侯建波，謝 文，錢 艷，史穎珠，姚濱濱，汪 鵬，盛 濤

(1.浙江省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 杭州 310016；2.浙江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，浙江 杭州 310016；3.浙江立德產(chǎn)品技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310016)

蜂王漿是蜂巢中培育幼蟲的青年工蜂咽頭腺的分泌物，也是蜜蜂生長和繁衍過程中的食物。研究發(fā)現(xiàn)，蜂王漿極具營養(yǎng)價值和免疫功能，其富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、維生素和礦物元素，具有輔助控制血管擴(kuò)張，降低血糖、血脂、血壓，護(hù)肝，提高免疫力以及抗衰老等功效[1-2]。隨著蜂王漿的消費需求不斷增長，對其質(zhì)量的要求也越來越高，其中藥物殘留是衡量蜂王漿產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)。

雙甲脒(Amitraz)，又稱N,N-雙(2,4-二甲苯亞氨基甲基)甲胺，屬于一種常見的有機(jī)氮殺蟲、殺螨劑，廣泛用于蔬菜、茶葉、棉花等作物以防治害螨、蚜蟲、棉鈴蟲等[3]。由于其可以有效防治狄瓦氏螨引起的蜂病且對蜜蜂低毒，因此廣泛用于蜂巢除螨[4-5]。單甲脒(Semiamitraz)，又稱N′-(2,4-二甲基苯基)-N-甲基亞胺甲酰胺(DMPF)，其既是雙甲脒的代謝產(chǎn)物，也是殺螨劑，且對蜜蜂比較安全，可作為農(nóng)藥單獨使用[6]。雙甲脒和單甲脒可代謝分解形成2,4-二甲基苯基甲酰胺(DMF)和2,4-二甲基苯胺(DMA)。其中DMA是合成單甲脒和雙甲脒的化工原料，其具有毒副作用和致突變性，對肝臟的損傷較大[7]。因此各國紛紛制定雙甲脒在農(nóng)產(chǎn)品及蜂產(chǎn)品中的最低限量，歐盟、日本和美國規(guī)定蜂產(chǎn)品中雙甲脒的最低限量為0.2 mg/kg，并要求同時檢測其代謝物[8-11]。

目前，蜂產(chǎn)品中雙甲脒的測定通常是在酸、堿環(huán)境下高溫水解生成最終代謝產(chǎn)物DMA，通過氣相色譜法(GC)[12-17]和氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[18-22]進(jìn)行檢測，再轉(zhuǎn)化成雙甲脒的含量。隨著色譜分離手段的提高和質(zhì)譜檢測器的使用，研究人員采用氣相色譜法[23-24]、氣相色譜-質(zhì)譜法[25]、高效液相色譜法(HPLC)[26-29]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[30-34]對蜂產(chǎn)品中的雙甲脒及其代謝物進(jìn)行直接測定。然而同時測定雙甲脒、DMPF及其代謝物DMF和DMA的相關(guān)研究較少[35-37]。本研究采用緩沖溶液、乙腈、氯化鈉沉淀蜂王漿中的蛋白質(zhì)和提取目標(biāo)化合物，以N-丙基乙二胺(PSA)、C18和無水硫酸鎂進(jìn)行分散固相萃取凈化(dSPE)，建立了同時檢測蜂王漿中雙甲脒、DMPF、DMF和DMA殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1260-6495型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Agilent公司，配有電噴霧離子源)，臺式離心機(jī)(美國Thermo公司)；Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)；IKA MS3 Basic型渦旋器(德國IKA公司)。

雙甲脒、DMPF、DMF和DMA標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%，Dr.Ehrenstorfer公司)，雙甲脒-D6標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，TRC公司)，DMA-D6標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，C/D/N Isotopes公司)。用乙腈將各標(biāo)準(zhǔn)品溶解并定容得10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，根據(jù)需要用乙腈將其稀釋至所需濃度。

氯化鈉(純度≥99.5%)、PSA、C18和石墨化碳黑(GCB)粉末(上海安譜實驗科技股份有限公司)；無水硫酸鎂(MgSO4)粉末(純度≥98.0%，西隴科學(xué)股份有限公司)；乙腈、甲醇和甲酸(色譜純，德國Merck公司)；實驗用水為Milli-Q高純水(由Milli-Q超純水器制備)；pH 4.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10、11的緩沖溶液(愛爾蘭Reagecon公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品提取稱取2 g蜂王漿樣品(精確至0.01 g)于50 mL具塞離心管中，加入100 μL 400 ng/mL的同位素內(nèi)標(biāo)溶液和pH 9.0的緩沖溶液至10 mL，2 000 r/min渦旋混合1 min，靜置5 min，加入10 mL乙腈和2 g 氯化鈉，2 000 r/min渦旋混勻1 min，靜置5 min，8 500 r/min離心5 min，移取上層乙腈相至另一50 mL具塞離心管，水相再加入10 mL乙腈，2 000 r/min渦旋混勻，靜置5 min，8 500 r/min離心5 min，合并乙腈提取液，定容至20 mL，混勻待凈化。

1.2.2 樣品凈化將1.0 mL提取液轉(zhuǎn)移至含有25 mg PSA、10 mg C18和30 mg 無水MgSO4的15 mL具塞離心管中，2 000 r/min渦旋混勻30 s，8 500 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移全部上清液，加水定容至2.0 mL，渦旋混勻，過0.22 μm濾膜后，待測定。

1.2.3 色譜條件色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：A為0.15%甲酸溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：0～8.0 min，40%～65%B；8.0～9.0 min，65%～95%B；9.0～14.0 min，95%B；14.0～15.0 min，95%～40%B；15.0～16.0 min，40%B，16.0～19.0 min，保持40%B進(jìn)行系統(tǒng)平衡。流速變化程序：0～8.0 min，保持0.4 mL/min；8.0～9.0 min，0.4～0.7 mL/min；9.0～15.0 min，保持0.7 mL/min；15.0～16.0 min，0.7～0.4 mL/min；16.0～19.0 min，保持0.4 mL/min進(jìn)行系統(tǒng)平衡。進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為25 ℃。

1.2.4 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描模式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；毛細(xì)管電壓：2 500 V；離子源溫度：130 ℃；干燥氣流量：16 L/min；鞘氣溫度：250 ℃，鞘氣流量：11 L/min。其它質(zhì)譜條件見表1。

表1 雙甲脒、DMPF及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of amitraz,DMPF and their metabolites

* quantitative ion pair

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的選擇

已有研究表明，酸性環(huán)境下雙甲脒易發(fā)生分解[34,38]。考察了蜂王漿基質(zhì)中加入不同pH值緩沖溶液(pH 4.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10、11)對目標(biāo)物提取效果的影響。結(jié)果表明，蜂王漿提取溶液在pH 7.0～8.0下的提取效果最佳。其中雙甲脒和DMPF易受到pH值的影響，在酸性環(huán)境下，雙甲脒的回收率明顯降低；當(dāng)pH>8.0時DMPF的回收率開始下降，當(dāng)pH>10時，其回收率小于60%。由于蜂王漿溶液偏弱酸性，實驗最終選擇加入pH 9.0的緩沖溶液，此時蜂王漿提取溶液pH為7.0～8.0，可達(dá)到最佳提取效果。

圖1 不同用量PSA、C18和無水MgSO4對凈化結(jié)果的影響(n=3)Fig.1 Effect of different dosage of PSA,C18 and MgSO4 on purification result(n=3)

分別采用乙腈和甲醇對蜂王漿基質(zhì)進(jìn)行沉淀蛋白、目標(biāo)物提取和凈化試驗。結(jié)果表明：甲醇沉淀蛋白質(zhì)的效果略好于乙腈，但乙腈的凈化回收率比甲醇高10%左右，且回收率更穩(wěn)定。結(jié)合流動相體系，最終選用乙腈作為蛋白沉淀劑和目標(biāo)物提取劑，同時加入氯化鈉有助于乙腈和水相分層，提高提取效率。

2.2 凈化條件的選擇

分別考察了PSA、C18、GCB和無水MgSO4對目標(biāo)化合物的吸附情況，結(jié)果顯示單獨使用15、30、100 mg的GCB時對雙甲脒的吸附均達(dá)到90%以上，導(dǎo)致雙甲脒的回收率小于10%。而單獨使用PSA、C18或無水MgSO4時4種目標(biāo)化合物的回收率均大于75%。因此進(jìn)一步考察了PSA、C18和無水MgSO4不同用量組合時的凈化效果，結(jié)果表明隨著吸附劑用量的增加，各目標(biāo)物的回收率均降低，其中DMPF的回收率降低最明顯(圖1)。實驗最終采用25 mg PSA+10 mg C18+30 mg無水MgSO4對蜂王漿提取液進(jìn)行凈化，此時4種目標(biāo)化合物的回收率最大。

2.3 液相色譜條件的選擇

參考文獻(xiàn)方法[35]，本實驗選擇C18色譜柱對目標(biāo)化合物進(jìn)行分離，以乙腈-0.15%甲酸溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，并在9.0 min時將流速提升至0.7 mL/min，從而縮短雙甲脒的保留時間。考慮到雙甲脒的酸不穩(wěn)定性，并結(jié)合前處理凈化條件，最終采用乙腈-水(體積比1∶1)定容，對目標(biāo)化合物的色譜峰形基本無影響。優(yōu)化的色譜條件如“1.2.3”所示。

2.4 質(zhì)譜條件的選擇

在正離子模式下，采用直接進(jìn)樣方式對1.0 μg/mL待測化合物的單標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子全掃描，確定分子離子峰，再以分子離子為母離子，對其子離子進(jìn)行全掃描。按照歐盟EC/657指令，串聯(lián)質(zhì)譜法定量確證須滿足4個識別點的要求(母離子1點，特征子離子1.5點/個)，本實驗選擇2個特征子離子進(jìn)行測定，其中以信噪比高、峰形好、干擾小的離子對作為定量離子對，另一個離子對作為定性離子對。以MRM正離子模式優(yōu)化各質(zhì)譜參數(shù)，發(fā)現(xiàn)雙甲脒和單甲脒易發(fā)生源內(nèi)裂解，將離子源毛細(xì)管電壓設(shè)為2 500 V，離子源溫度和鞘氣溫度分別設(shè)為130 ℃和250 ℃，可以有效保證離子化效率并降低源內(nèi)裂解。最佳質(zhì)譜條件見表1。

圖2 空白蜂王漿基質(zhì)溶液加標(biāo)(5 μg/kg)的提取離子流圖Fig.2 The extracted ion chromatograms of spiked solution on royal jelly matrix(5 μg/kg)

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

采用本方法分別測定混合溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白基質(zhì)加標(biāo)溶液，通過計算離子抑制率來考察基質(zhì)效應(yīng)情況[39-40]。其中，離子抑制率(%)=(混合溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液中響應(yīng)強度-空白基質(zhì)加標(biāo)溶液中響應(yīng)強度)×100%/混合溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液中響應(yīng)強度。結(jié)果顯示，雙甲脒和DMA的離子抑制率相對較大，分別為32.0%和24.4%，存在基質(zhì)抑制效應(yīng)。本實驗最終采用空白基質(zhì)加標(biāo)溶液配制線性工作曲線，同時結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)法定量以降低基質(zhì)效應(yīng)。

2.6 方法線性關(guān)系與定量下限

采用本方法測定質(zhì)量濃度為0、5、10、20、50、100 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)物與同位素內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo)，以待測物的質(zhì)量濃度(X，μg/kg)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表2可知，各化合物在0～100 μg/kg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)大于0.996。以10倍信噪比(S/N=10)計算方法定量下限，雙甲脒、DMPF、DMF和DMA的定量下限分別為0.10、0.25、5.0、2.5 μg/kg。空白蜂王漿樣品加標(biāo)5 μg/kg的提取離子流圖見圖2。

2.7 方法回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

在空白蜂王漿中進(jìn)行5、10、20 μg/kg 3個濃度水平的加標(biāo)回收實驗，每個濃度做6個平行樣品。結(jié)果顯示，4種目標(biāo)物的回收率為77.0%～107%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.0%～11%。

表2 雙甲脒、DMPF及其代謝物的線性關(guān)系、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Linear relationships，recoveries and relative standard deviations of amitraz,DMPF and their metabolites(n=6)

2.8 實際樣品分析

應(yīng)用本方法對市場采購的15批次不同品牌蜂王漿樣品進(jìn)行測定，其中1個樣品檢出雙甲脒，含量為37.2 μg/kg，該結(jié)果與GB 23200.103-2016[17]的檢測結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

本文建立了分散固相萃取凈化/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(dSPE/LC-MS/MS)測定蜂王漿中雙甲脒、單甲脒及其代謝物殘留量的方法。采用pH 9.0的緩沖溶液稀釋蜂王漿樣品，通過乙腈和氯化鈉進(jìn)行蛋白沉淀、鹽析提取，N-丙基乙二胺、C18和無水硫酸鎂進(jìn)行分散固相萃取凈化，LC-MS/MS法進(jìn)行分離測定，同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。該方法前處理過程環(huán)境友好，簡便快捷，檢測成本低，定量下限滿足目前國內(nèi)外相關(guān)化合物最大殘留限量的要求，可以實現(xiàn)對蜂王漿中雙甲脒、DMPF及其代謝物殘留情況的有效監(jiān)控。