王文文，楊 飛，楊 中，范 蕊，李 芳，曹雪琴,2*

(1.新疆維吾爾自治區(qū)分析測試研究院,新疆 烏魯木齊 830011；2.中國科學(xué)院 新疆理化技術(shù)研究所，新疆 烏魯木齊 830011)

貝母屬于百合科(Liliaceae)貝母屬(Fritillaria)多種植物的干燥鱗莖，是中國、日本和土耳其傳統(tǒng)民間藥物的原材料，臨床上常用于止咳化痰。2015版《中國藥典》共收載川貝母、平貝母、浙貝母、伊貝母、湖北貝母5種貝母[1]。其中以浙貝母和川貝母在臨床上應(yīng)用最為廣泛[2]。貝母屬植物中的化學(xué)成分可分為水溶性非生物堿類和生物堿類[3]。生物堿類為甾體生物堿，是貝母類藥物的指標(biāo)性成分，其含量和結(jié)構(gòu)類型在不同的貝母屬中也有所不同[4]。如：浙貝母的主要藥效成分為貝母素甲和貝母素乙，伊貝母的主要藥效成分為西貝母堿苷和西貝母堿。根據(jù)結(jié)構(gòu)類型，甾體生物堿又分為甾體生物堿和異甾體生物堿[5]。川貝母、伊貝母、浙貝母的主要成分為異甾體生物堿，湖北貝母和平貝母的主要成分為甾體生物堿[6-7]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，貝母中生物堿具有止咳、抗炎、祛痰、抗膽堿活性等藥理活性,其單體成分為貝母辛、西貝母堿、貝母素乙、貝母素甲和西貝母堿苷等[8-11]。上述5種生物堿是貝母藥材的指示性成分，也是貝母藥材藥效評價和質(zhì)量控制的依據(jù)。

目前生物堿的測定方法主要有比色法、兩相滴定法、非水滴定法、薄層色譜法、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射器(HPLC-ELSD)法[12-14]等。2015版藥典中，分別采用紫外分光光度法測定川貝母中西貝母以及平貝母中貝母素乙；HPLC-ELSD法測定伊貝母中西貝母堿、西貝母堿苷，浙貝母中貝母素甲、貝母素乙，以及湖北貝母中貝母素乙。劉玉明等[15]采用HPLC-ELSD法同時測定新疆貝母中貝母辛和貝母素乙含量。由于貝母中的生物堿對紫外吸收很弱，因此文獻(xiàn)多采用HPLC-ELSD法，但該法靈敏度較低，干擾因素較多[16-22]。部分研究者采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜法測定貝母中的生物堿。Zhou等[23]采用液相色譜-電噴霧四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-ESI-QTOF-MS/MS)可分析貝母屬中41種生物堿。Li等[24]采用氣相色譜法測定貝母中7種生物堿的活性。

目前文獻(xiàn)報道中多以單種貝母中主要藥效成分的同時測定為主，對于不同品種貝母中西貝母堿、西貝母堿苷、貝母素甲、貝母素乙和貝母辛5種藥效成分的同時測定鮮有報道。本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定了伊貝母、川貝母、浙貝母中上述5種生物堿，以期為不同品種貝母中此5種有效成分的同時測定提供簡便方法。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters Xevo TQ-MS型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)，配有電噴霧離子源；Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)；高速離心機(jī)(德國Sigma公司)；渦旋混合器(德國IKA公司)。

貝母辛、西貝母堿、貝母素乙、貝母素甲和西貝母堿苷均為對照品，純度均≥98%，由中國食品藥品檢定所提供；甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司)；三氯甲烷(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；甲酸(色譜純，美國Tedia公司)；實(shí)驗用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。實(shí)驗用貝母藥材(包括伊貝母、川貝母、浙貝母)購自中藥店。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別精密稱取5種對照品各10.0 mg，用甲醇溶解并定容至50.00 mL，配制成0.20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，儲存于棕色玻璃瓶中，-20 ℃下避光保存。用初始流動相將標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制成適當(dāng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：3.0 μL；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸溶液；洗脫程序：0～2.0 min，5%～55%A；2.0～4.5 min，55%～95% A；4.5～6.0 min，95% A；6.0～8.0 min，95%～5% A。

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；毛細(xì)管電壓：2.8 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣(N2)溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/h；錐孔氣流量：50 L/h；碰撞氣(Ar)流量：2.5 L/h。

表1 5種化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of 5 compounds

*quantitative ion

1.4 樣品前處理

貝母藥材用研缽磨成粉末后過4號篩(孔徑為250±9.9 μm)，取樣品粉末約1.0 g，精密稱定，置于150 mL錐形瓶中，加1 mL氨水浸潤1 h，精密加入25 mL三氯甲烷-甲醇(4∶1，體積比)混合溶液，混勻，稱重。置于85 ℃水浴中索氏抽提加熱回流2 h，冷卻，用三氯甲烷-甲醇(4∶1)補(bǔ)重，過濾，取5.0 mL濾液于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用甲醇定容至5.0 mL。經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化在一級質(zhì)譜全掃描模式下同時采集正、負(fù)離子信號，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物在正離子模式下的響應(yīng)值較好，特征母離子均為[M+H]+。在正離子監(jiān)測模式下，分別對毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、碰撞能量和選擇離子等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，選取所得豐度較高的兩個子離子作為特征離子。然后在子離子掃描模式下，選擇響應(yīng)最高的子離子作為定量離子，響應(yīng)次高的子離子作為定性離子，并在MRM模式下對目標(biāo)物的碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化。5種目標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化采用UPLC常用的BEH C18色譜柱，考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%甲酸溶液作為流動相時對色譜分離和質(zhì)譜電離的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用甲醇-水、乙腈-水作為流動相對信號強(qiáng)度的影響不大，但乙腈作為流動相時目標(biāo)化合物的峰形更尖銳，并且在流動相中添加少量甲酸，能提高目標(biāo)化合物的離子化效率，增強(qiáng)信號強(qiáng)度，得到較好的峰形。因此選用乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相。5種化合物的MRM色譜圖如圖1所示。

圖1 5種化合物的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of five compounds1：peimisine，2：sipeimine，3：peiminine，4：peimine，5：sipeimine-3β-D-glucoside

2.1.3 樣品預(yù)處理條件的優(yōu)化貝母中生物堿的提取方法主要有溶劑提取法、煎煮法、浸漬法、滲漉法、回流法等[25]?？疾炝吮緦?shí)驗室常用的浸漬法和索氏抽提法的提取效果。結(jié)果表明，提取率隨著提取時間的延長而升高，提取時間為2 h時，索氏抽提法的提取率達(dá)到最高(為0.05%)，此時浸漬法的提取率為0.03%。延長浸漬法的提取時間和增加溶劑用量可達(dá)到與索氏抽提法相近的提取率，但浸漬時間較長，溶劑用量相對較大，因此選用索氏抽提法。

2.2 樣品的穩(wěn)定性

取供試樣品和20 μg/L的混合對照品溶液分別于0、4、8、10、12、24 h進(jìn)樣測定，進(jìn)樣量為3.0 μL。結(jié)果表明，供試樣品和對照品在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均不大于1.3%。

2.3 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

用初始流動相將1.0 mg/L的混合對照品溶液稀釋至質(zhì)量濃度為0.000 5、0.001、0.005、0.01、0.05 mg/L，采用本方法進(jìn)行測定，以對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。采用對照品溶液，以特征定量離子對色譜峰的信噪比(S/N)≥ 3作為檢出限(LOD)，S/N≥ 10作為定量下限(LOQ)。結(jié)果表明，5種生物堿均在0.000 5～0.05 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)大于0.999，LOD為0.03 mg/kg，LOQ為0.1 mg/kg(見表2)。

表2 5種生物堿的線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限、定量下限、加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Regression equations,correlation coefficients(r),LODs，LOQs，recoveries and RSDs of 5 alkaloids(n=6)

2.4 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

取已知含量的川貝母1號樣品3份，分別添加1.0、2.5、5.0 mg/kg 3個濃度水平的混合對照品溶液，采用本方法進(jìn)行前處理和進(jìn)樣分析(n=6)。由表2可知，5種生物堿的回收率為78.6%～93.1%，RSD不大于8.6%，說明該方法的精密度和準(zhǔn)確度較高。

2.5 實(shí)際樣品的檢測

采用建立的方法分別對9批貝母藥材進(jìn)行測定。由表3可知，不同品種貝母中5種生物堿的含量差異較大。貝母辛在伊貝母中含量總體相對較高，川貝母中次之。西貝母堿在川貝母2號樣品中含量最高，浙貝母中則未檢出。貝母素乙在伊貝母和川貝母中均未檢出；貝母素甲在浙貝母中含量最高，川貝母中未檢出。西貝母堿苷在伊貝母中含量最高，浙貝母中未檢出。其中西貝母堿苷的含量多數(shù)高于其他4種生物堿。購自不同藥店的同種貝母中生物堿含量也略有差別，這可能與貝母產(chǎn)地有關(guān)。

表3 貝母藥材中5種生物堿的含量Table 3 Contents of five alkaloids in Fritillaria samples w/(mg·kg-1)

*no detected

3 結(jié) 論

本文建立了同時測定貝母藥材中貝母辛、西貝母堿、貝母素乙、貝母素甲和西貝母堿苷的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。在優(yōu)化實(shí)驗條件下，上述5種生物堿在0.000 5～0.05 mg/L范圍內(nèi)線性良好，檢出限均為0.03 mg/kg，定量下限均為0.1 mg/kg。本方法簡便快捷，靈敏度高，可以滿足貝母藥材中此5種成分的同時檢測要求。