馮 春，石志紅，吳興強，胡雪艷，范春林*

(1.河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100176)

枸杞，又名枸杞子，果實橘紅色，味道甜美，通常在夏末秋初收獲后曬干，是茄科植物的一個屬[1]。由于枸杞具有潛在的藥理活性，已有報道多是對其多糖和類胡蘿卜素2種主要成分進行研究[2]。多糖已被報道具有保護眼部神經(jīng)及肝臟[3]、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)的作用[4]；類胡蘿卜素中玉米黃素占60%，玉米黃素具有保護視力、抗癌[5]等作用。枸杞中還含有鋅、鐵、銅、鈣、硒和鍺[6]等微量元素。因此枸杞既是一種中藥材，也可作為保健品，并日益受到人們的青睞。枸杞主要生長在我國中部和中北部的寧夏、青海、山東等地[7]，其在種植過程中需施用嘧啶磷、毒死蜱、甲基毒死蜱[8-9]等有機磷類農(nóng)藥殺滅蚜蟲、銹螨、木虱、實蠅等害蟲。有機磷農(nóng)藥因具有藥效高、選擇性強等優(yōu)點，在全世界范圍內(nèi)廣泛使用[10]，但其可致畸、致癌、破壞神經(jīng)系統(tǒng)而致人死亡，因此有必要對枸杞中有機磷農(nóng)藥殘留進行監(jiān)測。

目前，枸杞中有機磷農(nóng)藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜法[11-12]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9,13]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14-15]。其中，氣相色譜法對該類農(nóng)藥的檢測靈敏度較低，在日常農(nóng)藥殘留檢測中使用相對較少；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法應(yīng)用面較廣但其有機溶劑消耗量大；而氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有定量準確、靈敏度高等優(yōu)點，對枸杞等復(fù)雜基質(zhì)檢測具有一定優(yōu)勢。枸杞中有機磷農(nóng)藥殘留提取多采用均質(zhì)法[13,15]、分散固相萃取法[16]、基質(zhì)固相萃取法(MSPD)[11]、超聲提取法[9,11]，但實踐中發(fā)現(xiàn)，由于枸杞含糖量極高，粘度大，采用上述方法提取時，極易造成粘均質(zhì)刀頭和樣品結(jié)塊等現(xiàn)象，從而降低提取效率。加速溶劑較其他提取方法具有自動化程度高、重現(xiàn)性好、提取效率高等優(yōu)點，已用于枸杞中農(nóng)藥殘留的提取[17]，但所報道的方法使用了大量的含氯提取溶劑，且檢測靈敏度低。為此，本文建立了加速溶劑萃取結(jié)合固相萃取凈化的新方法對枸杞樣品進行前處理，采用氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜對20種有機磷農(nóng)藥進行測定，方法較已有文獻具有溶劑消耗少且定量下限低等優(yōu)點，已成功應(yīng)用于實際枸杞樣品中有機磷農(nóng)藥殘留的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Dinoex ASE350加速溶劑萃取儀(美國Thermo Fisher公司)，Agilent 7890A-7000氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)，Rotavapor R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Bucci公司)，N-EVAP112型氮吹濃縮儀(美國Organomation Associates公司)，PL602電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)，AH-30全自動均質(zhì)儀(?？苾x器有限公司)，SR-2DS水平振蕩器(日本Taitec公司)，KQ-600B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Cleanert TPH柱(美國Agilent公司)。

20種農(nóng)藥標準品(純度≥95%)及內(nèi)標環(huán)氧七氯(見表1)均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司;乙腈(CH3CN)、二氯甲烷(CH2Cl2)、正己烷(C6H14)(美國Honeywell公司)和甲苯(美國Fisher公司)均為色譜純；無水硫酸鈉(Na2SO4，分析純);甲醇(色譜純，美國Fisher公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜-質(zhì)譜條件色譜柱：DB-1701(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度：250 ℃；載氣：高純氦氣(純度99.999%)；流速:1.2 mL/min；進樣方式：不分流進樣；進樣量：1 μL；溶劑延遲:6 min。掃描模式:多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。升溫程序：初始溫度40 ℃保持1 min，以30 ℃/min升溫至130 ℃，再以5 ℃/min升溫至250 ℃，最后以10 ℃/min升溫至300 ℃，保持7 min。離子源：EI源；離子源電壓：70 eV；離子源溫度：280 ℃；四極桿溫度：150 ℃；傳輸線溫度：280 ℃。

1.2.2 樣品的制備稱取400 g枸杞、400 g硅藻土置于-40 ℃冰箱中冷凍過夜，然后用中藥材粉碎機混勻打碎，制備成混合物粉末試樣，置于-20 ℃冰箱中冷藏，備用。

1.2.3 標準溶液的配制分別準確稱取10 mg(精確至0.1 mg)20種農(nóng)藥標準品于10 mL容量瓶中，用甲醇(色譜純)溶解并定容，得到1 g/L單標儲備液。根據(jù)需要移取一定體積的20種有機磷農(nóng)藥的單標儲備液，配制混合標準溶液，于4 ℃環(huán)境下避光保存，備用。

1.2.4 樣品的提取與凈化裝好11 mL加速溶劑萃取池，底部加入墊片，裝入0.5 g硅藻土，準確稱取4 g(精確至0.01 g)制備好的試樣加入萃取池，上層填滿硅藻土，擰緊萃取池蓋。以酸化乙腈(含1% HAc)-二氯甲烷(體積比4∶1)為提取溶劑，萃取溫度為70 ℃、沖洗體積為40%、循環(huán)萃取3次，每次萃取5 min。提取液超聲后，轉(zhuǎn)入80 mL雞心瓶中，用2.5 mL乙腈潤洗收集瓶2次，合并全部收集液于40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約2 mL，待凈化。Cleanert TPH固相萃取柱中加入約2 cm高無水硫酸鈉和6 mL乙腈-甲苯(體積比3∶1)活化萃取柱，棄去流出液。下接50 mL雞心瓶收集洗脫液，加入待凈化樣品，用2 mL乙腈-甲苯(3∶1)洗滌雞心瓶3次，依次加入萃取柱，待液體接近硫酸鈉面時，上接貯液器，加入25 mL乙腈-甲苯(3∶1)進行洗脫。收集流出液，于40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至0.5 mL，加入40 μL環(huán)氧七氯內(nèi)標溶液(用于校正回收率)，氮吹濃縮至干，用1 mL正己烷復(fù)溶，過0.22 μm濾膜，上機待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

將20種農(nóng)藥稀釋至2 mg/L，在m/z50～550范圍內(nèi)進行全掃描，根據(jù)譜圖確定各農(nóng)藥的保留時間，以質(zhì)荷比較大、豐度較高的特征離子作為前級離子，對其進行碎裂離子掃描，使碰撞電壓在5～40 eV范圍內(nèi)每隔5 eV碰撞1次，每種碰撞能下選出豐度較高的2個特征產(chǎn)物離子作為碎裂離子，其中豐度較高的用于定量分析，另一個用于定性分析。20種農(nóng)藥的CAS、保留時間、離子信息、碰撞能量列于表1，總離子流色譜圖見圖1。

表1 20種農(nóng)藥及內(nèi)標的CAS、保留時間、離子信息、碰撞能Table 1 CAS,retention times(RT),ion pairs information,collision energy(CE) for 20 pesticides and internal standard

圖1 20種農(nóng)藥及內(nèi)標的混標溶液(2 mg/L)總離子流色譜圖Fig.1 TIC chromatogram of 20 pesticides and IS standard solution(2 mg/L) the peak numbers 1-21 are the same as those in Table 1,other numbers represent segmentation method of MRM(峰上所表示的數(shù)字與表1中的數(shù)字相同,其他數(shù)字表示MRM分段方法)

2.2 萃取方法的優(yōu)化

2.2.1 萃取溶劑的選擇萃取溶劑是影響目標物回收率的重要因素之一，因此實驗考察了酸化乙腈(1% HAc)、乙腈-二氯甲烷(體積比4∶1、3∶2)、酸化乙腈(1% HAc)-二氯甲烷(體積比4∶1) 4種萃取溶劑對20種農(nóng)藥回收率的影響。結(jié)果顯示，采用酸化乙腈提取時，20種農(nóng)藥回收率合格(在70%～120%范圍內(nèi))的僅1個，占比5%；以乙腈-二氯甲烷(體積比4∶1)提取時，回收率合格的農(nóng)藥有13個，占比65%；調(diào)節(jié)乙腈-二氯甲烷的體積比為3∶2時發(fā)現(xiàn)，95%(19個)的農(nóng)藥回收率滿足要求；而采用酸化乙腈(1% HAc)-甲烷(體積比4∶1)時20種農(nóng)藥的回收率均合格。這是因為枸杞中的糖和油脂使其基質(zhì)粘性較大，僅采用乙腈提取時，基質(zhì)在乙腈表面形成不可逆包覆等因素阻礙了乙腈與基質(zhì)的有效接觸而使部分農(nóng)藥回收率較低[18]。另外，實驗還發(fā)現(xiàn)酸性溶劑有利于有機磷的提取，但二氯甲烷比例過高會導(dǎo)致共萃物增加，因此選擇酸化乙腈(1% HAc)-二氯甲烷(體積比4∶1)作為提取劑。

2.2.2 萃取溫度的考察實驗考察了不同萃取溫度(50、60、70、80 ℃)對20種有機磷農(nóng)藥回收率的影響。結(jié)果顯示，當萃取溫度升高時，20種農(nóng)藥的回收率均明顯提高，在70 ℃時大部分農(nóng)藥回收率達到最高，繼續(xù)升高溫度，部分農(nóng)藥的回收率反而下降，其原因可能是溫度過高導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)增強，使得部分農(nóng)藥回收率減小，因此選擇70 ℃為最佳萃取溫度。

2.2.3 沖洗體積沖洗體積是影響加速溶劑萃取的條件之一，因此實驗考察了沖洗體積(20%、30%、40%、50%)對回收率的影響。結(jié)果表明，當沖洗體積為40%時，全部農(nóng)藥的回收率最佳，均在70%～120%范圍內(nèi)。因此沖洗體積選擇40%。

2.2.4 循環(huán)次數(shù)實驗考察了循環(huán)次數(shù)為1、2、3次的萃取效率。結(jié)果顯示，循環(huán)次數(shù)為3次時，20種農(nóng)藥的回收率達到最佳，為75%～100%。因此設(shè)置循環(huán)次數(shù)為3次。

2.2.5 萃取時間考察了萃取時間為1、3、5、7 min時20種農(nóng)藥的提取效率。結(jié)果顯示，當萃取時間為1、3 min時，回收率合格的農(nóng)藥占比不足25%；萃取5 min時，回收率均合格；但萃取時間為7 min時，反而有3種藥物的回收率不合格。究其原因，萃取時間過短時，部分藥物被洗脫下來；萃取時間過長會導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)增強，對藥物的吸附作用增強，因此選擇最佳萃取時間為5 min。

2.3 凈化條件優(yōu)化

2.3.1 固相萃取柱的選擇實驗考察了Cleanert TPH柱、C18柱、Carbon-NH2柱、PSA柱4種固相萃取柱的凈化效果(圖2)。結(jié)果顯示，Cleanert TPH柱的萃取效率最高，與文獻報道[19]一致，這源自于Cleanert TPH柱中填料可以去除提取物中的色素、酸性干擾物質(zhì)、糖分以及酯溶性物質(zhì)，并且不會干擾目標物的提取。因此選擇Cleanert TPH柱作為萃取柱。

圖2 固相萃取柱的選擇Fig.2 Selection of solid phase extraction cartridge the pesticide numbers 1-20 are the same as those in Table 1

2.3.2 淋洗液的選擇實驗考察了正己烷-丙酮(體積比4∶6)和乙腈-甲苯(體積比3∶1)為淋洗液時對藥物回收率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，后者對藥物洗脫更完全，因此確定淋洗液為乙腈-甲苯(體積比3∶1)。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

2.5 線性范圍、檢出限與定量下限

以枸杞空白樣液配制1、2、5、10、20、50、100、200、500 μg/kg的20種農(nóng)藥標準溶液，在優(yōu)化條件下測定，以各農(nóng)藥的定量離子對峰面積為縱坐標，對應(yīng)濃度為橫坐標，繪制標準曲線。結(jié)果表明，20種農(nóng)藥在一定的濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.999 0～0.999 8；分別以3倍和10倍信噪比計算得20種農(nóng)藥的檢出限(LOD)為0.2～5.0 μg/kg，定量下限(LOQ)為1.0～15.0 μg/kg(見表2)。該方法檢出限較低，表明加速溶劑萃取效果較好，適用于枸杞基質(zhì)中有機磷農(nóng)藥殘留的檢測。

2.6 加標回收率與精密度

向空白樣品中添加一定濃度的20種農(nóng)藥標準溶液，使其含量分別為20、40、100 μg/kg，每個水平平行5個樣品，在優(yōu)化條件下測定，計算加標回收率與相對標準偏差(RSD)。結(jié)果表明，20種農(nóng)藥在3個加標水平下的平均回收率分別為70.0%～80.9%、70.8%～82.9%、70.1%～81.0%，RSD均不高于8.5%。表明該方法的準確度和精密度較高，可用于實際樣品種農(nóng)藥殘留的定量分析。

表2 枸杞中20種農(nóng)藥的回收率、相對標準偏差、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 2 Recovery,relative standard deviation,linear range,correlation coefficients(r2),limits of detections(LODs) and limits of quantitation(LOQs) of 20 pesticides in Chinese wolfberry

the number denoted was the same as that in Table 1(所表示的數(shù)字與表1中的數(shù)字相同)

2.7 實際樣品檢測

購買青海等地枸杞樣品10例，在優(yōu)化條件下采用本方法檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中2例樣品分別檢出毒死蜱和丁基嘧啶磷，含量分別為293.6、2.1 μg/kg。陽性樣品的MRM圖見圖3。

圖3 實際樣品MRM圖Fig.3 MRM chromatograms of 2 actual samples

3 結(jié) 論

本文通過優(yōu)化加速溶劑萃取條件和SPE凈化條件，建立了GC-MS/MS測定枸杞中20種有機磷農(nóng)藥殘留的分析方法。該方法定量準確、檢出限低，適用于枸杞中有機磷農(nóng)藥殘留的檢測。