李 銳，徐金梅，孫衛(wèi)東，鄔向東

(河南中帥醫(yī)藥科技股份有限公司，河南 鄭州 450001)

艾司奧美拉唑鈉(Esomeprazole sodium)，化學(xué)名為5-甲氧基-2-[(S)-[(4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基]亞硫酰基]-1H-苯并咪唑鈉鹽，由阿斯利康公司研發(fā)，并于2000年、2001年、2003年分別在瑞典、美國和歐盟以及中國批準上市[1-3]。該物質(zhì)是一種質(zhì)子泵抑制劑(Proton pump inhibitor，PPI)，可通過與胃壁細胞H、K-ATP酶共價結(jié)合，抑制該酶的活性、胃酸的分泌，普遍應(yīng)用于胃食管返流病、消化性潰瘍等酸相關(guān)性疾病的治療，且療效較好[4-5]。

基因毒性雜質(zhì)在很低的濃度下可誘導(dǎo)基因突變導(dǎo)致染色體斷裂和重排，具有潛在的致癌性[6-7]，現(xiàn)已引起研究者廣泛關(guān)注，國內(nèi)外已有很多利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8-11]檢測藥物中基因毒性雜質(zhì)的報道。艾司奧美拉唑鈉合成過程中用到過氧化物體系[1]，在氧化反應(yīng)時可能生成副產(chǎn)物奧美拉唑氮氧物(Omeprazole N-oxide，GTI E)及奧美拉唑氮氧磺酰物(Omeprazole sulfonylate N-oxide，GTI I)，二者均具有基因毒性警示結(jié)構(gòu)片段N-氧化芳香環(huán)結(jié)構(gòu)[12](表1)，依照歐盟基因毒性雜質(zhì)指導(dǎo)原則[13]，兩者均屬于潛在基因毒性雜質(zhì)，需在產(chǎn)品中加以控制。按照毒理學(xué)關(guān)注閾值(TTC)計算[13]，基因毒性雜質(zhì)的限度在1.5 μg/d，而艾司奧美拉唑鈉日劑量為40 mg，計算得GTI E和GTI I的限度應(yīng)為37.5 μg/g。現(xiàn)有藥典[14-15]雖已有2種雜質(zhì)的液相色譜檢驗方法，但僅將二者作為基因毒性雜質(zhì)檢測和控制，尚無法滿足要求。已有報道采用超高效液相(UPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)技術(shù)對奧美拉唑、埃索美拉唑合成中的起始物料殘留引入的基因毒性雜質(zhì)進行檢測[16-17]，但尚未見利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對艾司奧美拉唑鈉合成工藝中副反應(yīng)引入的潛在基因毒性雜質(zhì)GTI E和GTI I進行檢測和監(jiān)控的報道。

四極桿-線性離子阱(QTRAP)質(zhì)譜是混合型串聯(lián)質(zhì)譜，既保留了四極桿傳統(tǒng)的定量功能，又可通過多級碎裂提供化合物結(jié)構(gòu)信息，具有高靈敏度和高特異性的特點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于藥品檢測等領(lǐng)域[18-20]。本文基于此技術(shù)建立了艾司奧美拉唑鈉中潛在基因毒性雜質(zhì)GTI E和GTI I殘留的檢測方法，并將其用于艾司奧美拉唑鈉原料及市售制劑檢測。該研究彌補了HPLC/UV檢測靈敏度低的不足，可用于艾司奧美拉唑鈉原料及成品制劑中GTI E和GTI I 2種潛在基因毒性雜質(zhì)的監(jiān)測與控制。

表1 含N-氧化芳香環(huán)的基因毒警示結(jié)構(gòu)、艾司奧美拉唑鈉及其2種潛在基因毒性雜質(zhì)的化學(xué)名及結(jié)構(gòu)Table 1 Chemical names,structurals of N-oxide aromatic compounds(genetic toxicity warning structure),esomeprazole sodium and two potential genotoxic impurities

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

AB Sciex QTRAP 4500 LC-MS/MS液相色譜-三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國AB Sciex公司)；MS304S梅特勒-托利多分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Milli-Q 超純水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

奧美拉唑氮氧物(GTI E)購自LGC英國政府化學(xué)家實驗室(Lot#：57290，純度99.5%)；奧美拉唑氮氧磺酰物(GTI I)購自濟南蔚然生物科技有限公司(Lot#：WR-2017-601，純度98.79%)；注射用艾司奧美拉唑鈉購自阿斯利康制藥有限公司(規(guī)格：40 mg，批號：PBTB)；艾司奧美拉唑鈉原料由河南中師醫(yī)藥科技股份有限公司提供(批號：17090801X、17090802X、17090803X)。乙腈(色譜純)購自德國默克公司；實驗用水為超純水。

1.2 溶液的配制

對照品溶液：分別精密稱取GTI E、GTI I對照品適量于容量瓶中，加30%(體積分數(shù)，下同)乙腈水溶液溶解并定容稀釋成37.5、37.5 μg/L的對照品溶液。精密稱取艾司奧美拉唑鈉對照品適量，加30%乙腈水溶解并定容稀釋制成1.0 g/L對照品溶液。

混合對照溶液：分別精密稱取GTI E、GTI I對照品適量于同一容量瓶中，加30%乙腈水溶液溶解并定容配成質(zhì)量濃度均為37.5 μg/L的混合對照溶液(1)，平行2份；另取艾司奧美拉唑鈉、GTI E、GTI I對照品適量于同一容量瓶中，加30%乙腈水溶液溶解并定容配成質(zhì)量濃度分別為1 g/L、37.5 μg/L、37.5 μg/L的混合對照溶液(2)。

供試品溶液：取艾司奧美拉唑鈉原料或市售注射用艾司奧美拉唑鈉適量，精密稱定，加30%乙腈水溶液溶解并定容配成1.0 g/L供試品溶液。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：Agela VenusiL MP-C18(2.1 mm×100 mm，3 μm)色譜柱，流動相：A為水，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～3 min，55%～70% B；3～4 min，70% B；4～6 min，70%～90% B；6.0～6.1 min，90%～55% B；6.1～8.0 min，55% B。流速：0.2 mL/min，柱溫：35 ℃，進樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，艾司奧美拉唑鈉為ESI正離子模式，GTI E和GTI I為ESI負離子模式。離子源溫度：450 ℃，多反應(yīng)離子監(jiān)測模式(MRM)。艾司奧美拉唑鈉、GTI E和GTI I的保留時間、定量/定性離子、碰撞能量及離子化模式見表2。

表2 艾司奧美拉唑鈉及2種潛在基因毒性雜質(zhì)的保留時間、母離子、定量/定性離子、碰撞能量和離子化模式Table 2 Retention times，precursor ions,quantitative/qualitative ions,collision energies,ionization modes of esomeprazole sodium and GTI E，GTI I

*quantitative ions

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

圖1 艾司奧美拉唑鈉(A)及GTI E(B)、GTI I(C)的全掃描質(zhì)譜圖Fig.1 Scan mass spectra of esomeprazole sodium(A)and GTI E(B),GTI I(C)

艾司奧美拉唑鈉在水溶液中對光、pH值、溫度等均不穩(wěn)定，易分解變色降解產(chǎn)生其它雜質(zhì)，影響檢測結(jié)果的準確性。故要保證液相進樣周期不能太長并減少雜質(zhì)干擾。而各藥典中提到的液相色譜條件均需加入磷酸緩沖鹽體系，會對儀器造成污染。本文以乙腈-水為流動相，并在滿足分析要求的基礎(chǔ)上采用梯度洗脫，盡可能縮短分析時間，優(yōu)化后的梯度洗脫程序見“1.3”。所用外購對照品均已進行了結(jié)構(gòu)表征，分別用對照品溶液在“1.3”色譜條件下測定艾司奧美拉唑鈉、GTI E、GTI I，三者的出峰時間分別3.00、3.63、4.45 min；GTI E、GTI I對應(yīng)的分子離子峰[M-1]-分別為m/z360.1和375.8(ESI-)，通過儀器軟件計算同位素位置和豐度比，得到2種離子元素組成，繼而得其分子式分別為C17H18N3O4S和C17H19N3O5S，與GTI E、GTI I分子式一致，全掃描質(zhì)譜圖見圖1。

在“1.3”色譜條件下，依據(jù)藥典中提及的色譜柱型號選擇效能相近的Agela VenusiL MP-C18(2.1 mm×100 mm，3 μm)、Agilent Poroshell 120 EC-C18(4.6 mm×100 mm，2.7 μm)、Agilent Eclipse Plus-C18(4.6 mm×100 mm，3.5 μm) 3種色譜柱考察其分離情況。結(jié)果顯示，艾司奧美拉唑鈉主峰和GTI E、GTI I在3種色譜柱上均能實現(xiàn)良好分離，2種雜質(zhì)的峰形均較好。但此液相條件下艾司奧美拉唑鈉主峰在后2種色譜柱上峰形拖尾較明顯，需在水相中加入磷酸鹽緩沖體系才能改善。進一步考察回收率時發(fā)現(xiàn)，GTI E、GTI I在后2種色譜柱上的回收率(<80%)低于Agela VenusiL MP-C18色譜柱，即使調(diào)節(jié)梯度洗脫濃度使主峰和GTI E、GTI I分離度增加后也無明顯改善，其原因一方面可能是艾司奧美拉唑鈉高濃度的主峰對GTI E、GTI I有離子抑制效應(yīng)，另一方面可能源于Agela Venusil MP-C18色譜柱采用了雙層表面處理技術(shù)，硅膠表面的羥基數(shù)量、親水性、硅膠表面純度均增加，但該技術(shù)處理的硅羥基酸性減弱(雙層表面處理技術(shù)處理的硅羥基pH值約5.2，普通硅羥基pH值約3.5)，硅羥基的活性比普通硅膠柱弱，抑制了二次保留效應(yīng)，從而減弱了非特異性吸附，因在此液相條件下性能優(yōu)于后2種色譜柱。故本文采用Agela VenusiL MP-C18色譜柱同時檢測艾司奧美拉唑鈉中GTI E、GTI I的殘留。此條件下，艾司奧美拉唑鈉主峰、GTI E、GTI I能夠很好地分離，回收率均在85%以上。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用電噴霧離子源，分別在正、負離子模式下，對艾司奧美拉唑鈉、GTI E和GTI I對照溶液進行母離子全掃描，確定其分子離子峰分別為[M+1]+(m/z368)和[M-1]-(m/z360.1和375.8)。再分別對分子離子峰進行子離子掃描，得到二級質(zhì)譜，選擇響應(yīng)值最高的子離子作為定量離子，另一個作為定性離子。采用MRM模式，優(yōu)化母離子和兩個碎片離子的最佳碰撞能量，最佳質(zhì)譜條件見表2。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗在優(yōu)化色譜條件下，取30%乙腈水溶液作為空白溶劑進樣。分別取“1.2”制備的37.5 μg/L的GTI E、GTI I對照品溶液，艾司奧美拉唑鈉對照品溶液用30%乙腈水溶液稀釋制成1 μg/L溶液進樣。取“1.2”制備的混合對照溶液(2)作為系統(tǒng)適用性溶液進樣，連續(xù)進樣5針。結(jié)果表明，空白溶劑無干擾，GTI E、GTI I、艾司奧美拉唑鈉出峰時間分別3.00、3.63、4.45 min。連續(xù)5針系統(tǒng)適用性溶液中各雜質(zhì)峰峰面積的RSD均小于8.0%，保留時間的RSD均小于2.0%，表明該系統(tǒng)穩(wěn)定，方法滿足要求，溶劑空白、艾司奧美拉唑鈉、GTI E和GTI I色譜圖見圖2。

2.3.2 線性范圍、檢出限、定量下限及回收率在優(yōu)化色譜條件下，精密稱定GTI E、GTI I適量，分別以30%乙腈水溶液稀釋配制成GTI E質(zhì)量濃度為1.26、17.9、29.1、38.1、44.8 μg/L，GTI I質(zhì)量濃度為1.34、22.6、29.4、38.4、45.2 μg/L的溶液進樣，以各化合物的定量離子色譜峰面積對相應(yīng)的質(zhì)量濃度繪制標準曲線。結(jié)果表明，GTI E和GTI I分別在1.26～44.8、1.34～45.2 μg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.994 7和0.992 8，線性方程分別為y=5.0×106x-1 633.5和y=3.0×106x+1 648.6。分別以其3倍和10倍信噪比(S/N)計算方法檢出限(LOD)和定量下限(LOQ),得GTI E、GTI I的LOD分別為0.381、0.384 μg/L，LOQ分別為1.26、1.34 μg/L。方法的靈敏度完全滿足依照歐盟基因毒性雜質(zhì)指導(dǎo)原則計算的37.5 μg/g的雜質(zhì)限度。以不含GTI E、GTI I的艾司奧美拉唑鈉為空白基質(zhì)，添加80%限度、100%限度、120%限度濃度的GTI E、GTI I進行加標回收試驗，每個濃度平行測定3份，得GTI E、GTI I平均回收率分別為86.3%～87.6%和85.8%～91.4%，相對標準偏差(RSDs)分別為1.5%～2.2%和0.7%～4.0%，結(jié)果見表3。

圖2 溶劑空白(A)、艾司奧美拉唑鈉(B)、GTI E(C)及GTI I(D)色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank(A),esomeprazole sodium(B),GTI E(C) and GTI I(D)

表3 艾司奧美拉唑鈉中添加GTI E、GTI I的回收率及相對標準偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of GTI E and GTI I in esomeprazole sodium

2.3.3 穩(wěn)定性及重復(fù)性試驗在優(yōu)化條件下，照“1.2”方法配制兩份混合對照溶液(1)，分別于室溫及冷藏條件下(4 ℃)在0、1、2、3、4、5、6 h進樣分析。結(jié)果顯示，室溫和冷藏條件下6 h內(nèi)GTI E、GTI I峰面積的RSD均小于10%，表明其在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。對100%限度濃度的GTI E、GTI I連續(xù)測定6次，得峰面積的RSD分別為1.7%、1.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 實際應(yīng)用

在優(yōu)化條件下，按“1.2”方法配制各供試品溶液，對艾司奧美拉唑鈉3批原料及市售阿斯利康制劑注射用艾司奧美拉唑鈉中的GTI E、GTI I進行檢測(表4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3批原料及阿斯利康制劑中均檢出GTI E、GTI I，市售阿斯利康制劑中GTI I含量大于3批原料，而3批原料中的GTI E檢出量大于阿斯利康制劑，但兩者檢出的2種潛在基因毒性雜質(zhì)含量均遠低于基因毒性雜質(zhì)限度(37.5 μg/g)。

表4 艾司奧美拉唑原料及注射用艾斯奧美拉唑鈉樣品中2種潛在基因毒雜質(zhì)含量Table 4 Contents of GTI E，GTI I in the esomeprazole sodium and esomeprazole sodium for injection

3 結(jié) 論

本文建立了高效液相色譜-三重四極桿/線性離子阱質(zhì)譜儀(HPLC-QTARAP-MS/MS)測定艾司奧美拉唑鈉藥物中GTI E、GTI I 2種潛在基因毒性雜質(zhì)痕量殘留的分析方法。該方法靈敏度高、分離度好，回收率、精密度及定量下限等均能滿足基因毒性雜質(zhì)限度的要求，是檢測艾司奧美拉唑鈉藥品中2種基因毒性雜質(zhì)痕量殘留的有效方法。將所建方法應(yīng)用于艾司奧美拉唑鈉原料藥和市售阿斯利康注射用艾司奧美拉唑鈉制劑樣品檢測，樣品均檢出痕量的潛在基因毒性雜質(zhì)GTI E、GTI I，但均遠低于根據(jù)毒理學(xué)關(guān)注閾值(TTC)計算出的37.5 μg/g限度。隨著基因毒性雜質(zhì)法規(guī)逐步健全，藥政官方對基因毒性雜質(zhì)的監(jiān)管要求越來越高，因基因毒性雜質(zhì)控制不合規(guī)而導(dǎo)致的評審發(fā)補和退審、產(chǎn)品召回等事件越來越多，充分的基因毒性雜質(zhì)研究已經(jīng)成為產(chǎn)品能否上市的關(guān)鍵。本方法可為艾司奧美拉唑鈉原料及制劑生產(chǎn)企業(yè)2種潛在基因毒性雜質(zhì)控制提供依據(jù)和參考。