周 杰，趙 靜，董 超，張耀海，趙其陽，焦必寧

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院/西南大學(xué)柑桔研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，重慶 400712)

柑桔是世界第一大水果，我國(guó)的柑桔種植面積和產(chǎn)量均居世界第一，但柑桔黃龍病、潰瘍病等檢疫性病害嚴(yán)重威脅我國(guó)柑桔業(yè)的發(fā)展。研究表明，通過葉面噴施或樹干注射青霉素G對(duì)防治柑桔黃龍病有效[1]。青霉素G屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，廣泛應(yīng)用于人和動(dòng)物疾病治療、畜牧養(yǎng)殖以及種植業(yè)。其在酸、堿、親核試劑、氧化劑等條件下易發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，產(chǎn)生的代謝物主要為青霉二酸(Penillic acid)和去羧青霉噻唑酸(Penilloic acid)[2]。這些代謝物無抗菌活性，但3%～5%的青霉素過敏反應(yīng)與其有關(guān)[3]，其中去羧青霉噻唑酸是造成過敏反應(yīng)的主要原因[4]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告[5]和歐盟指令No.37/2010/EU[6]規(guī)定青霉素類藥物在動(dòng)物性食品中的最大殘留限量為50 μg/kg，但對(duì)植物性食品未設(shè)相應(yīng)限量。因此，建立柑桔中青霉素G及其代謝物殘留的檢測(cè)方法，對(duì)于研究青霉素在柑桔中的殘留降解代謝規(guī)律，以及制定符合良好農(nóng)業(yè)規(guī)范(GAP)的安全使用規(guī)程具有重要意義。

目前，食品中青霉素類藥物殘留的分析方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[8]、近紅外光譜法(NIR)[9]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法(SERS)[10]和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)[11]等，樣品多為乳類、肉類、蛋類、水產(chǎn)品以及蜂蜜等動(dòng)物性食品，而對(duì)植物性食品的檢測(cè)鮮有報(bào)道[2,12-13]。Aldeek等[2,12]建立了固相萃取結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)分析柑桔中青霉素G、青霉二酸和去羧青霉噻唑酸的方法，青霉素G的回收率為90%～100%，青霉二酸和去羧青霉噻唑酸的回收率為50%～73%。隨后利用該方法測(cè)定了柑桔果汁中的青霉素G及其代謝物，青霉素G的回收率接近100%，青霉二酸和去羧青霉噻唑酸的回收率為60%～75%[13]。但該方法操作繁瑣，耗時(shí)費(fèi)力，所用同位素內(nèi)標(biāo)的成本較高，且代謝產(chǎn)物的回收率偏低。

本研究采用分散固相萃取(DSPE)前處理技術(shù)，結(jié)合UPLC-MS/MS法，建立了柑桔中青霉素G、青霉二酸和去羧青霉噻唑酸的快速測(cè)定方法。該方法操作簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，檢測(cè)成本低，可作為植物源食品中青霉素G及其代謝物的常規(guī)檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Acquity UPLC-Quattro Premier XE超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)，配有電噴霧離子源(ESI)和MassLynx 4.1工作站；Milli-Q超純水儀(美國(guó)Millipore公司)；CL31/CL31R多用途離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；有機(jī)相針式濾器(0.22 μm，上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；Oasis HLB柱(6 mL/500 mg，美國(guó)Waters公司)；ENVI C18柱(12 mL/2 000 mg，美國(guó)Supelco公司)。

甲醇、乙腈(色譜純，德國(guó)CNW 公司)；甲酸(色譜純，成都市科龍化工試劑廠)；N-丙基乙二胺(PSA，德國(guó)CNW公司)；超純反相C18填料(加拿大SiliCycle公司)；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。標(biāo)準(zhǔn)品：青霉素G(97.2%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司)；青霉二酸(99.3%)、去羧青霉噻唑酸(95.0%，德國(guó)LGC GmbH公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

以乙腈-水(1∶1，體積比)為溶劑分別配制500 mg/L青霉素G、1 000 mg/L青霉二酸和1 000 mg/L去羧青霉噻唑酸單標(biāo)儲(chǔ)備液，再分別移取適量單標(biāo)儲(chǔ)備液，以乙腈-水(1∶1)定容，配成質(zhì)量濃度均為100 mg/L的3種目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于棕色容量瓶?jī)?nèi)-50 ℃保存。測(cè)定時(shí)以乙腈-水(1∶1)逐級(jí)稀釋至所需濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取均質(zhì)的柑桔果皮、果肉及全果樣品5 g(精確至0.01 g)于50 mL具塞離心管中，加入10 mL 80%乙腈，渦旋混勻30 s后，超聲提取15 min，于4 ℃下以10 000 r/min離心5 min，將上清液倒入另一50 mL具塞離心管中。殘?jiān)屑尤?0 mL 80%乙腈，重復(fù)提取1次(果皮重復(fù)提取2次，最后1次加入9 mL提取劑)，合并提取液并用80%乙腈定容至25 mL(果皮定容至30 mL)。上述提取液經(jīng)渦旋混勻后，取2 mL轉(zhuǎn)移至裝有50 mg C18的離心管中渦旋2 min，3 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜后，待測(cè)定。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件Waters Acquity UPLC?HSS T3 色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)； 流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%甲酸溶液。梯度洗脫程序：0～6.0 min，5% ～60% A；6.0～8.0 min，60%～90% A；8.0～9.0 min，90%～5% A。流速0.25 mL/min；柱溫35 ℃；樣品室溫度20 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI)；正離子掃描；毛細(xì)管電壓3.5 kV；射頻透鏡電壓0.1 V；離子源溫度120 ℃；錐孔反吹氣流量50 L/h；脫溶劑氣溫度380 ℃；脫溶劑氣流量800 L/h；光電倍增器電壓650 V；碰撞氣體為氬氣，碰撞氣壓0.18 Pa；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)。其它質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 青霉素G及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters for penicillin G and its metabolites

*quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取劑的選擇用于青霉素類抗生素殘留分析的提取劑多為乙腈、水、乙腈-水溶液、甲醇以及磷酸鹽緩沖液等。由于甲醇含有羥基，會(huì)加速青霉素G降解為去羧青霉噻唑酸酯[8]，而磷酸鹽緩沖液不易揮發(fā)，會(huì)污染離子源，降低質(zhì)譜的檢測(cè)性能。因此，實(shí)驗(yàn)比較了不同比例乙腈水溶液的提取效果。結(jié)果顯示，純乙腈提取的回收率可滿足要求(>70%),但提取液顏色深，雜質(zhì)較多;隨著水的比例增加，提取液的顏色變淺，但青霉素G和去羧青霉噻唑酸的回收率逐漸降低；而用80%乙腈提取時(shí)，3種分析物的回收率均能達(dá)到75%，且色素提取相對(duì)較少。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇80%乙腈作為提取劑。

圖1 不同凈化方式對(duì)3種分析物提取率的影響Fig.1 Effects of clean-up method on recoveries of three analytes

2.1.2 提取劑體積的選擇以加標(biāo)水平為100 μg/kg的果皮為研究對(duì)象，考察了80%乙腈的體積(5、10、15 mL )對(duì)3種分析物提取效率的影響。結(jié)果表明，當(dāng)提取劑體積為5 mL時(shí)，3種分析物的回收率均較低，而提取劑體積為10 mL和15 mL時(shí)，回收率均能達(dá)到70%以上。但提取劑體積越大，稀釋倍數(shù)越高，方法的靈敏度會(huì)降低。綜合考慮，選用提取劑體積為10 mL。

2.1.3 提取次數(shù)的選擇考察了提取次數(shù)(1、2、3、4次)對(duì)分析物回收率的影響，結(jié)果表明，分析物的回收率隨著提取次數(shù)的增加而增大。對(duì)于果肉和全果，提取2次的效果與提取3次和4次無顯著差異;而果皮提取3次的效果與提取4次無顯著差異。因此，采用果肉、全果提取2次，果皮提取3次。

圖2 3種分析物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/L)的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of three analytes mixed standard solution(100 μg/L)

2.1.4 凈化方式的選擇目前，測(cè)定動(dòng)物性食品中青霉素類藥物殘留的常用凈化方法為固相萃取法(SPE)，所用小柱主要是HLB柱和C18柱；其次為分散固相萃取法(DSPE)，所用吸附劑主要是C18和PSA。因此，以加標(biāo)水平為100 μg/kg的果皮為研究對(duì)象，比較了SPE-HLB、SPE-C18、DSPE-C18、DSPE-PSA凈化方式的效果(圖1)。結(jié)果顯示，經(jīng)兩種SPE柱凈化后的樣品中雜質(zhì)較少，色譜圖無明顯干擾，但青霉素G的回收率均低于50%。這可能是由于青霉素G在洗脫至濃縮過程中發(fā)生降解，并且C18和HLB均為反相層析填料，目標(biāo)化合物的極性越大則在柱上的保留能力越弱，因此對(duì)于極性較強(qiáng)的青霉素G回收率偏低，這與文獻(xiàn)[14]研究結(jié)果相符。此外，SPE小柱成本較高，操作繁瑣，不適用于處理大批量樣品。而經(jīng)DSPE凈化后，3種分析物的回收率優(yōu)于SPE，因此采用DSPE凈化。采用PSA進(jìn)行DSPE凈化時(shí)青霉二酸的回收率低于60%，這可能與弱堿性的PSA會(huì)與酸性的青霉二酸發(fā)生作用有關(guān)；而采用C18進(jìn)行DSPE凈化得到的回收率較好，這是由于C18吸附劑的比表面積大、吸附能力強(qiáng)，可較好除去脂類、脂肪等非極性物質(zhì)的干擾。因此選用C18進(jìn)行DSPE凈化。

2.1.5 凈化劑用量的選擇以加標(biāo)水平為100 μg/kg的果皮為研究對(duì)象，分別考察了C18用量(0、25、50、75、100 mg)對(duì)3種分析物凈化效果的影響。結(jié)果表明，隨C18用量的增加，分析物的回收率整體呈先增加后降低的趨勢(shì)。C18用量為25 mg時(shí)的回收率最好，但凈化效果差于50 mg C18。其中C18用量對(duì)兩種代謝物的影響相對(duì)較小，兩者的回收率基本在80%以上；而對(duì)于青霉素G，當(dāng)C18用量超過50 mg時(shí)，其回收率大幅下降，這可能是由于過量的凈化劑會(huì)吸附青霉素G所致。因此，選擇凈化劑C18用量為50 mg。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化UPLC-MS/MS分析中多選擇甲醇或乙腈作有機(jī)相，由于甲醇會(huì)使青霉素G降解，且乙腈-水體系的峰形優(yōu)于甲醇-水體系[15]，故選擇乙腈為有機(jī)相。由于青霉素G及其代謝物在水溶液中以離子狀態(tài)存在，為增強(qiáng)分析物在色譜柱上的保留并提高離子化效率，在流動(dòng)相中加入甲酸或乙酸等揮發(fā)性酸。實(shí)驗(yàn)考察了在水相中分別添加0.05%、0.1%、0.15%和0.2%甲酸對(duì)儀器靈敏度和分離度的影響。結(jié)果顯示，甲酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)靈敏度的影響不大，但0.1%甲酸的效果略好，因此選擇乙腈-0.1%甲酸為流動(dòng)相。最優(yōu)色譜條件下各分析物的總離子流色譜圖見圖2，3種目標(biāo)分析物可在5 min內(nèi)有效分離。

2.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化將100 μg/L的青霉素G及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液采用單針自動(dòng)進(jìn)樣分析，在ESI+和ESI-離子化模式下進(jìn)行全掃描，確定電離方式和準(zhǔn)分子離子峰。結(jié)果顯示，ESI+模式下可產(chǎn)生穩(wěn)定的[M+H]+母離子，確定母離子并優(yōu)化去簇電壓后，再進(jìn)行子離子掃描。母離子進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜，發(fā)生斷裂或重排等碎裂反應(yīng)，產(chǎn)生不同的離子碎片，選擇響應(yīng)最高的離子為定量離子，響應(yīng)次高的離子為輔助定性離子，并優(yōu)化其碰撞能量。最后，將母離子和子離子組成離子對(duì)，在MRM模式下優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓和碰撞能量等參數(shù)，使分析物的離子對(duì)強(qiáng)度達(dá)到最大。優(yōu)化的質(zhì)譜條件如“1.4.2”所示。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effects，ME)是指共流出物影響分析物的離子化效率，使其分析信號(hào)增強(qiáng)或減弱的現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)考察了青霉素G及其代謝物在溶劑、柑桔果肉、全果及果皮基質(zhì)中的響應(yīng)情況(加標(biāo)水平為100 μg/kg)，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)(ME=基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)。由表2可知，除青霉二酸表現(xiàn)出輕微的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)外，其余兩種分析物均表現(xiàn)出基質(zhì)抑制效應(yīng)。本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校正基質(zhì)效應(yīng)的方法，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.4 線性范圍及檢出限

用空白柑桔樣品加入標(biāo)準(zhǔn)溶液配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化條件下進(jìn)行測(cè)定。由表2可知，在5～2 000 μg/L范圍內(nèi)，青霉素G及其代謝物的果肉、果皮和全果基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積(y)與對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度(x)間呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.998 1～0.999 7。以信噪比(S/N)≥3確定分析物的方法檢出限(LOD)，以滿足農(nóng)殘分析回收率要求的最低加標(biāo)濃度為方法定量下限(LOQ)，結(jié)果顯示，3種分析物的LOD為0.5～1 μg/kg，LOQ為5～10 μg/kg。以100 μg/L溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液在優(yōu)化條件下進(jìn)行測(cè)定，保留時(shí)間和峰面積的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.11%～0.24%和2.7%～3.8%(n=3)；日間RSD分別為0.12%～0.21%和3.7%～6.9%(n=3)。本方法靈敏度高，線性范圍寬，能夠滿足食品中青霉素G及其代謝物殘留的分析要求。

表2 青霉素G及其代謝物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r2)、基質(zhì)效應(yīng)、方法檢出限、定量下限和精密度Table 2 Linear ranges，correlation coefficients(r2)，matrix effects，limits of detection(LOD)，limits of quantitation(LOQ)and precisions for penicillin G and its metabolites

2.5 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

分別取全果、果皮和果肉的空白樣品進(jìn)行3個(gè)不同水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平做6個(gè)平行，按本方法進(jìn)行測(cè)定。由表3可知，3種分析物在柑桔果肉、果皮和全果中的平均回收率為76.7%～107%，RSD為1.3%～9.6%，回收率和精密度良好。

表3 不同基質(zhì)中3種分析物的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations(RSD) of three analytes in different matrix(n=6)

2.6 方法對(duì)比

對(duì)本方法與文獻(xiàn)方法進(jìn)行了對(duì)比。由表4可知，與文獻(xiàn)[2]相比，本方法由于在前處理階段未進(jìn)行氮吹濃縮導(dǎo)致LOD較高(稀釋了5～6倍)，但本方法對(duì)2種代謝物的回收率為83.6%～107%，而文獻(xiàn)中僅為50%～73%。此外，文獻(xiàn)中使用價(jià)格昂貴的同位素內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量，而本方法利用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，檢測(cè)成本較低。同時(shí)，本方法的前處理更簡(jiǎn)單，適合于大批量樣品處理。

表4 食品中青霉素G及其代謝物殘留的檢測(cè)方法對(duì)比Table 4 Comparison of detection methods for penicillin G and its metabolites in food

(續(xù)表4)

2.7 實(shí)際樣品的檢測(cè)

2017年7～10月在重慶北碚區(qū)進(jìn)行青霉素G田間殘留消解試驗(yàn)，噴施濃度為9 g/L，在噴藥后45 d內(nèi)分別對(duì)溫州蜜柑和紐荷爾臍橙進(jìn)行采樣并測(cè)定3種分析物的濃度。結(jié)果表明，青霉素G在柑桔中的降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，降解速率較快：在溫州蜜柑中的降解方程為Ct1=1 147.44e-0.309t(r2=0.866 6)，半衰期T1/2=2.3 d；在紐荷爾臍橙上為Ct2=1 396.17e-0.259t(r2=0.944 9)，T1/2=2.7 d。由圖3可知，青霉二酸在柑桔中快速降解，在10 d時(shí)含量降至10 μg/kg以下，而去羧青霉噻唑酸在柑桔中降解較為平緩，尤其在臍橙中的殘留量呈現(xiàn)先降低后增加，隨后波動(dòng)變化的趨勢(shì)，含量為200～400 μg/kg。研究表明[19]，青霉素G在檸檬基質(zhì)中5 d內(nèi)即降解完全，首先形成青霉二酸和少量的去羧青霉噻唑酸，隨后青霉二酸會(huì)緩慢轉(zhuǎn)化為青霉酸，最后青霉酸脫去CO2形成去羧青霉噻唑酸。因此，最終青霉素G的代謝物以去羧青霉噻唑酸為主，這與田間試驗(yàn)結(jié)果相符。

圖3 青霉素G及其代謝物在溫州蜜柑(A)與紐荷爾臍橙(B)上的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of penicillin G and its metabolites in Satsuma Mandarin(A)and Newhall Navel Orange(B)

3 結(jié) 論

本研究建立了柑桔中青霉素G及其兩種代謝物青霉二酸和去羧青霉噻唑酸殘留的DSPE/UPLC-MS/MS檢測(cè)方法。該方法操作簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性良好，檢測(cè)成本低，并成功應(yīng)用于田間殘留試驗(yàn)的實(shí)際樣品中青霉素G及其代謝物含量的檢測(cè)。