使用半制備色譜和固相萃取凈化相比，該方法簡化了樣品前處理步驟，是一種高通量檢測方法。

2.3 超臨界流體色譜法

超臨界流體色譜采用二氧化碳和少量有機溶劑為流動相，具有綠色環(huán)保的特點，與高效液相色譜相比，可以在更短的時間內(nèi)實現(xiàn)化合物的良好分離，是近年來快速發(fā)展的分析技術(shù)。由于二氧化碳屬于非極性物質(zhì)，因此超臨界流體色譜非常適合分析疏水性化合物，且可添加不同極性的有機溶劑作為助溶劑，使流動相的極性十分靈活多樣，能滿足不同極性化合物的分離需要。超高效超臨界流體色譜是基于超臨界流體色譜的新型分離儀器，與亞2 μm粒徑色譜柱聯(lián)用可進一步提高其分離效率。本實驗室采用超高效超臨界流體色譜對保健食品中類胡蘿卜素和動物肝臟中的維生素A異構(gòu)體進行分離測定，獲得了良好的分離效果[27-28]。Oberson等[29]采用超高效超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定了食品中多種脂溶性維生素，以Acquity UPC21-AA(3.0 mm×100 mm,1.8 μm)為色譜柱，含有10 mmol/L甲酸銨的甲醇-水(98∶2)溶液為助溶劑，在柱溫為45 ℃，背壓1 856 psi條件下，于7 min內(nèi)實現(xiàn)了視黃醇乙酸酯、視黃醇棕櫚酸酯、視黃醇、α-生育酚、α-生育酚醋酸酯、維生素D2、維生素D3、維生素K1、維生素K2的分離。所有脂溶性維生素的回收率為90.0%～110%，采用標準物質(zhì)NIST 1849a進行準確度試驗，測定結(jié)果與參考值沒有統(tǒng)計學差異。Rathi等[30]以Acquity UPC2BEH Column(3.0 mm×100 mm,1.7 μm)為色譜柱，異丙醇為助溶劑，在柱溫為50 ℃，背壓1 800 psi條件下采用超高效超臨界流體色譜對食用油中多種脂溶性維生素進行了測定，在8 min內(nèi)實現(xiàn)了視黃醇、視黃醇乙酸酯、維生素D2、維生素D3、生育酚、維生素K1、維生素K2的分離。所有目標物的回收率為69.5%～98.6%，RSD為0.01%～1.8%，定量下限為0.05～3.59 μg/mL。Hamada等[31]采用超臨界流體色譜-反相高效液相色譜-質(zhì)譜測定了油和脂肪樣品中的維生素D，樣品經(jīng)正己烷提取后直接進樣分析，超臨界流體色譜在線凈化，反相高效液相色譜-質(zhì)譜測定，回收率為84.3%～110%，RSD為5.8%～7.1%，方法顯著減少了樣品前處理時間，提高了分析效率。

2.4 放射免疫與薄層色譜法

Purchas等[4]采用Biosource公司的放射免疫分析試劑盒對牛羊肉中25-羥基維生素D3進行了測定。取1.5 g樣品，切碎后以2.5 mL乙腈-水(10∶4)萃取3 h，離心后測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)生肉樣品和烹飪后樣品中25-羥基維生素D3的變異系數(shù)分別為8.5%(n=48)和7.7%(n=72)，檢出限為0.6 ng/mL。Trineeva等[32]以梯度薄層色譜法測定了食品中維生素A、D2、E、β-胡蘿卜素，維生素D2的檢出限為7×10-9g，RSD為4.9%。結(jié)果表明薄層色譜具有簡單易操作，低成本的特點，可用于植物樣品、保健食品中多種維生素的測定。

近年來食品中維生素D的部分檢測方法見表1。

表1 食品中維生素D的檢測方法Table 1 Determination methods of vitamin D in foods

3 食品中維生素D與25-羥基維生素D含量分布研究進展

近年來歐洲、美國、韓國等國家和地區(qū)都建立了維生素D和25-羥基維生素D的食物成分表[2,38-39]。Yoo等[39]的研究表明韓國人維生素D主要膳食來源為魚和貝類(71.34%)、蛋類(14.89%)。劉琰等參照《日本食品標準成分表》中維生素D的數(shù)據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，銀耳是中國北京、蘇州等八地區(qū)學齡前兒童維生素D最重要的膳食來源(48.16%)，其次是奶類及奶制品(36.16%)和木耳(5.27%)。并指出我國學前兒童維生素D攝入水平不容樂觀，建議適量增加維生素D的攝入，同時避免攝入過量[40]。

3.1 動物性食品中維生素D和25-羥基維生素D分布研究進展

Liu等[43]考察了澳大利亞市場上紅肉(羊肉、牛肉等)中維生素D3和25-羥基維生素D3的含量，以及緯度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)羊瘦肉中維生素D3和25-羥基維生素D3的含量分別為0.10 μg/100 g和0.20 μg/100 g；羊肉脂肪中分別為0.88 μg/100 g和<0.20 μg/100g；牛瘦肉中分別為0.12 μg/100 g和0.27 μg/100 g；牛肉脂肪中分別為0.76 μg/100 g和0.40 μg/100 g。緯度對于瘦牛肉中二者的含量幾乎沒有影響，但低緯度的牛肉脂肪中維生素D3的含量要比高緯度的牛肉高。

Guo等[44]測定了雞蛋中維生素D3和25-羥基維生素D3的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)散養(yǎng)和有機飼養(yǎng)的雞蛋中維生素D3的含量均高于室內(nèi)飼養(yǎng)，且25-羥基維生素D3的含量在有機雞蛋中的含量最高，可能與其在飼養(yǎng)過程中受到更多陽光照射相關(guān)。研究結(jié)果表明雞蛋中維生素D的含量約為2 μg/個,約為英國65歲以上居民膳食維生素D推薦攝入量的20%。Jakobsen等[45]測定了奶制品中的維生素D2/D3和25-羥基維生素D2/D3的含量。牛奶、奶油、黃油中維生素D3和25-羥基維生素D3的含量為4.6～196 ng/100 g和4.2～96 ng/100 g，牛奶和黃油中維生素D2分別為3.4、61 ng/100 g,25-羥基維生素D2分別為3.1、58 ng/100 g。Martini等[46]測定了食用驢奶中維生素D的含量，測得生驢奶中維生素D2和維生素D3的含量分別為1.68、0.60 μg/100 mL，經(jīng)巴氏殺菌處理后二者的含量為1.38、0.30 μg/100 mL。研究表明驢奶中二者的含量高于其在牛奶和母乳中的含量，因此食用驢奶可增加維生素D攝入量。Gill等[47]比較了不同季節(jié)牛奶中維生素D3和25-羥基維生素D3的含量，發(fā)現(xiàn)維生素D3的含量范圍為167～615 ng/L，而25-羥基維生素D3的含量變化不大，均小于50 ng/L。

3.2 植物中維生素D的含量分布研究進展

Hughes等[48]測定了13種澳大利亞食用植物和海藻中的維生素D2/D3、25-羥基維生素D2/D3，結(jié)果在5種樣品中檢出維生素D2，含量為0.03～0.67μg/100 g干重，1種樣品中檢出維生素D3，含量為0.01 μg/100 g干重。Kühn等[49]對可可豆及其制品中維生素D含量進行了測定，測得黑巧克力中維生素D2含量為1.90～5.48 μg/100 g，白巧克力中維生素D2含量為0.19～1.91 μg/100 g，巧克力堅果醬中維生素D2含量為0.15 μg/100 g。N?lle等[50]研究了光照和干燥方式對于蘑菇中維生素D2含量的影響。結(jié)果顯示，不切和切片蘑菇經(jīng)紫外光照射后維生素D2含量分別為45、406 μg/g干重。蘑菇經(jīng)日曬干燥和太陽能干燥器干燥后維生素D2含量分別為36、39 μg/g干重。由此可見，經(jīng)紫外光照射、日曬干燥、太陽能干燥器干燥后的蘑菇中均含有較高的維生素D2。

4 結(jié)論與展望

維生素D是維持人體健康的重要脂溶性維生素，食品是其攝入的重要來源之一，因此建立我國維生素D食品成分數(shù)據(jù)庫對其攝入量研究具有重要意義，而準確可靠的檢測方法是研究的前提和基礎(chǔ)。由于食品中維生素D和25-羥基維生素D含量較低，且基質(zhì)干擾較多，因此已有前處理方法多采用繁瑣復(fù)雜的前處理步驟(如皂化、液液萃取、半制備液相色譜凈化等)，存在有機溶劑用量大、耗時長、耗費人力物力的缺點，因此研究開發(fā)簡單快速的前處理方法可以極大地提高樣品的檢測效率。由于維生素D2/D3、25-羥基維生素D2/D3在樣品中的含量較低，并且其結(jié)構(gòu)較為相似，因此開發(fā)具有高靈敏度、高特異性的檢測方法是今后的研究方向。目前食物中維生素D的研究多關(guān)注肉類食物，對于植物中維生素D的研究較少。而我國是植物性食品的消費大國，研究植物中的維生素D含量對于提高我國居民的維生素D營養(yǎng)水平具有重要意義。