謝妍， 遲恒， 乜春城， 曹佐武

(1. 廣東省中醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科， 廣東 廣州 510006； 2. 暨南大學(xué) 發(fā)育與再生生物學(xué)系， 廣東 廣州 510632； 3. 哈勵遜國際和平醫(yī)院, 河北 衡水 053000)

透明帶(zona pellucida, ZP)是包裹在哺乳動物卵細胞外的一層糖蛋白外殼，在卵細胞發(fā)育和受精過程中起著重要的作用.小鼠透明帶由ZP1、ZP2、ZP3等糖蛋白組成，其中小鼠ZP3是第一精子受體， ZP2是精子的第二受體，小鼠ZP2、ZP3多肽分別由定位于7號、5號染色體上的單拷貝基因編碼[1-2].

起初的實驗研究顯示，透明帶是由卵母細胞唯一表達產(chǎn)生的[3-4]，但是后來對許多其他動物的研究發(fā)現(xiàn)顆粒細胞也參與透明帶的發(fā)生.有實驗顯示，包括狗[5]、猴[6-7]和兔[8]等其他哺乳動物，卵泡顆粒細胞參與表達透明帶.對于最常用的實驗動物小鼠的透明帶來源，目前的主流理論仍然認為，小鼠透明帶由卵母細胞唯一產(chǎn)生[9-10]，顆粒細胞不產(chǎn)生透明帶.本研究小組早期研究結(jié)果顯示，小鼠ZP2mRNA在卵泡顆粒細胞有較強的表達[11]，提示小鼠卵巢顆粒細胞也可能有ZP2蛋白表達.利用基因重組的小鼠ZP2肽段，制備抗ZP2的抗體[12]，本研究目的是利用小鼠ZP2 抗體探討小鼠卵巢顆粒細胞是否表達ZP2蛋白，以確定卵透明帶的生物發(fā)生來源.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

昆明小鼠(8～12周齡)購自廣東省醫(yī)用實驗動物場，正常山羊血清購自武漢谷歌生物科技有限公司，兔抗小鼠ZP2的多克隆抗體為自制，異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate isomer,FITC)標(biāo)記的羊抗兔IgG由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)，包埋劑OCT(optimal cutting temperature compound)購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)購自上?；瘜W(xué)試劑廠.

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠卵巢組織冰凍切片

快速處死正常昆明白雌鼠，冰上取卵巢組織，投入到新鮮配制的體積分?jǐn)?shù)為4%PFA溶液中，4 ℃固定2 h，然后轉(zhuǎn)入體積分?jǐn)?shù)為30%蔗糖溶液中，4 ℃冰箱中過夜.次日取已經(jīng)固定和脫水好的小鼠卵巢若干個，用包埋劑OCT包埋，按4 μm的厚度切片，依次貼片，切片在40 ℃烘箱中烤片過夜后存放于-80 ℃冰箱中.使用時先室溫解凍，然后在40 ℃烤片2 h以上.

1.2.2 小鼠卵巢組織冰凍切片免疫熒光實驗

取前后相鄰的兩張小鼠卵巢組織冰凍切片，1張作為實驗組，1張作為陰性對照組，各滴加封閉液孵育10 min.然后去除實驗組組織切片上的封閉液，滴加1∶100比例稀釋的兔抗小鼠ZP2的抗體，37 ℃下孵育2 h，對照組切片繼續(xù)在封閉液中孵育2 h.然后用TBS-Tween溶液(Tris-buffered saline-Tween 20 solution, TBST)洗滌兩組切片，每次5 min，共洗滌3次.再同時向兩張組織切片滴加1∶100比例稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，37 ℃下孵育30 min.用TBST洗滌3次后在熒光倒置顯微鏡下觀察，選定區(qū)域分別在白光和熒光下拍照，實驗組與對照組切片的對應(yīng)區(qū)域分別同時拍照，并選定相同條件和曝光時間拍攝熒光照片.隨后對免疫熒光實驗后的小鼠卵巢組織切片進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)復(fù)染，兩組切片的對應(yīng)位置拍照.

1.2.3 小鼠卵泡內(nèi)的顆粒細胞熒光信號灰度計算

參照HE照片，從實驗組與對照組的切片中選取對應(yīng)卵泡的顆粒細胞區(qū)進行熒光信號的灰度比較.使用Photoshop CS6軟件將HE照片與先前拍攝的白光照片疊合，從HE圖片中選擇合適的生長卵泡的顆粒細胞區(qū)，然后借助白光照片從相同位置的熒光照片上選取對應(yīng)的熒光圖像.同法在對應(yīng)的對照組切片的HE照片上選取對應(yīng)的顆粒細胞區(qū)，進一步在原先拍攝的對照組熒光圖片上選取相同面積的圖像，通過Image J軟件計算對應(yīng)的對照組和實驗組的熒光圖像的灰度值.通過Image J軟件計算分別從7張實驗組與對照組的卵巢切片中獲得的45組不同卵泡區(qū)域的顆粒細胞片區(qū)的數(shù)據(jù)進行比較.

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 抗小鼠ZP2抗體與小鼠卵巢透明帶的結(jié)合

通過免疫熒光實驗，檢測到卵透明帶信號，并驗證兔抗小鼠ZP2抗體對小鼠卵泡透明帶的特異反應(yīng)以及ZP2在卵巢切片上的定位(圖1).相鄰兩張卵巢切片的對應(yīng)區(qū)域的卵泡結(jié)構(gòu)，經(jīng)過HE染色后顯示出卵細胞和顆粒細胞，分別進行免疫熒光標(biāo)記后實驗組卵巢切片顯示特異的免疫熒光信號，形態(tài)上與卵透明帶區(qū)對應(yīng).結(jié)果表明兔抗小鼠ZP2抗體成功標(biāo)記了小鼠卵泡透明帶的ZP2成分.

A：實驗組卵巢切片的HE染色照片;B：實驗組卵巢切片的熒光照片;C：對照組卵巢切片的HE染色照片;D：對照組卵巢切片的熒光照片.比例尺: 100 μm.

A: HE staining photograph of ovarian section of test group; B: Fluorescent photograph of ovarian section of test group; C: HE staining photograph of ovarian section of control group; D: Fluorescent photograph of ovarian section of control group. Scale bar: 100 μm.

圖1 抗mZP2抗體與卵巢切片的免疫熒光反應(yīng)

Fig.1 Fluorescent immuno-reaction of ovarian sections with antibody against mZP2

2.2 卵巢組織的顆粒細胞區(qū)ZP2信號的表達

實驗組或?qū)φ战M切片，除卵透明帶區(qū)外的其他卵泡區(qū)域，都看不出明顯的信號(圖1).但是，當(dāng)在高倍鏡下觀察，并逐步增大熒光曝光度時，發(fā)現(xiàn)在卵泡顆粒細胞區(qū)也出現(xiàn)弱熒光信號.而且當(dāng)增強曝光度時，對照組也可看見一定的熒光信號，不過兩組的信號強度有差異(圖2).

為區(qū)分真實信號與背景信號，在實驗組與對照組卵巢切片中，從HE片中分別挑選出一一對應(yīng)的生長卵泡，隨機選取對應(yīng)顆粒細胞區(qū)，再轉(zhuǎn)移到對應(yīng)的免疫熒光照片中選取面積相同的(25×25像素)對應(yīng)區(qū)，進行灰度計算(圖3).

隨機從7張卵巢切片中選取45組顆粒細胞區(qū)，分別計算其灰度值，結(jié)果顯示(表1)，實驗組顆粒細胞區(qū)的灰度平均值為(1.88±0.57)，對照組的灰度平均值為(1.20±0.11).用GraphPad Prism7軟件進行配對樣本t檢驗，兩組間有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.000 1).實驗組卵泡內(nèi)的顆粒

A：實驗組卵巢切片1區(qū)的免疫熒光圖;B：對照組卵巢切片對應(yīng)1區(qū)的免疫熒光照片;C：實驗組卵巢切片2區(qū)的免疫熒光圖;D：對照組卵巢切片對應(yīng)2區(qū)的免疫熒光照片;E：實驗組卵巢切片3區(qū)的免疫熒光圖;F：對照組卵巢切片對應(yīng)3區(qū)的免疫熒光照片;G：實驗組卵巢切片4區(qū)的免疫熒光圖;H：對照組卵巢切片對應(yīng)4區(qū)的免疫熒光照片.同一區(qū)的實驗組和對照組的曝光量相同，比例尺: 50 μm.

A: Fluorescent photograph of zone 1 on the ovarian section of test group. B: Fluorescent photograph of zone 1 on the ovarian section of control group.C: Fluorescent photograph of zone 2 on the ovarian section of test group. D: Fluorescent photograph of zone 2 on the ovarian section of control group.E: Fluorescent photograph of zone 3 on the ovarian section of test group. F: Fluorescent photograph of zone 3 on the ovarian section of control group.G: Fluorescent photograph of zone 4 on the ovarian section of test group. H: Fluorescent photograph of zone 4 on the ovarian section of control group.Identical exposure is applied to the test group and control group of the same zone.Scale bar: 50 μm.

圖2 實驗組和對照組的小鼠卵巢切片的免疫熒光增強圖

Fig.2 The highlighted fluorescent photographs of mouse ovarian sections following immunohistochemical assay

A和B分別是免疫熒光標(biāo)記后的卵巢切片相同區(qū)域的白光照片和熒光照片，C:免疫熒光實驗后進行HE復(fù)染后對應(yīng)區(qū)拍攝的照片，D:按照卵泡結(jié)構(gòu)將A、B、C疊合的復(fù)合圖片，E:按照在HE照片上選取的顆粒細胞區(qū)域在對應(yīng)的熒光照片上選取圖像進行灰度計算.

White Light photograph (A) & Fluorescent photograph (B) of the same field on the ovarian sections following fluorescent immuno-histochemical assay. HE staining photograph (C) of the corresponding field of the ovarian section after fluorescent immunohistochemical assay. Merged picture (D) on the same field of A, B, C based on the follicle location. Sampling for gray value calculation(E) on the field of the fluorescent photograph layer of the merged picture, corresponding to the pre-selected granulosa cell zone of the HE staining photograph.

圖3 灰度計算取樣圖

Fig.3 The flow chart of sampling for the gray value calculation

表1 實驗組和對照組的熒光照片對應(yīng)的顆粒細胞區(qū)的熒光信號灰度值

Table 1 The gray values of fluorescent signals in the granulosa cell zones of the fluorescent photographs of test group and control group

分組視野個數(shù)灰度值實驗組451.88±0.57對照組451.20±0.11

細胞區(qū)的熒光信號強于對照組的卵泡顆粒細胞內(nèi)的背景熒光信號，兩組數(shù)據(jù)平均值的差值為0.68，實驗組的灰度值比對照組的灰度值高56.67%，說明卵泡顆粒細胞表達了ZP2蛋白.根據(jù)所得的數(shù)據(jù)分析，實驗組與對照組的卵泡內(nèi)背景信號確實存在差異，也提示卵泡內(nèi)的顆粒細胞存在ZP2蛋白的表達.

3 討論

透明帶是生長卵泡產(chǎn)生的一層細胞外殼，對卵細胞和早期胚胎都有重要作用，因此一直受到特別關(guān)注.近年的生殖醫(yī)學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)，透明帶的表達還可作為卵細胞受精能力的一個預(yù)測指標(biāo)[13].而透明帶基因的突變與女性的卵泡發(fā)育和人類的生育能力有關(guān)[14-16].因此了解卵透明帶的產(chǎn)生有重要的意義.

早期的研究發(fā)現(xiàn)，卵細胞能產(chǎn)生透明帶[17-19]，即使培養(yǎng)沒有卵泡細胞的裸卵也能形成透明帶.而通過常規(guī)的影像觀察和透明帶蛋白電泳分析，看不到卵巢顆粒細胞有明顯的透明帶成分，因此認為，小鼠卵透明帶是卵細胞唯一產(chǎn)生的.但是卵透明帶是細胞內(nèi)的蛋白產(chǎn)物分泌到細胞外不斷堆積形成的一個突出的結(jié)構(gòu)，因此研究它的形成需要進行細致的量化分析和動態(tài)思考.本研究用兔抗小鼠ZP2抗體進行小鼠卵巢切片的免疫熒光反應(yīng)，可顯示卵巢切片的透明帶區(qū)有明顯的熒光信號，提示成功標(biāo)記小鼠卵泡透明帶的ZP2成分，但通常肉眼很難辨認顆粒細胞區(qū)的熒光信號，因此，按照常規(guī)的影像觀察可能判斷顆粒細胞沒有透明帶蛋白.但如果逐步調(diào)高曝光度，當(dāng)增強至適當(dāng)高時，顆粒細胞區(qū)也可顯示出信號，只不過強度比透明帶區(qū)弱許多.為了區(qū)分陽性信號與背景信號，隨機測量對照組和實驗組對應(yīng)區(qū)的灰度，通過對不同區(qū)域的灰度進行統(tǒng)計分析后可以發(fā)現(xiàn)實驗組顆粒細胞區(qū)的信號比對照組的信號強，顯示出實驗組與對照組的信號強度的差距.實驗組的平均灰度值比對照組的灰度值高56.67%，證明卵泡內(nèi)的顆粒細胞表達了ZP2蛋白，顆粒細胞不僅轉(zhuǎn)錄ZP2的mRNA，這些mRNA也能合成出蛋白質(zhì)，說明顆粒細胞也是透明帶的發(fā)源地.

但與通常觀察到透明帶區(qū)信號相比，顆粒細胞區(qū)的熒光信號還是非常弱，顆粒細胞中表達的ZP2是否是透明帶成分的主要來源？基因分析顯示，透明帶的各種成分，ZP1、ZP2、ZP3均為分泌性蛋白[2]，因此表達后將被分泌到細胞外.此外，顆粒細胞體積小、核質(zhì)比大，細胞質(zhì)含量少，細胞中邊產(chǎn)生邊轉(zhuǎn)運透明帶蛋白至胞外，留存于顆粒細胞里的透明帶蛋白也較少.不過，卵泡里顆粒細胞的數(shù)量較多，產(chǎn)生的透明帶蛋白不斷轉(zhuǎn)移至卵細胞外的透明帶區(qū)堆積，構(gòu)建卵細胞與顆粒細胞之間的外殼結(jié)構(gòu).

經(jīng)典理論認為透明帶是卵母細胞唯一表達[3-4]，但實際上通常在卵細胞內(nèi)所觀察到的熒光信號也較弱.因為卵細胞產(chǎn)生的透明帶蛋白也被轉(zhuǎn)運到胞外，但由于卵母細胞體積很大、是顆粒細胞的幾百倍，核質(zhì)比很小，細胞質(zhì)含量很高，因此卵細胞中的透明帶蛋白比顆粒細胞中的含量要多，顯示的熒光信號也往往更強.

透明帶的形成是隨著卵泡發(fā)育不斷積累的.顆粒細胞也隨卵泡的生長不斷分裂增生、數(shù)量劇增.之前的研究顯示，顆粒細胞中表達的ZP2的mRNA也隨卵泡生長增加[9]，因此，隨著卵泡生長、顆粒細胞數(shù)量增多，表達產(chǎn)生的透明帶蛋白也不斷增多.卵泡生長后期的透明帶是否更多來源于顆粒細胞，還有待進一步研究.

綜上，小鼠透明帶ZP2并非卵母細胞唯一表達產(chǎn)生，小鼠卵泡顆粒細胞和卵母細胞都參與了透明帶的生物合成.